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基于生物信息學(xué)方法探究白癜風(fēng)鐵死亡相關(guān)發(fā)病機制和潛在治療藥物篩選

2024-05-14 00:50劉祥冉李治建阿卜杜熱伊木阿力木江魏文婧霍仕霞
現(xiàn)代藥物與臨床 2024年4期
關(guān)鍵詞:甲素黑素細胞趨化因子

劉祥冉,李治建, ,阿卜杜熱伊木·阿力木江,魏文婧,霍仕霞

1.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011

2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830049

3.新疆中藥醫(yī)院制劑循證與轉(zhuǎn)化重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830049

白癜風(fēng)是一種自身免疫性皮膚色素脫失性疾病,主要臨床表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)局限性白色斑塊。據(jù)統(tǒng)計,白癜風(fēng)患病率占全球人口的0.5%~2%[1]。大多數(shù)研究認為白癜風(fēng)發(fā)病主要與自身免疫[2]、氧化應(yīng)激[3]、局部炎癥及角質(zhì)形成細胞功能異常[4]有關(guān)。盡管目前的研究結(jié)果對白癜風(fēng)的發(fā)病機制提供了部分見解,但確切機制仍需進一步證實。

鐵死亡的主要機制是鐵和脂質(zhì)活性氧(L-ROS)的積累以及一組特定基因的參與導(dǎo)致的鐵相關(guān)性程序性細胞死亡[5]。谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)是鐵死亡的關(guān)鍵因子[6]。GPX4 活性下降,氧化脂質(zhì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)。這種氧自由基可增強細胞的氧化損傷,誘導(dǎo)細胞死亡[7]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是白癜風(fēng)發(fā)病的觸發(fā)因素,而ROS 過度積聚是激活氧化應(yīng)激的主要原因[8]。氧化應(yīng)激中細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可觸發(fā)一種稱為未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的細胞反應(yīng),UPR 可引起ROS 誘導(dǎo)的CXC 趨化因子配體16(CXCL16)活性增加,CXCL16 是白癜風(fēng)中細胞毒性T 細胞遷移所必需的趨化因子[9]。此外,ROS 可直接誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞分泌三磷酸腺苷也可引發(fā)半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)介導(dǎo)的黑素細胞死亡,也可誘導(dǎo)黑素細胞附近的角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生CXCL9/10,從而招募CD8+T 細胞在局部組織浸潤產(chǎn)生細胞殺傷作用[10]。故鐵死亡、ROS 生成和氧化應(yīng)激可能與白癜風(fēng)患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)功能有密切聯(lián)系。在皮膚組織中,多種原因(包括鐵死亡)導(dǎo)致ROS 的過量產(chǎn)生所引起的氧化應(yīng)激,能夠激活γ 干擾素(IFN-γ)-CXCL9/CXCL10-CXCR3 軸、CXCL16-CXCR6 軸和高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)-核因子-κB(NF-κB)p65/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)-CXCL8 軸導(dǎo)致下游的免疫細胞功能紊亂,使皮膚中免疫穩(wěn)態(tài)失衡,導(dǎo)致白癜風(fēng)的發(fā)病[9,11-13]。所以推測通過鐵死亡途徑治療白癜風(fēng)的根本機制是使白癜風(fēng)患者免疫系統(tǒng)趨向穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)功能異常的免疫細胞發(fā)揮正常的免疫功能。

