溫舒然　馬占山　詹冬玲

摘要： 以靈芝孢子粉為原料， 使用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為提取劑， 采用酶解與超聲輔助提取相結(jié)合的方法， 將不同液固比、 超聲時間、 酶解時間和酶用量設(shè)定為4個因素， 進(jìn)行單因素試驗并設(shè)計響應(yīng)面試驗， 以確定最優(yōu)提取方式及其影響因素.? 利用大孔樹脂層析法對靈芝三萜進(jìn)行分離純化， 通過優(yōu)化分離純化工藝， 確定最佳洗脫樹脂、 洗脫液體積分?jǐn)?shù)、 上樣液流速以及上樣液質(zhì)量比. 采用高效液相色譜法分析靈芝總?cè)频慕M分差異. 通過預(yù)實驗分析，? 與單一提取法相比， 酶+超聲輔助提取更高效. 采用乙醇為提取劑提取靈芝中三萜類化合物可提高三萜的純度.? 最優(yōu)條件下可實現(xiàn)對三萜含量的快速、 精確測定， 為靈芝三萜的分離純化提供理論依據(jù).

關(guān)鍵詞：? 靈芝三萜； 提取工藝； 工藝優(yōu)化； 分離純化

中圖分類號： Q586

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號： 1671-5489（2024）02-0452-12

Extraction Process Optimization of?? Ganoderma Triterpenes

WEN Shuran， MA Zhanshan， ZHAN Dongling

（College of Food Science and Engineering，? Jilin Agricultural University，? Changchun 130118，? China）

Abstract：?? Ganoderma lucidum spore powder was used as raw material，? ethanol? with a volume fraction of? 70%? as extractant.? We adopted a combination of enzymatic? hydrolysis and ultrasound assisted extraction method，? set different liquid-solid ratios，? ultrasound time，? enzymatic hydrolysis time，? and enzyme dosage? as? four factors for a one-way test and designed a response surface experiment to? determine the optimal extraction method and its influencing factors. The?? Ganoderma triterpene were separated and purified by using macroporous resin chromatography. By optimizing the? separation and purification process， the optimal elution resin，?? eluent volume fraction，? flow rate of the upper sample solution and the mass ratio of the upper sample solution were determined. The compositional differences of the total? Ganoderma triterpenes were analysed by high performance liquid chromatography （HPLC）. Though the pre-experimental analysis， the results show that the enzyme + ultrasound assisted extraction is more efficient compared to the single extraction method. Ethanol is used as an extractant to extract triterpenoids from Ganoderma lucidum can enhance the purity of triterpenoids. Under optimal conditions， the? rapid and accurate determination of the triterpene content can be achieved， providing a theoretical basis for the separation and purification of Ganoderma triterpenes.

Keywords：? Ganoderma? triterpene;? extraction process;? process optimization;? separation and purification

0 引 言

靈芝三萜類化合物（GT）是從靈芝中提取出的一種重要生物活性成分， 其中主要成分靈芝酸A和靈芝酸G的結(jié)構(gòu)如圖1所示. GT在制藥和醫(yī)療保健中有巨大的應(yīng)用潛力[1-3]. 藥理研究表明， GT除調(diào)節(jié)血糖和血脂外， 還具有多種藥理活性， 如抗腫瘤、 抗菌、 抗病毒、 抗氧化、 免疫調(diào)節(jié)和保肝作用[4-8]， 已被用于治療和預(yù)防各種疾病， 如肝炎和糖尿病等.

常見的靈芝三萜提取方法包括溶劑回流提取法[9]、 超聲波提取法[10-11]、 超臨界CO2萃取法[12]、 微波輔助提取法、 有機(jī)溶劑提取法和酶輔助提取法等[13-15]. 由于靈芝三萜是一種脂溶性物質(zhì)， 因此可采用傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提法進(jìn)行提取. 根據(jù)實驗室環(huán)境條件， 采用多種提取方法相結(jié)合的方式， 對目標(biāo)物料進(jìn)行提取， 可有效提升提取效率.

