賴政煬 陸冬萍 符靖雯 翁健 方禧 朱凱業(yè)

基金項目：惠州市科技計劃項目（2022CQ010019）。

作者簡介：賴政煬（1994—），男，廣東深圳人，本科，工程師。研究方向：食品安全分析檢測。

通信作者：符靖雯（1985—），女，廣東惠州人，本科，高級工程師。研究方向：食品檢測，重金屬污染治理。E-mail：149002195@qq.com。

摘 要：通過單因素和響應面試驗對硒的提取條件進行優(yōu)化，建立了電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定大米中的總硒的方法。結果表明，在提取硝酸體積5 mL、微波消解最高溫度為160 ℃、微波消解功率為1 000 W、趕酸溫度為135 ℃條件下，硒的提取效率最高。經(jīng)準確度與精密度驗證，該方法測定結果可靠。

關鍵詞：響應面法；電感耦合等離子體質(zhì)譜法；微波消解；硒

Response Surface Methodology Optimization for Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination of Total Selenium in Rice

LAI Zhengyang， LU Dongping， FU Jingwen*， WENG Jian， FANG Xi， ZHU Kaiye

（Huizhou Agricultural Product Quality and Safety Supervision and Testing Center， Huizhou 516000， China）

Abstract： The selenium extraction conditions were optimized through single factor and response surface experiments， and a method for the determination of total selenium in rice by inductively coupled plasma mass spectrometry was established. The results showed that under the conditions of extracting 5 mL nitric acid volume， microwave digestion at a maximum temperature of 160 ℃， microwave digestion power of 1 000 W， and acid driving temperature of 135 ℃， the extraction efficiency of selenium was the highest. After verification of accuracy and precision， the measurement results of this method are reliable.

Keywords： response surface methodology; inductively coupled plasma mass spectrometry; microwave digestion; selenium

硒（Se）是人類生長發(fā)育必不可少的一種微量元素，具有多種生物學功能，如清除體內(nèi)自由基、提高機體免疫力、提高抗氧化水平等，可有效預防癌癥[1-2]。人體內(nèi)無法自行合成硒，必須通過食物攝入。雖然谷物中的平均硒含量與動物源性食物相比較低，考慮到谷物作為主食在亞洲地區(qū)具有主導地位，因此富硒大米是亞洲人補硒的良好載體。常用的硒含量檢測方法有原子吸收光譜法[3]、原子熒光光譜法[4]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[5]、電感耦合等離子體質(zhì)譜（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，ICP-MS）法[6]等。目前農(nóng)作物中硒含量的測定主要依據(jù)《食品安全國家標準 食品中硒的測定》（GB 5009.93—2017）。

本研究在國家標準GB 5009.93—2017的基礎上，利用微波消解具有污染小、時間短、準確度高等優(yōu)點，對大米中硒提取進行條件優(yōu)化。以硝酸用量、微波消解最高溫度、微波消解功率、趕酸溫度為研究因素，通過單因素試驗設計，測定加標回收率，確定各個因素的影響水平，進一步通過Box-Behnken設計結合響應面分析法[7]，優(yōu)化出最佳提取條件。用數(shù)據(jù)模型為農(nóng)產(chǎn)品痕量硒的測定提供有力支撐，進一步做好農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全保障工作。

1 材料與方法

1.1 儀器

350X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，鉑金埃爾默股份有限公司；MASTER 40微波消解儀，上海新儀微波化學科技有限公司；DS-360石墨消解儀，廣州格丹納儀器有限公司；純Mili-Q A10水儀，美國Millipore公司；BSA224S分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限；碾谷機，佛山市順德區(qū)歐雅西電器有限公司；DFY-800搖擺式高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司。

1.2 試劑

濃硝酸（分析純），默克化工技術（上海）有限公司；硒元素標準溶液物質(zhì)，國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

參照《食品安全國家標準 食品中硒測定的方法》（GB 5009.93—2017）中總硒的測定方法，準確稱取0.2 g的樣品于消解內(nèi)罐中，加入一定體積的硝酸，靜置1 h，旋緊罐蓋，依照微波消解儀標準操作步驟（表1），設計消解程序進行消解。冷卻后取出，于電熱板上100 ℃趕酸30 min，定容至刻度線，待測上機。試驗樣品為空白普通大米粉，加入適量濃度的硒標準溶液，使加標濃度為0.4 mg·kg-1。

1.3.2 儀器條件

射頻功率：1 350 W；等離子體氣：氬氣，流量為16.0 L·min-1；載氣：氬氣，流量為0.92 L·min-1；輔助氣：氬氣，流量為1.2 L·min-1；定量離子：Se m/z為78；檢測模式：He碰撞模式；Ni采樣錐、Ni截取錐、Ni超級截取錐。

1.3.3 硒標準曲線配制

取100 mg·L-1的硒標準儲備液0.1 mL于100 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，制成濃度為100 μg·L-1的硒標準中間液。準確量取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、