雷公藤是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物,具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[14]。雷公藤作為皮膚科常用藥,臨床可用于治療慢性蕁麻疹、皮肌炎和銀屑病等[15]。雷公藤甲素是雷公藤中主要活性成分之一,可抑制多種炎性介質(zhì)和淋巴細胞增殖,具有很好的抗炎和抑制免疫活性作用[16]。相關(guān)研究報道雷公藤甲素對角質(zhì)形成細胞有明顯的抑制作用,并且研究進一步證實雷公藤甲素能有效抑制角質(zhì)形成細胞中IFN-γ 響應(yīng)性Janus 激酶(JAK)/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)信號通路的表達[17]。白癜風(fēng)相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)IFN-γ 刺激角質(zhì)形成細胞,細胞內(nèi)JAK/STAT 信號激活使細胞分泌大量的CXCL9/10,從而招募黑素細胞特異性CD8+T 細胞聚集產(chǎn)生殺傷黑素細胞的作用,在此過程中角質(zhì)形成細胞具有極其關(guān)鍵的作用,所以抑制角質(zhì)形成細胞可能是雷公藤甲素治療白癜風(fēng)的潛在機制[18]。本研究利用生物信息學(xué)[19]方法尋找與白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展相關(guān)的高質(zhì)量鐵死亡基因及相關(guān)的免疫信號機制,并通過高通量篩選獲得雷公藤甲素作為潛在治療藥物,旨在為白癜風(fēng)的發(fā)病機制研究及治療策略提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

使用R 語言GEOquery 包[20]從高通量基因表達(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫中獲取原始數(shù)據(jù)集GSE53146(GPL14951)作為分析的實驗集(包括5 位白癜風(fēng)患者、5 位健康志愿者);GSE75819(GPL6884)數(shù)據(jù)集作為關(guān)鍵基因外部驗證集(包括15 位白癜風(fēng)患者、15 位健康志愿者);GSE203262(GPL20301)數(shù)據(jù)集作為單細胞評估分析集(包括6 位白癜風(fēng)患者、6 位健康志愿者)。此外,本工作中獲取的鐵死亡基因(FRGs)是基于FerrDB 數(shù)據(jù)庫中Driver、Suppressor、Marker 模塊獲得鐵死亡相關(guān)基因。

1.2 差異表達基因篩選

獲取數(shù)據(jù)集中原始表達矩陣后,通過Normalize Between Arrays 校正除去批次效應(yīng),并通過R 軟件limma 包[21]分析白癜風(fēng)患者皮膚及健康對照皮膚之間的差異表達基因(DEGs),將|log2FC|>1,P<0.05作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 篩選白癜風(fēng)鐵死亡關(guān)鍵基因

在R 語言中使用ggvenn 包獲得DEGs 與FRGs交集基因作為白癜風(fēng)鐵死亡差異表達基因(FRDEGs)。利用glmnet 包[22],采用最小絕對收縮選擇算子(LASSO)來減少數(shù)據(jù)維度。同時獲取LASSO算法預(yù)測的基因[23]。利用kernlab 包[24]構(gòu)建支持向量機遞歸特征消除(SVM-RFE)模型,并使用平均誤判率與10 倍交叉驗證進行比較[25],篩選模型預(yù)測基因。2 種算法所得基因取交集即白癜風(fēng)鐵死亡關(guān)鍵基因(也是通過鐵死亡途徑治療白癜風(fēng)的關(guān)鍵靶點)。使用pROC 包繪制受試者工作特征(ROC)曲線,并確定曲線下面積(AUC)值,以評估本研究選擇的標(biāo)記基因是否具有診斷價值。另外,本研究還利用circlize 包[26]用來分析關(guān)鍵基因之間的相互作用關(guān)系。

1.4 單細胞聚類分析及關(guān)鍵基因驗證

此部分基于GSE203262 數(shù)據(jù)集進行。該數(shù)據(jù)集涵蓋6 個白癜風(fēng)和6 個正常樣本。在本研究中使用Seurat R 包[27]進行質(zhì)量控制。細胞剔除的標(biāo)準(zhǔn)為(1)RNA 計數(shù)<50,(2)線粒體基因表達率<5%,利用Seurat 中的Normalize Data 函數(shù)對數(shù)據(jù)進行規(guī)范化。在后期分析中,選擇了15 個最顯著的主成分和2 000 個最顯著的可變基因。使用Seurat 的Find Clusters 函數(shù)(分辨率=0.5)檢測細胞簇,并采用2Dt 分布隨機嵌入(tSNE)顯示[28]。本研究采用Single R 包,將不同簇中的細胞與帶注釋的參考數(shù)據(jù)集進行比較[29]。根據(jù)識別的細胞標(biāo)記和比較結(jié)果完成細胞類型的聚類標(biāo)注。利用HPA 數(shù)據(jù)庫進一步驗證關(guān)鍵基因在正常皮膚組織細胞群中的表達,表達水平顯示為4 種類型:未檢測到、低、中、高。染色細胞的比例(<25%、25%~75%、>75%)和染色強度(陰性、弱、中等、強)構(gòu)成了評分系統(tǒng)。

