陳佳茜，郭廣洋，譚新杰，呂淑芳，胥華偉，原 夢(mèng)，鄧 萍，侯典云*

?藥材與資源?

連翹多胺氧化酶基因家族的鑒定及干旱和鹽脅迫下的表達(dá)分析

陳佳茜1, 2，郭廣洋1, 2，譚新杰1, 2，呂淑芳1, 2，胥華偉1, 2，原 夢(mèng)1, 2，鄧 萍1, 2，侯典云1, 2*

1. 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023 2. 河南省藥食兼用資源評(píng)價(jià)與創(chuàng)新利用工程研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023

研究連翹多胺氧化酶（polyamine oxidase，）基因家族在鹽和干旱脅迫下的響應(yīng)特征。通過分析連翹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出5個(gè)連翹基因家族成員，結(jié)合蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和基序分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、結(jié)構(gòu)域等方式進(jìn)行相關(guān)性分析，并探究了鹽和干旱脅迫下基因的表達(dá)水平。連翹基因家族氨基酸數(shù)介于235～541 aa，相對(duì)分子質(zhì)量在26 069～59 328，等電點(diǎn)在5.27～5.86；不穩(wěn)定系數(shù)為35.68～44.14，總平均親水性皆為負(fù)值，推測(cè)連翹PAO家族蛋白均為不穩(wěn)定型、酸性、親水性蛋白，α-螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲為蛋白主要二級(jí)結(jié)構(gòu)形式。鑒定出的5個(gè)連翹基因家族成員均具有特異性表達(dá)模式；在鹽和干旱脅迫下5個(gè)連翹基因家族成員的表達(dá)均受到誘導(dǎo)，可能參與連翹的鹽脅迫及干旱脅迫響應(yīng)調(diào)控，為深入探討連翹基因家族的功能奠定了基礎(chǔ)。

連翹；基因家族；基因表達(dá)；脅迫；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

多胺（polyamines，PAs）是小分子質(zhì)量的脂肪胺，存在于植物細(xì)胞中參與各種生物過程[1]。PAs主要包括腐胺（Put）、亞精胺（Spd）和精胺（Spm）3種。PAs與逆境脅迫及衰老有關(guān)的植物激素脫落酸（ABA）和乙烯（ETH）關(guān)系密切，在調(diào)控生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老等方面發(fā)揮重要作用外，還參與對(duì)各種生物和非生物脅迫耐受功能的響應(yīng)[2]，在提高植物抗逆性、維持植物生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有重要作用[3]。研究表明，多胺含量的變化可能是植物提高脅迫條件下耐受性的方式之一[4]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，多胺除合成代謝外，還會(huì)通過氧化方式維持植物體內(nèi)的多胺平衡。其中，經(jīng)多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）途徑分解多胺是最常見方式之一[5]。大部分的PAOs以多胺為底物，催化生成更小分子多胺，以及1分子氨基醛和H2O2[6]，進(jìn)而維持植物細(xì)胞體內(nèi)的多胺的穩(wěn)定，提高植物抗生物脅迫及非生物脅迫的能力[7]。

當(dāng)受到非生物因素脅迫時(shí)，植物表型及生理生化會(huì)發(fā)生變化，也會(huì)通過改變自身基因序列的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。PAOs先后在水稻[8]、擬南芥[9]和其他植物中發(fā)現(xiàn)具有多胺分解代謝、植物發(fā)育和非生物脅迫耐受性的作用[10]。目前已從煙草[11]、玉米[12]、甜橙[13]、番茄[14]和大麥[15]等植物中鑒定分離出了一系列編碼PAO的基因，并研究了在一定非脅迫條件下的基因家族成員的響應(yīng)。