靈芝粗提取液中含有多糖和色素等多種雜質(zhì)，? 需要分離其中雜質(zhì)部分， 提升三萜的純度.? 目前， 分離純化技術(shù)主要有薄層層析法、 柱層析法和制備高效液相色譜（HPLC）法等[16-17]. Cheng等[18]用石油醚洗滌除去脂肪酸， 用二氯甲烷提取靈芝三萜， 再用（400～600目）硅膠柱層析洗脫， 獲得5個靈芝三萜組分.

本文以靈芝孢子粉為原料，? 采用酶+超聲輔助提取法提取靈芝三萜， 以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為提取劑[19]， 用不同液固比、 超聲時間、 酶解時間、 酶用量為4個因素， 進(jìn)行單因素試驗， 并設(shè)計響應(yīng)面試驗， 以確定最優(yōu)提取方式及影響因素. 利用大孔樹脂層析法， 通過優(yōu)化分離純化工藝[20]， 確定最佳洗脫樹脂、 最佳洗脫液體積分?jǐn)?shù)、 上樣液流速以及上樣液質(zhì)量比. 通過HPLC分析靈芝總?cè)频慕M分差異， 實現(xiàn)快速、 精確地對三萜含量進(jìn)行測定[21]， 為靈芝三萜的分離純化以及HPLC分析提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料、 試劑與儀器

靈芝子實體和靈芝孢子粉均為赤靈芝， 靈芝酸A和G的標(biāo)準(zhǔn)品購于長春特產(chǎn)所； 纖維素酶（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.9%）購于山東隆科特酶抑制劑有限公司； 無水亞硫酸鈉購于天津市科密歐化學(xué)試劑公司； 齊墩果酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購于大連美侖生物技術(shù)有限公司； 無水乙醇、 NaOH、 HCl、 香草醛、 冰醋酸和高氯酸均為國產(chǎn)分析純試劑，?? 甲醇和乙腈等為國產(chǎn)色譜純試劑， 均購于北京化工廠； AB-8和D101型大孔樹脂購于天津天泰化學(xué)品有限公司.

電子分析天平（CPA-125型， 德國Sartorius 公司）； 電熱恒溫水浴鍋（HH-4A型， 北京市光明醫(yī)療儀器廠）； 制冰機(jī)（MCB-105型， 常熟市雪科電器有限公司）； 離心機(jī)（KL04-A型， 美國Agilent 公司）； 真空冷凍干燥機(jī)（FD-IB-50型， 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）； 電熱鼓風(fēng)干燥箱（101A-2ET型， 上海實驗儀器廠有限公司）； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型， 上海亞榮生化儀器廠）； 紫外可見分光光度計（7230G型，? 陜西凱利化玻儀器有限公司）； 超聲波清洗機(jī)（SG3300H型， 上海冠特超聲儀器有限公司）； 循環(huán)水式多用真空泵（SHB-IIIG型， 鄭州長城科工貿(mào)有限公司）； 智能恒流泵（BT1-100V-LCD型， 上海琪特分析儀器有限公司）； Binary HPLC水泵（Waters1525型， 美國Waters公司）； UV-Vis光譜儀（Waters2489型， 美國Waters公司）.

1.2 方 法

1.2.1 靈芝三萜制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將靈芝孢子粉于50 ℃烘干， 過100目篩， 精確稱取一定量樣品加入錐形瓶中， 先加入纖維素酶， 再加入酶解緩沖液， 待酶解完成， 在無水乙醇中于59 kHz下進(jìn)行超聲處理， 并在3 500 r/min下高速離心20 min， 取上清液， 過濾、 定容后按香草醛-冰醋酸-高氯酸法測定三萜得率. 參考文獻(xiàn)[22]方法， 將齊墩果酸配成100 μg/mL的對照溶液， 在546 nm處測吸光度值， 并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 用公式靈芝三萜得率=提取液中靈芝三萜的質(zhì)量（mg）/靈芝粉的干質(zhì)量（g）（1）計算得率.

1.2.2 單因素試驗

以靈芝孢子粉為原料， 通過酶+超聲輔助提取法提取靈芝三萜， 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、 溫度為50 ℃且pH=4的條件下， 在59 kHz下進(jìn)行超聲處理， 通過改變液固比（V（液）∶m（固）=30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1 mL/g）、 超聲時間（15，25，35，45，55 min）、 酶解時間（15，25，35，45，55 min）和酶量（1%，2%，3%，4%，5%）進(jìn)行單因素試驗.