1.5 免疫細胞相關(guān)性分析

白癜風(fēng)病灶內(nèi)免疫微環(huán)境對疾病發(fā)生發(fā)展具有十分重要的作用。ssGSEA 方法是使用23 個免疫細胞基因集構(gòu)建的。本研究中通過R 軟件GSVA 包中ssGSEA 方法評估關(guān)鍵基因免疫細胞浸潤特征[30]。

1.6 小分子化合物的篩選

在cMAP 數(shù)據(jù)庫中(https://clue.io/query)篩選通過鐵死亡途徑治療白癜風(fēng)的潛在小分子化合物。將關(guān)鍵靶點分別上傳至cMAP 數(shù)據(jù)庫,通過數(shù)據(jù)庫高通量分析,篩選出對其具有潛在作用的小分子化合物。按照高通量篩選得分由底到高排列,刪去無歸類的小分子,選取前30 個化合物作為后續(xù)研究的主要對象。

1.7 分子對接

利用分子對接初步驗證化合物與潛在靶點結(jié)合,結(jié)合能<0 kcal/mol 說明配體分子與受體蛋白可以自發(fā)結(jié)合。在本研究中,通過PDB 數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)[31]下載靶點蛋白的3D 結(jié)構(gòu),在AutoDockTools 1.5.7 軟件中處理后保存為PDBQT格式[32]。通過PubChem 下載小分子化合物的3D 結(jié)構(gòu)式,以同樣的方式處理后保存為PDBQT 格式[33]。將上述2 個結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入到AutoDockTools 1.5.7 中進行對接并計算結(jié)合能,使用OpenBabel 軟件[34]將對接結(jié)果的PDBQT 格式轉(zhuǎn)換為PDB 格式,隨后使用PyMOL 軟件將對接結(jié)果可視化。

1.8 關(guān)鍵基因的GSEA-京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

利用 R 語言 GSEA 包分析關(guān)鍵基因與GSE53146 數(shù)據(jù)集中其他基因之間的相關(guān)性。將所有基因根據(jù)其相關(guān)性從高到低排序,作為用來測試的基因集。同時將KEGG 信號通路集作為預(yù)定義集調(diào)用,以檢測關(guān)鍵基因在信號通路集中的富集。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

在本研究中使用Wilcoxon 秩和檢驗進行兩組之間的比較。采用Spearman 相關(guān)性分析23 個白癜風(fēng)鐵死亡基因之間的關(guān)系,Cytoscape 用于ceRNA網(wǎng)絡(luò)可視化。

2 結(jié)果

2.1 獲取差異表達基因及鐵死亡基因

將GSE53146 矯正后進行差異表達基因分析(圖1A、1B),共獲得706 個DEGs,其中包括412個上調(diào)基因和294 個下調(diào)基因,DEGs 熱圖及火山圖如圖1C、D 所示。在FerrDB 數(shù)據(jù)庫中獲取3 個模塊相關(guān)數(shù)據(jù),匯總?cè)ブ睾蠊驳玫?58 個鐵死亡標(biāo)志物。

圖1 GEO 數(shù)據(jù)集處理與差異表達基因分析Fig.1 GEO dataset processing and differential expression gene analysis