連翹(Thunb.) Vahl為木犀科連翹屬落葉灌木，多產(chǎn)于我國(guó)河南、河北、山東、陜西、山西等地區(qū)[16]，多以干燥果實(shí)入藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱等功效[17]。據(jù)報(bào)道，連翹生產(chǎn)極易受干旱、鹽堿地等影響[18-19]，導(dǎo)致產(chǎn)量不佳。目前，關(guān)于連翹非生物脅迫研究主要集中在不同品種之間的比較[19-20]，抗脅迫相關(guān)基因的研究較少，對(duì)連翹基因家族信息的全面分析鮮有報(bào)道。

本研究以連翹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選鑒定連翹基因家族成員，并對(duì)該家族成員進(jìn)行了理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、保守基序、以及鹽和干旱脅迫下的表達(dá)水平等分析研究，為進(jìn)一步研究連翹基因家族的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

研究所用連翹葉片及果實(shí)采自河南洛陽(yáng)市宜陽(yáng)縣連翹種植基地，由河南科技大學(xué)侯典云教授鑒定為連翹(Thunb.) Vahl。連翹愈傷組織材料為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 儀器

JJ223BC型電子天平（精度0.001 mg，雙杰測(cè)試儀器公司）、5415R型低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 公司）、JY04S-3D型凝膠成像分析系統(tǒng)（君意電泳公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Lightcycler96，Roche公司，瑞士）等。多糖多酚植物RNA提取試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自南京諾維贊生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 愈傷組織脅迫處理

在愈傷組織生長(zhǎng)7周左右時(shí)，在基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加200 mmol/L NaCl作為鹽脅迫處理，添加400 mmol/L甘露醇作為干旱處理，分別在在不同時(shí)間（1、3、5、7、10 d）進(jìn)行取材，液氮冷凍，?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 基于轉(zhuǎn)錄組的連翹PAO基因家族的篩選與鑒定

從連翹轉(zhuǎn)錄組序列中篩選獲得基因家族相關(guān)序列，使用ORF Finder（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析預(yù)測(cè)基因序列的開放閱讀框（open reading frame，ORF），獲得連翹基因家族相關(guān)基因序列全長(zhǎng)，本研究所用到的擬南芥基因組注釋信息和基因組序列信息來(lái)自于擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（https://www.arabidopsis.org/）中下載PAO家族蛋白序列；從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// ricedata.cn/gene/）中下載水稻PAO家族蛋白序列。將初步獲得的連翹PAO蛋白序列通過結(jié)構(gòu)域在線分析軟件SMART（http://smart.embl.de/）對(duì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

2.3 連翹PAO家族蛋白理化性質(zhì)及保守基序分析

利用在線分析工具Expasy ProtParam tool （https://web.expasy.org/protparam/）分析連翹PAO家族蛋白的理化性質(zhì)。利用SOPMA和signa IP 5.0在線分析對(duì)家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征和蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線分析工具The MEME （https:// meme-suite.org/meme/tools/meme）在線分析連翹PAO家族蛋白的基序，并進(jìn)行可視化分析。

2.4 連翹PAO家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

通過NCBI在線查詢相關(guān)植物PAO家族蛋白序列，并使用軟件MEGA 7.0對(duì)篩選出的連翹PAO家族與其進(jìn)行多重序列比對(duì)，基于比對(duì)結(jié)果，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.5 熒光定量PCR分析

使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取連翹葉片、果實(shí)、愈傷組織以及脅迫處理后不同時(shí)間的愈傷組織的RNA，按照qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物（表1），內(nèi)參基因?yàn)?，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix對(duì)以上提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。熒光定量PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、10 s；退火60 ℃、30 s；40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系20 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA為1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。

表1 qRT-PCR引物

3 結(jié)果與分析

3.1 連翹PAO基因家族成員鑒定

基于連翹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選獲得21條連翹基因家族相關(guān)序列，使用ORF Finder在線分析網(wǎng)站獲得連翹基因家族氨基酸序列全長(zhǎng)，并與擬南芥及水稻基因家族序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，將初步獲得的連翹PAO家族蛋白序列通過結(jié)構(gòu)域在線分析軟件SMART對(duì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，通過篩選，最終鑒定到5個(gè)基因家族成員，依次命名為～。通過對(duì)連翹PAO家族蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)連翹PAO家族均含有Pfam Amino_oxidase的完整結(jié)構(gòu)域。