1.2.3 響應(yīng)面試驗

利用Design-Expert V8.0.6軟件， 參考單因素試驗結(jié)果， 對三因素三水平進(jìn)行設(shè)計， 分別以超聲時間、 酶解時間和酶用量為主要指標(biāo)， 采用單因素試驗結(jié)果中對靈芝孢子粉中三萜化合物提取得率影響較大的3個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗， 優(yōu)化工藝.

1.2.4 大孔樹脂吸附及洗脫工藝研究

使用內(nèi)徑和長度分別為1.08，50 cm的玻璃柱， 裝入經(jīng)處理的D101和AB-8型大孔樹脂， 濕法裝柱. 通過智能恒流泵以1 mL/min的流速吸取靈芝三萜提取液， 泵送通過玻璃柱， 靜態(tài)吸附3 h， 用水沖洗玻璃柱1 管（1 管約為4.5 mL）， 通過自動收集裝置分段（5?? mL/份）收集流出液， 并測定靈芝三萜的質(zhì)量濃度， 繪制動態(tài)吸附曲線.

由于靈芝三萜酸易溶于有機(jī)溶劑， 因此用乙醇-水體系作為洗脫液. 吸取靈芝三萜提取液的上樣液1 管， 控制流速為1 mL/min通過樹脂柱. 為確定最佳的洗脫液濃度， 分別用體積分?jǐn)?shù)為40%，60%，80%和95%濃度的乙醇對其進(jìn)行洗脫， 用自動收集裝置收集洗脫劑用量后測定靈芝三萜的質(zhì)量濃度.

1.2.5 大孔樹脂吸附率和解吸率計算

在500 mL三角形燒瓶中， 分別將5 g兩種樹脂與200 mL靈芝三萜提取物（1.0 mg/mL）混合. 振蕩3 h后， 測定兩種樹脂的吸附容量. 使用循環(huán)水多用途真空泵在真空下進(jìn)行抽吸過濾， 得到含有吸附物的樹脂. 在燒瓶中稱取0.5 g含吸附物大孔樹脂的等分試樣， 加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇作為解吸溶劑. 振蕩后， 測定溶劑中的靈芝三萜含量， 計算吸附率和解吸率：? 吸附率=上樣液質(zhì)量濃度×上樣液體積-洗脫液質(zhì)量濃度/樹脂質(zhì)量×100%，（2）

解吸率=洗脫液質(zhì)量濃度×洗脫液體積/（上樣液質(zhì)量濃度-吸附平衡質(zhì)量濃度）×上樣液體積×100%.（3）1.2.6 大孔樹脂吸附泄露曲線

采用濕法裝柱， 待樹脂柱平衡穩(wěn)定后， 采用恒流泵將三萜粗提取液引入樹脂柱， 對其進(jìn)行動態(tài)吸附， 并檢測分離后的三萜濃度. 通常情況下， 在流出液中靈芝三萜的濃度達(dá)到上樣液1/10時達(dá)到泄露點(diǎn)[23]， 可停止上樣， 此時為最大上樣量. 以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)， 流出液靈芝三萜濃度為縱坐標(biāo)， 繪制泄露曲線.

1.2.7 靈芝三萜的純化及純度計算

在上樣過程中， 將靈芝三萜樣品溶液的上柱流速分別控制為1.0，2.0，3.0 mL/min， 測定每份流出液（5 mL/份）的質(zhì)量濃度， 利用式（2）計算其吸附率. 同時， 分別配制質(zhì)量濃度為10，15，20，25，30 mg/g的靈芝三萜樣品溶液， 以泵速為1.0 mL/min的流速加載到樹脂柱上， 測定每份流出液（5 mL/份）的質(zhì)量濃度， 利用式（2）計算其吸附率.

使用AB-8型大孔樹脂實現(xiàn)對靈芝粗三萜溶液的動態(tài)吸附解吸， 并旋蒸濃縮洗脫液. 將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥并稱其質(zhì)量. 測定樣品溶液濃度， 并按純度=靈芝三萜類化合物質(zhì)量（g）/干燥后樣品質(zhì)量（g）×100%（4）計算產(chǎn)物的靈芝三萜純度.