2.5 mL、5.0 mL和10.0 mL硒標準中間液于50 mL容量瓶中，用硝酸（2%）溶液定容至刻度，混合均勻，配制成含硒濃度分別為0 μg·L-1、1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1和20.0 μg·L-1的系列標準溶液。

1.3.4 單因素試驗

（1）硝酸體積。準確稱取空白大米0.2 g，加入硒標準中間液80 μL，渦旋混勻，放置一夜。在微波消解最高溫度為115 ℃，微波消解功率為1 200 W，趕酸溫度100 ℃的條件下，考察硝酸體積（1 mL、

2 mL、3 mL、4 mL、5 mL和7 mL）對硒提取效率的影響。

（2）微波消解最高溫度。準確稱取空白大米

0.2 g，加入硒標準中間液80 μL，渦旋混勻，放置一夜。在硝酸體積為5 mL，微波消解功率為1 200 W，趕酸溫度100 ℃的條件下，考察微波消解最高溫度

（100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃和180 ℃）對硒提取效率的影響。

（3）微波功率。準確稱取空白大米0.2 g，加入硒標準中間液80 μL，渦旋混勻，放置一夜。在硝酸體積為5 mL，微波消解最高溫度為115 ℃，趕酸溫度100 ℃的條件下，考察微波功率（600 W、

800 W、1 000 W、1 200 W和1 500 W）對硒提取效率的影響。

（4）趕酸溫度。準確稱取空白大米0.2 g，加入硒標準中間液80 μL，渦旋混勻，放置一夜。在硝酸體積為5 mL，微波消解最高溫度為115 ℃，微波消解功率為1 200 W的條件下，考察趕酸溫度（115 ℃、125 ℃、135 ℃、145 ℃和155 ℃）對硒提取效率的影響。

1.3.5 響應面試驗

為獲得最佳的參數(shù)指標，在單因素試驗的基礎上，以回收率為指標，利用3因素3水平響應面分析法對微波消解最高溫度（A）、微波消解功率（B）、趕酸溫度（C）進行優(yōu)化（表2）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用Design-Expert 13.0軟件設計本次試驗方案，通過對其數(shù)學模型的回歸方差分析和顯著性檢驗進行數(shù)據(jù)分析并得出結論。

1.5 測定3種質(zhì)控樣的總硒含量

運用響應面試驗得出的最優(yōu)前處理條件，對

3種不同基質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)控樣進行總硒含量分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 硝酸體積對加標回收率的影響

硝酸體積加標回收率的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著提取體系內(nèi)硝酸濃度的增大，提取效率不斷提高，硝酸體積為5 mL時提取效率達到峰值，隨后趨向平緩。提取體系內(nèi)硝酸濃度過低會導致消解不完全，使測定結果偏低。提取體系內(nèi)硝酸濃度過高時，酸的強揮發(fā)性不僅損害儀器，還會給人體和環(huán)境帶來一定的危害。綜合考慮提取效率和成本，選取硝酸體積5 mL搭建本次試驗的微波消解體系。

2.1.2 微波消解最高溫度對加標回收率的影響

微波消解最高溫度對加標回收率的影響如圖2所示。由圖2可知，微波消解最高溫度越高，加標回收率越高。這是因為在微波消解過程中，微波加熱試劑的同時，增壓迫使酸試劑和樣品充分接觸并最終迅速溶解樣品，所以溫度越高，消解越完全。然而，溫度過高會對消解罐造成較大的壓力，壓力主要來源于以下幾個方面。①大米本身是碳水化合物，含有碳、氫、氧3種元素，在消解過程中會產(chǎn)生大量的CO2氣體。②消解使用的硝酸會被還原產(chǎn)生NO2氣體。③試劑及水在加熱升溫過程中也會產(chǎn)生一定的水蒸氣。3種氣體產(chǎn)生的臨界溫度不同，因此在消解反應中，當溫度升高到特定值時，密閉反應體系內(nèi)壓力會迅速增加，輕則會影響元素的穩(wěn)定性，重則會造成消解罐爆罐，造成安全問題。因此，基于消解效果和實驗室安全，微波消解的最高溫度為160 ℃，此時達到消解效率與安全雙平衡。

2.1.3 微波功率對加標回收率的影響

微波功率對加標回收率的影響如圖3所示。由圖3可知，當消解功率為600～1 000 W時，對消解效果的影響較大，隨后趨于平緩。這是因為微波功率直接影響消解溫度，進而影響消解效果。微波功率高會加快升溫速率，保證微波消解儀能快速達到設定的溫度并保持穩(wěn)定，從而使樣品消解完全。微波消解功率在600～800 W時，低功率使得在設定的時間內(nèi)無法升至設定的溫度，且保溫時間較短，導致樣品消解不完全。當微波功率升至1 000 W以上時，可在設定的時間內(nèi)升至設定的溫度并保持穩(wěn)定，樣品能夠完全消解。但過高的功率不僅會對微波消解儀和消解罐造成損壞，還可能造成樣品消解速率過快，使消解罐內(nèi)壓力迅速增高，有爆炸的風險，觸發(fā)安全裝置自動放氣泄壓，導致微量元素損失。因此，綜合考慮消解效果和實驗室安全，選取微波功率1 000 W搭建本次試驗的微波消解體系。