2.2 白癜風(fēng)鐵死亡關(guān)鍵基因的篩選

將706 個DEGs 對458 個FRGs 進行映射,篩選出23 個FR-DEGs(圖2A)。FR-DEGs 之間的Spearman 相關(guān)性如圖2B 所示。箱線圖展現(xiàn)了白癜風(fēng)患者大多數(shù)FR-DEGs 表達水平較健康人高(P<0.05、0.01,圖2C)。獲得FR-DEGs 后,利用LASSO算法篩選出6 個基因(圖3A),利用SVM-RFE 篩選出18 個基因(圖3B),取交集得核糖核苷二磷酸還原酶亞基M2(RRM2)、組織蛋白酶B(CTSB)、OTU 去泛素化酶 1(OTUB1)、α-突觸核蛋白(SNCA)、脂質(zhì)運載蛋白2(LCN2)、人含WW 域轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白1(WWTR1)6 個關(guān)鍵基因(圖3C)。如圖3D 所示關(guān)鍵基因間具有較高相關(guān)性。關(guān)鍵基因的ROC 曲線說明,OTUB1和WWTR1在6 個特征基因中具有最高的AUC 值(AUC=0.960)。RRM2、CTSB、SNCA、LCN2的AUC 值分別為0.920、0.840、0.800、0.920(圖3E)。以上結(jié)果表明,在白癜風(fēng)患者和健康人之間6 個特征基因都具有較好的鑒別價值。

圖2 鐵死亡基因的篩選及表達分析Fig.2 Screening and expression analysis of ferroptosis genes

圖3 關(guān)鍵基因的篩選與分析Fig.3 Screening and analysis of key genes

2.3 關(guān)鍵基因的外部數(shù)據(jù)集驗證

在GSE75819 驗證集中,WWTR1 在兩組之間表達無顯著差異,RRM2、CTSB、OTUB1、SNCA、LCN2 基因的表達趨勢與實驗集中完全一致且差異具有顯著性。與健康人組相比,白癜風(fēng)患者的RRM2、LCN2、OTUB1、CTSB 表達水平升高(P<0.01、0.001),而SCNA水平下降(P<0.05),見圖4。由于WWTR1在驗證集中基因表達無差異,故在后面的分析中只針對有差異的5 個關(guān)鍵基因。

圖4 關(guān)鍵基因在驗證集中的差異分析Fig.4 Differential analysis of key genes in the validation set

2.4 關(guān)鍵基因在白癜風(fēng)相關(guān)細胞群中表達

使用Seurat 函數(shù)分析了數(shù)據(jù)集GSE203262,并依據(jù)質(zhì)量控制條件(nFeature_RNA>200 &nFeature_RNA<2 500 &percent.mt<5)從數(shù)據(jù)集中篩選33 694 個細胞,細胞主成分分析如圖5A 所示。這些細胞被分類為9 種主要細胞類型,包括NK 細胞、朗格漢斯細胞、黑素細胞、B 細胞、血小板、樹突狀細胞、角質(zhì)形成細胞和CD8+T 細胞(圖5B)。隨后在各細胞類型中對CTSB、LCN2、OTUB1、RRM2和SNCA基因進行富集標(biāo)注。結(jié)果顯示,白癜風(fēng)患者皮膚樣本中關(guān)鍵基因主要在成纖維細胞,角質(zhì)形成細胞、黑素細胞和朗格漢斯細胞中。其中OTUB1在各種細胞中均被標(biāo)注,說明其在白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展過程中具有重要影響。此外,CTSB主要在成纖維細胞中標(biāo)注。LCN2標(biāo)注較弱幾乎無表達。RRM2主要標(biāo)注在CD8+T 細胞中,且富集結(jié)果具有高度特異性。成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞、黑素細胞和朗格漢斯細胞與SNCA高度相關(guān)(圖5C)。

圖5 關(guān)鍵基因在白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)細胞群中的表達情況Fig.5 Immunoinfiltration assessment of key genes in the single cell data set

2.5 關(guān)鍵基因蛋白表達驗證

在HPA 數(shù)據(jù)庫中,對關(guān)鍵基因蛋白在正常人類皮膚細胞群(主要發(fā)現(xiàn)成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞、朗格漢斯細胞和黑素細胞)中的表達分析發(fā)現(xiàn),CTSB、OTUB1在皮膚組織中表達最強,各細胞均能檢測到而且細胞比例較高。LCN2與RRM2幾乎檢測不到。而SNCA很特殊,其只在黑素細胞中表達水平高,染色強度強并且細胞占比均為75%~25%,見圖6。