1.2.8 高效液相色譜分析

高效液相色譜待測樣品預(yù)處理： 取1 mg經(jīng)純化、 濃縮凍干的靈芝三萜， 溶于10 mL甲醇中， 經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后， 裝入色譜瓶中.? 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制： 分別稱取靈芝酸A和G標(biāo)準(zhǔn)品， 用甲醇溶解， 過濾膜， 即得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液. 參考文獻(xiàn)[24]方法， 以乙腈（A）-醋酸（φ=0.01%）水溶液（B）為流動相， 使用色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）對樣品進(jìn)行梯度洗脫. 將柱溫控制在30 ℃， 分析波長設(shè)為254 nm， 以1.0 mL/min流速進(jìn)樣， 將進(jìn)樣量控制在20 μL.? 高效液相色譜洗脫條件列于表1， 分別分析三萜類成分的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液與混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液， 通過三萜類成分的保留時間定性分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測量546 nm處吸光度得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2（A）所示. 以吸光度為縱坐標(biāo)， 齊墩果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)， 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為 y=9.152 9x+0.042 1，? R2=0.999 2， 表明線性關(guān)系良好， 可用該公式計算靈芝三萜含量.

2.2 單因素試驗

2.2.1 液固比對靈芝三萜得率的影響

以30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1的液固比為對照， 研究不同液固比對靈芝三萜最終得率的影響，? 結(jié)果如圖2（B）所示.? 該方法的其他工藝參數(shù)為： 酶解時間40 min、 超聲波作用時間40 min、 酶用量3%、 酶解溫度50 ℃.? 由圖2（B）可見： 隨著液固比的增加， 靈芝三萜得率不斷提高， 可能是因為提取液與物料接觸面積接觸更充分， 導(dǎo)致靈芝三萜溶出效果更好； 當(dāng)液固比為50∶1時， 靈芝三萜酶得率的最大值為0.86 mg/g； 當(dāng)液固比繼續(xù)增加時， 靈芝三萜得率下降， 這是由于提取液過多， 可能析出其他雜質(zhì)影響了靈芝三萜析出， 導(dǎo)致靈芝三萜提取量下降.?? 本文選定最佳液固比為50∶1， 與文獻(xiàn)[25-26]結(jié)果相同.

2.2.2 酶量對靈芝三萜得率的影響

以1%，2%，3%，4%，5%酶用量為對照， 研究不同酶用量對靈芝三萜最終得率的影響，? 結(jié)果如圖2（C）所示.? 該方法的其他工藝參數(shù)為： 酶解時間40 min、 超聲波作用時間40 min、? 酶解溫度50 ℃、 液固比50∶1.? 由圖2（C）可見：? 隨著酶用量的增加， 靈芝三萜得率增大； 當(dāng)酶用量為4%時， 靈芝三萜得率的最大值為0.92 mg/g;? 之后靈芝三萜的得率降低， 這是由于酶解靈芝中三萜類化合物時， 溶出了其他物質(zhì)， 析出了其他雜質(zhì)， 從而影響了靈芝中三萜類化合物析出， 導(dǎo)致靈芝三萜含量降低[27]. 因此， 本文選定最佳酶用量為4%.

2.2.3 酶解時間對靈芝三萜得率的影響

以15，25，35，45，55 min酶解時間為對照， 研究酶解時間對靈芝三萜得率的影響， 結(jié)果如圖2（D）所示.? 該方法的其他工藝參數(shù)為：? 超聲時間40 min、 酶用量為3%、 控制酶解溫度為50 ℃、 液固比50∶1. 由圖2（D）可見：? 隨著酶解反應(yīng)時間的增加， 靈芝三萜的提取得率增大； 當(dāng)反應(yīng)時間為35 min時， 靈芝三萜得率的最大值為0.96 mg/g;? 之后靈芝三萜的得率降低. 導(dǎo)致這種趨勢的原因可能是纖維素酶在一定時間內(nèi)酶解效率達(dá)到最大， 若時間過長， 由于纖維素酶對溫度耐受范圍有限， 酶內(nèi)分子結(jié)構(gòu)被破壞， 酶發(fā)生降解， 導(dǎo)致靈芝三萜得率降低[28].? 因此， 本文選定最佳酶解時間為35 min.