對(duì)篩選出的連翹PAO家族進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析（表2），結(jié)果表明連翹PAO家族編碼蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)介于235～541 aa，預(yù)測(cè)得到的理論相對(duì)分子質(zhì)量為26 069～59 328，等電點(diǎn)在5.27～5.86；不穩(wěn)定系數(shù)為35.68～44.14，推測(cè)連翹PAO家族均為不穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性皆為負(fù)值，推測(cè)連翹PAO家族蛋白均為酸性、親水性蛋白。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，連翹PAO家族蛋白均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和自由延伸鏈，其中α-螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲類別占比較高，其為PAO蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)形式。

圖1 連翹PAO家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域

表2 連翹PAO基因家族蛋白理化性質(zhì)分析

3.2 連翹PAO家族的蛋白保守基序分析

對(duì)連翹PAO家族中的保守Motif進(jìn)行分析預(yù)測(cè)結(jié)果表明（圖2），連翹PAO家族中含有8個(gè)保守Motif，每個(gè)成員含有的Motif有所相同，F(xiàn)sPAO2、FsPAO3、FsPAO4含有相同的Motif。FsPAO1及FsPAO5含有相同的Motif，但它們所含有的Motif位置不同，這些差異可能揭示這些蛋白功能的多樣性，并且說(shuō)明了連翹基因家族的蛋白序列是相對(duì)保守的。

圖2 連翹PAO家族成員保守基序分析

3.3 連翹PAO家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

為探索不同植物PAO家族蛋白間的進(jìn)化關(guān)系，通過NCBI將連翹PAO家族蛋白質(zhì)序列與擬南芥、水稻、玉米、番茄、甜橙PAO家族蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列對(duì)比，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），通過對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析，并結(jié)合“2.2”項(xiàng)中的蛋白保守基序分析結(jié)果，可將連翹PAO家族分為3類：連翹FsPAO1與擬南芥AtPAO1相近，隸屬于亞家族I，連翹FsPAO2、FsPAO3、FsPAO4與擬南芥AtPAO2、AtPAO3、AtPAO4相近且具有相似Motif，歸類于同一分區(qū)，屬于亞家族Ⅲ一類，連翹FsPAO5與甜橙CsPAO1、CsPAO2以及擬南芥AtPAO5相近，劃分于亞家族II。

3.4 連翹PAO基因家族成員在連翹不同組織器官中的表達(dá)

為了探究連翹基因家族成員在不同組織中的表達(dá)情況，利用熒光定量PCR測(cè)定了連翹在連翹葉片、果實(shí)以及愈傷組織中的轉(zhuǎn)錄水平（圖4），在果實(shí)、葉片、愈傷組織中的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異（＜0.05）。結(jié)果顯示，連翹基因家族在葉片、果實(shí)以及愈傷組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量不盡相同。相比較下，在連翹愈傷組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于在葉片中的表達(dá)；在連翹果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較高，在葉片及愈傷組織中的相對(duì)表達(dá)量相近；在連翹果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為愈傷組織，均高于在葉片中的表達(dá)；在連翹果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于葉片中的表達(dá)，在愈傷組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于在葉片中的表達(dá)；在連翹果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于在葉片及愈傷組織中的表達(dá)。

圖3 連翹PAO家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3.5 連翹PAO基因家族成員在鹽脅迫下的表達(dá)