圖6 在HPA 數(shù)據(jù)庫中驗證關(guān)鍵基因的蛋白表達情況Fig.6 Validation of protein expression of key genes in the HPA database

2.6 關(guān)鍵基因的免疫細胞相關(guān)性

關(guān)鍵基因與白癜風(fēng)病灶微環(huán)境23 個免疫細胞Spearman 相關(guān)性分析表明CTSB 與gamma delta T細胞和活化的樹突狀細胞呈顯著正相關(guān)(圖7A)。LCN2 與Th1 型輔助T 細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、活化的CD8 T 細胞及肥大細胞呈顯著正相關(guān)(圖7B)。OTUB1 與自然殺傷細胞、活化的CD8 T細胞、活化的CD4 T 細胞、Th1 型輔助T 細胞、CD56+自然殺傷細胞、巨噬細胞及肥大細胞呈顯著正相關(guān)(圖7C)。RRM2 與活化的CD4 T 細胞、嗜酸性粒細胞、自然殺傷細胞及髓系抑制性細胞呈顯著正相關(guān),與效應(yīng)性記憶CD4 T 細胞呈顯著負相關(guān)(圖7D)。此外,SNCA 是唯一一個與中性粒細胞具有相關(guān)性也是唯一一個幾乎與所有的免疫細胞呈負相關(guān)的基因(圖7E)。

圖7 關(guān)鍵基因與免疫細胞的相關(guān)性分析Fig.7 Analysis of the correlation between key genes and immune cells infiltration

2.7 關(guān)鍵基因的潛在信號通路富集

通過對關(guān)鍵基因進行單基因GSEA-KEGG通路富集分析(圖8),發(fā)現(xiàn)這些基因主要涉及黏附分子、趨化因子、免疫反應(yīng)(趨化因子及其受體相互作用、ECM-受體相互作用和Th17 細胞分化)、細菌或病毒感染(沙門菌感染、結(jié)核桿菌感染、流感病毒和趨化因子與病毒蛋白相互作用)和各種疾病途徑(阿爾茲海默病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肌萎縮側(cè)索硬化和人類Ⅰ型白血?。?。此外,關(guān)鍵基因也富集在趨化因子信號通路、機體代謝信號通路、NOD 樣受體信號通路和T 細胞受體信號通路。同時,還發(fā)現(xiàn)趨化因子-趨化因子相互作用通路與CTSB、RRM2、SNCA3 個基因密切相關(guān)。同樣,LCN2和OTUB12 個基因都與代謝通路密切相關(guān),說明趨化因子相互作用及機體代謝在白癜風(fēng)的發(fā)病及雷公藤甲素治療中具有重要作用。

圖8 關(guān)鍵基因CTSB、LCN2、OTUB1、RRM2 和SNCA 的GSEA-KEGG 分析Fig.8 GSEA-KEGG analysis of the key genes CTSB,LCN2,OTUB1,RRM2 and SNCA

2.8 篩選通過鐵死亡途徑治療白癜風(fēng)的潛在藥物

在cMAP 數(shù)據(jù)庫篩選的潛在藥物中,將得分(norm_cs)<-1 的化合物作為候選化合物,在排名前30 位的成分中,選取具有明確化學(xué)結(jié)構(gòu)式的雷公藤甲素[35](相對分子質(zhì)量360.4,分子式C20H24O6)作為潛在藥物,結(jié)構(gòu)見圖9。