2.2.4 超聲時間對靈芝三萜得率的影響

以超聲時間15，25，35，45，55 min為對照， 研究超聲時間對靈芝三萜得率的影響，? 結(jié)果如圖2（E）所示. 該方法的其他工藝參數(shù)為： 酶解時間40 min、? 酶用量3%、 纖維素酶酶解溫度50 ℃、 液固比50∶1.? 由圖2（E）可見：? 隨著超聲時間的增加， 靈芝三萜得率增大； 當(dāng)超聲時間為45 min時， 靈芝三萜得率的最大值為0.84 mg/g; 之后靈芝三萜得率降低.? 由于提取靈芝三萜時利用了超聲波的機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)達(dá)到傳質(zhì)平衡， 但需要一定時間[29]，? 導(dǎo)致得率逐漸增大， 之后溶出無效成分和雜質(zhì)增多， 影響三萜類化合物質(zhì)溶出， 得率下降. 因此， 本文選定最佳超聲時間為45 min.

2.3 響應(yīng)面試驗分析

2.3.1 響應(yīng)面工藝試驗設(shè)計

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)[30-32]， 以靈芝三萜得率為響應(yīng)面指標(biāo)， 從中選取對其影響最大的3個因素， 分別是超聲時間（A）、 酶解時間（B）和酶用量（C）， 對其進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗， 選出最佳提取工藝. 利用Design-Expert V8.0.6軟件， 建立三因素三水平二次回歸方程， 設(shè)計因素水平列于表 2.

通過檢驗分析和二次多項式模型回歸分析， 得到對靈芝三萜提取率進(jìn)行預(yù)測的回歸模型為y=0.888 6-0.009 6×A-0.021 4×B+0.044 1×C+0.029 1×AB-0.020 7×AC+0.044 1×BC-0.063 5×A2-0.086 8×B2-0.066 9×C2，式中： y為響應(yīng)值靈芝三萜的提取率； A，B，C分別為超聲時間、 酶解時間和酶用量的編碼值.? 方差分析（ANOVA）結(jié)果列于表4.

由表4可見：? 該模型的P（Pr>F）<0.000 1， 達(dá)到極顯著水平， 存在明顯差異；? 因變量與考察自變量間的線性關(guān)系顯著， R2=0.982 7； 失擬項P=0.211 8>0.05不顯著， 說明響應(yīng)值在本文所得數(shù)據(jù)下可精準(zhǔn)全面預(yù)測； 模型調(diào)整確定系數(shù)（Adj.R2）=96.05%， 預(yù)測相關(guān)系數(shù)（Pred.R2）=81.35%， 表明該模型具有較高的可信性和較好擬合度； 模型的變異系數(shù)（CV）為2.09%. 由方差分析結(jié)果可知， 超聲時間（A）、 酶解時間（B）和酶用量（C）之間存在明顯的交互作用， 不同因素對靈芝三萜得率影響不同， 由大到小依次為C＞B＞A.

2.3.2 響應(yīng)面模型擬合及分析

根據(jù)二次模擬回歸方程繪出響應(yīng)面及等高線如圖3所示.? 酶用量、 酶解時間和超聲時間兩兩之間分別存在交互作用， 且兩因素交互作用顯著， 同時影響靈芝三萜最終得率. 由圖3（A）可見， 超聲時間（A）和酶解時間（B）二者相互作用對靈芝三萜得率的影響顯著性較強(qiáng)， 同時靈芝三萜得率隨酶用量的增加呈先增加后減少的趨勢， 在A方向曲面變化不明顯， 方差分析中酶解時間對結(jié)果影響顯著（P<0.01）， 且A與B交互作用等高線橢圓程度明顯， 所以二者交互作用顯著（P<0.05）. 由圖3（B）可見：? 超聲時間（A）和酶用量（C）相互作用對靈芝三萜得率的影響顯著性較強(qiáng)， 隨著超聲時間的增加， 靈芝三萜得率先增加后減少， 由方差分析可知， 在A方向曲面變化不大， 但C方向曲面變化極顯著（P<0.01）；

A與C交互作用等高線的橢圓程度明顯， 因此二者交互作用顯著（P<0.05）. 由圖3（C）可見： 酶解時間（B）和酶用量（C）相互作用對靈芝三萜得率的影響顯著性較強(qiáng)， 隨著超聲持續(xù)時間的增加， 靈芝三萜得率先增加后減少；? 由方差分析可知， 在B與C方向曲面變化極顯著（P<0.01）， 且B與C交互作用等高線橢圓程度明顯， 所以二者交互作用極顯著（P<0.01）.