2.1.4 趕酸溫度對加標回收率的影響

趕酸溫度對加標回收率的影響如圖4所示。由圖4可知，當趕酸溫度為115～145 ℃時，硒元素的加標回收率先增大后趨于穩(wěn)定，在145 ℃時達到最大值。這是因為ICP-MS要求酸的濃度低于2%，酸濃度過高，黏度過大，影響霧化效果，從而影響信號強度。趕酸一般控制在1 mL左右，太干會導致待測元素損失嚴重，導致酸濃度過高從而抑制目標元素，腐蝕儀器部件，背景噪聲大，導致檢測結果不準確。趕酸溫度低于135 ℃時，3 h內(nèi)不能將試液中的硝酸趕至1 mL。在溫度為145 ℃時，趕酸時間控制在3 h內(nèi)，回收率最高。因此，基于消解效果和時間效率，應將趕酸溫度控制在145 ℃以下。

2.2 響應面試驗

2.2.1 試驗結果

響應面試驗結果見表3。

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗

利用軟件Design Expert 13.0對表3試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合數(shù)據(jù)分析，得到硒提取回收率（R）對微波消解最高溫度（A）、微波消解功率（B）、趕酸溫度（C）的二次多項回歸模型為R=94.6-1.35A-1.2B-0.65C-0.275AB+0.975AC-0.625BC-15.26A2-6.11B2-7.91C2。

對回歸方程進行方差分析（表4），模型P＜0.000 1，

說明該模型具有統(tǒng)計學意義。不同條件對回收率影響大小順序為A＞B＞C，即微波消解最高溫度＞微波功率＞趕酸溫度。模型的決定系數(shù)R2為0.994 4，

說明該方程擬合情況好，模型具有高顯著性；R2Adj=

0.987 2代表試驗有98.72%響應值變異，與預測相關系數(shù)R2Pred相對接近，說明該數(shù)據(jù)模型較為符合真實數(shù)據(jù)情況，試驗誤差小，具備實際指導意義，可用該模型對最優(yōu)提取條件進行分析和預測。

2.2.3 響應面及最優(yōu)條件確定

根據(jù)Design Expert 13.0軟件運行結果，最優(yōu)提取條件為微波消解最高溫度160.88 ℃、微波功率981 W、趕酸溫度134.6 ℃，在此條件下模型預測的最大加標回收率是94.7%。結合實際參數(shù)設置，將提取條件優(yōu)化為微波消解最高溫度160 ℃、微波功率

1 000 W、趕酸溫度135 ℃，在此條件下，經(jīng)過5次加標驗證試驗，得到的實測值平均為0.383 6 mg·kg-1，與實際添加相對誤差小于5.0%，回收率為95.9%，比預測稍高，說明通過該數(shù)據(jù)統(tǒng)計模型優(yōu)化得到的提取條件具有提取效率高、真實可靠等特點，且具有實際應用價值。

2.3 硒標準曲線繪制

根據(jù)優(yōu)化的提取條件，將硒標準溶液配制成不同濃度梯度進行上機檢測，得出標準曲線方程y=80.163x，相關系數(shù)R2=0.999 8。

2.4 方法的準確度

2.4.1 回收率及精密度

在富硒大米和普通大米中分別加入一定量硒標準溶液，使樣品的硒含量分別為0.05 mg·kg-1、

0.1 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1，每個樣品平行測定6次，考察其回收率及精密度，見表5。

由表5可知，普通大米的加標回收率為92.0%～

97.4%，相對標準偏差在2.9%～4.9%。富硒大米的加標回收率為88.0%～97.0%，相對標準偏差在2.5%～4.2%。說明本方法準確度較好，重復性較好，準確度滿足要求。

2.4.2 標準物質(zhì)驗證

應用本方法分別檢測質(zhì)控樣芹菜（標準證書編號：GSB-26）、蒜粉（標準證書編號：GSB-13）、湖南大米粉（證書標號：GSB-23a），結果見表6。實驗結果表明各元素的測定結果均在標準值置信區(qū)間內(nèi)，說明該方法的準確度高。

3 結論

采用Design Expert 13.0軟件，通過單因素和Box-Behnken試驗設計試驗方案，確定了電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定大米中總硒含量的最優(yōu)提取條件：硝酸用量5 mL、微波消解最高溫度160 ℃、微波功率1 000 W、趕酸溫度135 ℃，此時大米中的總硒加標回收率可達到95.9%。該方法方便快捷，準確有效。

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