圖9 雷公藤甲素的藥物結(jié)構(gòu)Fig.9 Pharmacological structure of triptolide

2.9 雷公藤甲素與潛在靶點分子對接驗證

潛在靶點CTSB(PDB:8b5f)、LCN2(PDB:3bx8)、OTUB1(PDB:4dhi)、RRM2(PDB:3bs9)和SNCA(PDB:4bxl)與雷公藤甲素(PubChem CID:107985)的分子對接結(jié)果如表1、圖10 所示。結(jié)合能越低,配體與受體結(jié)合的構(gòu)象就越穩(wěn)定,產(chǎn)生作用的可能性就越大[36]。通過分子對接結(jié)果可以看出,雷公藤甲素對5 個潛在核心靶點的結(jié)合能力較強,從而提示其有望通過鐵死亡途徑治療白癜風(fēng)相關(guān)疾病。

表1 雷公藤甲素與潛在靶點的分子對接Table 1 Molecular docking information for triptolide and potential targets

圖10 雷公藤甲素與潛在靶點的分子對接示意圖Fig.10 Schematic diagram of molecular docking of triptolide with potential targets

3 討論

鐵死亡為鐵依賴性脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致機體氧化還原失衡所介導(dǎo)的細胞死亡模式。在白癜風(fēng)的研究中,與健康人組相比白癜風(fēng)患者的血清中檢測到花生四烯酸降低,這可能增加白癜風(fēng)局部被CD8+T 細胞浸潤及破壞黑素細胞的風(fēng)險[37]。另外,鐵死亡關(guān)鍵因子GPX4 在白癜風(fēng)患者皮膚中表達降低,但在健康人組皮膚的各個表皮層中表現(xiàn)出高表達[38],這可能是白癜風(fēng)局部鐵死亡敏感性高和抗氧化能力弱的主要原因。然而,關(guān)于鐵死亡在白癜風(fēng)發(fā)病中是否占據(jù)著重要地位,研究甚少。

本研究共篩選了CTSB、LCN2、OTUB1、RRM2、SNCA5 個鐵死亡基因進行一系列分析。其中RRM2是核糖核苷酸還原酶的催化亞基,它在增殖、遷移和血管生成等細胞過程中起重要作用[39-40]。研究表明,RRM2 的過表達激活NF-κB 通路并增加了胰腺癌細胞、乳腺癌細胞的侵襲、遷移[41-42]。而NF-κB通路也參與白癜風(fēng)的發(fā)病,研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 信號激活可促進白細胞介素(IL)-15、CXCL10 和IL-1β的分泌,進而促進CD8+T 細胞的活化和誘導(dǎo)白癜風(fēng)的適應(yīng)性免疫。此外,表皮中過量的CXCL10 在CD8+T 細胞的招募及黑素細胞殺傷中起關(guān)鍵性作用[43]。LCN2 是一種糖蛋白,可通過激活炎癥途徑或調(diào)節(jié)細胞鐵穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)細胞反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),MPTP 中毒而引發(fā)的帕金森綜合征小鼠模型中鐵的積累使星形膠質(zhì)細胞分泌LCN2 增加導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元變性[44]。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)在星形膠質(zhì)細胞中NF-κB 信號的激活,能夠調(diào)節(jié)LCN2 分泌和LCN2誘導(dǎo)腦中風(fēng)的鐵死亡[45]。因此,推測在白癜風(fēng)病變中鐵死亡基因RRM2上調(diào)導(dǎo)致NF-κB 信號被激活,CXCL10 與IL-1β 釋放增多,招募CD8+T 免疫細胞局部浸潤從而殺傷黑素細胞,同時NF-κB 信號激活也使LCN2 上調(diào)并誘導(dǎo)病變局部鐵死亡,一方面使黑素細胞死亡,另一方面進一步增強RRM2的表達。