為探究鹽脅迫處理下連翹基因家族成員的表達(dá)情況，對(duì)不同處理時(shí)間的愈傷組織進(jìn)行了基因表達(dá)分析（圖5）。其中，在NaCl處理后1 d后的相對(duì)表達(dá)量迅速上升到最大值，達(dá)到15倍以上，并在處理3 d后急速下降，在愈傷組織適應(yīng)脅迫條件后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；在NaCl處理后的表達(dá)水平下調(diào)，并在處理7 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量回調(diào)，并有上升趨勢(shì)；在NaCl處理1 d后相對(duì)表達(dá)量明顯下降，并在7 d后開始逐漸上升；在NaCl處理1d后相對(duì)表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加而逐漸上升；在NaCl處理1 d后相對(duì)表達(dá)量開始上升，并在處理5 d后達(dá)到最大值，相對(duì)表達(dá)量上升3.5倍，在處理7 d后相對(duì)表達(dá)量下降；結(jié)果表明，連翹PAO基因家族成員在鹽脅迫條件下均受到誘導(dǎo)，但處理時(shí)間的不同，具有不同的響應(yīng)效果。

圖4 連翹PAO基因家族成員在不同組織的相對(duì)表達(dá)量

與處理0 d比較，*P < 0.05, **P <0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1，下圖同。

3.6 連翹PAO基因家族成員在干旱脅迫下的表達(dá)

根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果分析（圖6），在干旱脅迫條件下，表現(xiàn)出相同的表達(dá)水平趨勢(shì)，在處理3 d后約為7倍之多，但相比較下對(duì)于鹽脅迫的響應(yīng)更為顯著。在干旱脅迫條件下，在處理5 d后相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，表明在鹽脅迫以及干旱脅迫條件下的響應(yīng)可能有所不同。在干旱脅迫條件下，在處理5d后相對(duì)表達(dá)量上升，而后下降，相比較下，對(duì)于鹽脅迫的響應(yīng)更為明顯。相似的，在干旱脅迫條件下的相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)為隨著處理時(shí)間的增加而逐漸上升，表明可能對(duì)于鹽脅迫和干旱脅迫都具有響應(yīng)效果。在干旱脅迫條件下，相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果為先上升后下降之后上升，在處理10 d時(shí)達(dá)到最大值，表明對(duì)于鹽脅迫和干旱脅迫都做出響應(yīng)，但響應(yīng)效果有所不同。這些結(jié)果表明，連翹基因家族成員在干旱脅迫下的相對(duì)表達(dá)量均有變化，隨處理時(shí)間的增加，具有不同的響應(yīng)效果。

圖6 在干旱脅迫條件下連翹PAO基因家族成員的

4 討論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到各種生物和非生物脅迫的影響，在受到非生物脅迫時(shí)，調(diào)節(jié)自身基因適應(yīng)環(huán)境也是主要方法之一。在水稻[21]中，在種子萌發(fā)期的表達(dá)水平增高會(huì)通過增加了PAO酶活性，維持ROS穩(wěn)態(tài)，影響Na+含量，從而提高水稻耐鹽性。在玉米[22]中，干旱條件下基因家族表達(dá)可能提高光合光反應(yīng)效率和整體耐受性。在辣椒[23]中，和在擬南芥中的過表達(dá)通過改變轉(zhuǎn)基因植物的生理和分子水平來(lái)提高其對(duì)低溫脅迫的耐受性。在大豆[24]中過表達(dá)也會(huì)提高大豆的耐鹽性，提高種子發(fā)芽率。在棉花[25]中，基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在響應(yīng)干旱脅迫的順式作用元件，轉(zhuǎn)入擬南芥中降低了擬南芥幼苗的抗旱能力。

本研究中，從轉(zhuǎn)錄組中篩選出21條相關(guān)基因家族成員，通過生物信息學(xué)分析，最終得到5條PAO蛋白，植物中的PAO通常分為4個(gè)亞家族[8, 26-27]，本研究中生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，連翹5個(gè)PAO蛋白分為3個(gè)亞家族，而沒有屬于亞家族IV的成員。理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系、家族分類、蛋白保守基序均顯示出屬于同一亞家族的成員具有相似的特征，不同亞家族的成員之間表現(xiàn)為多樣性，這可能與連翹基因家族的進(jìn)化密切相關(guān)。