OTUB1 是一種去泛素化酶,影響細胞代謝、分化、增殖和凋亡,被稱為是免疫細胞活性和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑[46]。在以往研究中發(fā)現(xiàn),OTUB1 在多發(fā)性硬化癥、支氣管哮喘、肺癌、食管癌等多種疾病中有重要免疫調(diào)節(jié)作用[47-48];在多發(fā)性硬化癥中,OTUB1 直接抑制STAT1mRNA 產(chǎn)生,還可以通過穩(wěn)定SOCS1間接抑制IFN-γ誘導(dǎo)的JAK/STAT1信號傳導(dǎo)[49]。在體外實驗中,OTUB1 缺乏能增加IFN-γ 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞趨化因子(CXCL10、CXCL11、CCL2)和促炎分子(NOS2)的產(chǎn)生[50]。在白癜風(fēng)研究中,IFN-γ 激活成纖維細胞中JAK/STAT1 通路使趨化因子CXCL9/10 分泌是CD8+T 免疫細胞在黑素細胞周圍募集并殺傷細胞的關(guān)鍵一環(huán)[51]。在本研究中發(fā)現(xiàn),白癜風(fēng)病變皮膚中OTUB1 表達上調(diào),可能是機體產(chǎn)生的免疫保護作用。OTUB1 上調(diào)抑制JAK/STAT1 信號傳導(dǎo),抑制CXCL9/10 產(chǎn)生的免疫細胞招募能力,減少CD8+T 在病變局部的浸潤,從而避免黑素細胞的死亡。

關(guān)鍵基因GSEA-KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn),趨化因子相互作用通路和NOD 樣受體信號通路與關(guān)鍵基因密切相關(guān)。趨化因子是由多種免疫細胞分泌的重要的炎癥介質(zhì),其可以招募CD8+T 免疫細胞在黑素細胞周圍募集,從而殺傷細胞使黑色素產(chǎn)生障礙[52]。NOD 樣受體是細胞內(nèi)受體,可以激活各種相關(guān)途徑,以增加促炎細胞因子(如IFN-γ、IL-1、IL-6 和TNF)的產(chǎn)生。細胞因子的產(chǎn)生能增加免疫細胞反應(yīng)并激活非特異免疫系統(tǒng)[53]。

Connectivity Map(cMAP)數(shù)據(jù)庫是由哈佛、劍橋大學(xué)和麻省理工學(xué)院研究人員通過不同干擾物(包括小分子)處理人類細胞后檢測基因表達差異所構(gòu)建的生物應(yīng)用數(shù)據(jù)庫。研究團隊認為以基因表達譜建立的基因與藥物的關(guān)聯(lián)性,可協(xié)助研究者快速利用基因表達數(shù)據(jù)比對出與基因高相關(guān)性的藥物、并推論出藥物分子的主要結(jié)構(gòu)。本研究基于“新機制-老藥”研究思路,通過cMAP 數(shù)據(jù)庫篩選出影響5 個潛在靶點的潛在藥物。分子對接結(jié)果表明,雷公藤甲素對5 個潛在靶點的結(jié)合較強,說明該小分子與篩選出的鐵死亡相關(guān)靶點和通路之間存在高度關(guān)聯(lián)性,其有望成為通過鐵死亡途徑治療白癜風(fēng)藥物。目前相關(guān)研究也表明,雷公藤甲素在皮膚病與自身免疫性疾病的治療方面具有很大潛力[53-54]。

白癜風(fēng)發(fā)病機制復(fù)雜且不明確,導(dǎo)致對其治愈十分困難,因此闡明白癜風(fēng)的發(fā)病機制對其根治尤為重要。本研究采用生物信息學(xué)方法從鐵死亡的角度篩選了白癜風(fēng)發(fā)病的5 個關(guān)鍵基因,并采用多種數(shù)據(jù)評估了5 個鐵死亡基因與病變部位細胞群潛在聯(lián)系,所得結(jié)果可靠性強。除此之外,還篩選雷公藤甲素作為鐵死亡途徑治療白癜風(fēng)小分子藥物。所采用的“新機制-老藥”研究思路,不僅可以大大降低藥物研發(fā)中因不良反應(yīng)所導(dǎo)致的失敗,也為臨床上老藥的重新應(yīng)用提供了新的方向。本研究為白癜風(fēng)的發(fā)病及治療研究提供了新的視角,適合在其他疾病研究中推廣,通過新的機制與老藥的結(jié)合研究,將會為臨床更快地研發(fā)治療疑難疾病的藥物提供參考方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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