基因表達(dá)結(jié)果顯示在不同器官和組織中的表達(dá)具有差異性，有報(bào)道證明番茄基因家族在不同組織中的表達(dá)同樣具有差異性[14]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，有在葉片、果實(shí)和愈傷組織中均有表達(dá)。在果實(shí)中有較高的表達(dá)水平，在愈傷組織中有較高的表達(dá)水平，推測(cè)基因家族的組織表達(dá)多樣性與功能多樣性之間可能具有一定的相關(guān)性。

為進(jìn)一步探究連翹基因家族對(duì)鹽脅迫以及干旱脅迫下的響應(yīng)模式，本試驗(yàn)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組篩選結(jié)果對(duì)鹽脅迫及干旱脅迫下的連翹基因家族成員的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在200 mmol/L NaCl處理下，、、表達(dá)顯著上調(diào)，與棉花[28]中基因的先上升后下降結(jié)果類似，、表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明基因家族成員對(duì)鹽脅迫也能產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。在400 mmol/L甘露醇處理后，表達(dá)均表現(xiàn)為顯著上調(diào)，與相關(guān)報(bào)道中[29]逆境處理后PAO活性先上升后下降的趨勢(shì)相同。這些結(jié)果與之前關(guān)于PAO提高抗旱機(jī)制的報(bào)告一致[30]，由此可見，連翹基因家族成員均受到鹽脅迫和干旱脅迫影響，推測(cè)它們可能參與到鹽脅迫及干旱脅迫的響應(yīng)過程，但這些基因的分子調(diào)控機(jī)制及潛在功能還需進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，本研究從連翹基因組中分析出了5個(gè)基因家族，分類分析和組織表達(dá)分析顯示出其可能的生化和生理功能多樣性，在鹽脅迫和干旱脅迫響應(yīng)中表現(xiàn)出不同的逆境脅迫相關(guān)性，為后續(xù)這些基因的功能鑒定提供了重要參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification and expression analysis ofgene family under salt and drought stress

CHEN Jiaxi1, 2, GUO Guangyang1, 2, TAN Xinjie1, 2, LV Shufang1, 2, XU Huawei1, 2, YUAN Meng1, 2, DENG Ping1, 2, HOU Dianyun1, 2

1. College of Agriculture,, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China 2. Henan Engineering Research Center for Evaluation and Innovative Utilization of Homology of Medicine and Food, Luoyang 471023, China

To study the response characteristics of Lianqiao ()polyamine oxidase () gene family under salt and drought stress.Five members of thegene family were identified by analyzing thetranscriptome data. The correlation analysis was carried out by means of protein physical and chemical properties and motif analysis, protein structure analysis, phylogenetic analysis, and structural domains. The gene expression levels were analyzed under salt and drought stress.The amino acid number of thegene family ranged from 235 to 541 aa; The molecular weight from 26 069 to 59 328; The isoelectric point ranged from 5.27 to 5.86; The instability coefficients from 35.68 to 44.14, and the total average hydrophilicity was negative, so it was hypothesized that all the proteins of thegene family were unstable, acidic, hydrophilic proteins, with α-Helix and irregular coil being the main secondary structural forms of PAO proteins.The five identified members of thegene family had specific expression patterns, and salt stress and drought stress induced the expression of the five members of thegene family, which might be involved in the regulation ofin response to salt stress and drought stress. Through this study lays a foundation for in-depth exploration of the function of thegene family.

(Thunb.) Vahl;gene family; gene expression; stress; protein structure analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2024)09 - 3077 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.021

2023-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1404829）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目“名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設(shè)項(xiàng)目”（2060302）；河南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（202102110156）；河南省科技攻關(guān)（242102110325）；河南省中藥材產(chǎn)業(yè)科技特派員服務(wù)團(tuán)、河南省中藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助

陳佳茜（1999—），碩士研究生，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究。E-mail: chenjiaxi0120@163.com

通信作者：侯典云（1975—），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物資源評(píng)價(jià)與利用研究。Tel: (0379)64282340 E-mail: dianyun518@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]