2.3.3 最佳提取條件確定

將所得數(shù)據(jù)利用 Design-Expert軟件分析， 最終可確定靈芝三萜提取工藝的最佳條件為： 以φ（乙醇）=70%為提取劑， 控制液固比為50∶1， 并進(jìn)行超聲洗滌， 超聲時間（A）為46 min， 再進(jìn)行酶解， 將其溫度控制在50 ℃， 并控制酶用量（C）為4.8%， 持續(xù)酶解時間（B）為35 min. 在該條件下， 靈芝孢子粉總?cè)频牡寐蕿?.98 mg/g.

2.4 大孔樹脂吸附靈芝三萜

2.4.1 上樣液量的選擇

圖4為大孔樹脂最佳吸附曲線. 由圖4可見， 對每份流出液靈芝三萜質(zhì)量濃度進(jìn)行測定， 確定在第7～13管時， 大孔樹脂吸附靈芝三萜得率最高， 吸附效果最好. 所以每次收集7～13管中靈芝三萜的流出液， 并繪制動態(tài)吸附最佳曲線.

圖5為D101和AB-8兩種大孔樹脂動態(tài)吸附曲線對靈芝三萜純化程度的影響. 由圖5可見， 通過對比兩種大孔樹脂D101和AB-8吸附靈芝三萜粗體液， 可測定流出液靈芝三萜的質(zhì)量濃度. 通過對解吸率的計算得到AB-8型大孔樹脂和D101型大孔樹脂的解吸率分別為94.39%和83.51%，? 可見AB-8型大孔樹脂具有更好的吸附性， 在動態(tài)洗脫試驗中純化效果更好. AB-8型大孔樹脂在純化分析中的方法簡單，? 適用于靈芝三萜類化合物的富集純化.

2.4.2 大孔樹脂吸附泄露曲線

圖6為大孔樹脂動態(tài)吸附泄露曲線. 由圖6可見， 靈芝三萜得率隨上樣量增大而增大. 當(dāng)上樣量16管（約70 mL）時，? 靈芝三萜得率為12.33 mg/g. 因此選擇70 mL為最佳上樣量.

2.4.3 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的確定

圖7為不同洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對靈芝三萜得率的影響.

由圖7可見， 隨著洗脫液體積分?jǐn)?shù)的增加， 靈芝三萜得率呈先升高后降低的趨勢. 當(dāng)φ（乙醇）=40%時， 靈芝三萜得率最小， 為8.49 mg/g； 當(dāng)φ（乙醇）=95%時， 靈芝三萜的得率最大， 為9.97 mg/g. 原因為靈芝三萜類物質(zhì)為脂溶性物質(zhì)， 易溶于乙醇等有機(jī)溶劑， 當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大時， 三萜類物質(zhì)溶解度也不斷增大， 且在φ（乙醇）=95%時具有較高的溶解性， 更容易被洗脫[33]. 因此， 選擇靈芝三萜的洗脫溶劑為φ=95%的乙醇.

2.4.4 上樣液流速的確定

圖8為上樣液流速對靈芝三萜吸附程度的影響. 由圖8可見， 隨著上樣液流速的增大， 大孔樹脂對靈芝三萜的吸附能力逐漸降低. 劉洋璇[34]研究表明， 隨著流速的增加， 樹脂對樣液的吸附能力不斷降低， 使大孔樹脂不能充分吸附， 吸附過程未完成便隨樣液流出樹脂柱. 所以上樣液流速選擇1.0 mL/min， 此時吸附率最高.

2.4.5 上樣液質(zhì)量比的確定

圖9為上樣液質(zhì)量比對大孔樹脂吸附性能的影響. 由圖9可見， 隨著樣品質(zhì)量比的增大， 大孔樹脂對靈芝三萜的吸附率呈先減小后增大的趨勢， 在上樣液質(zhì)量比20～30 mg/g內(nèi)， AB-8型大孔樹脂對樣品的吸附率波動較小. 靈芝三萜得率隨上樣液質(zhì)量比的增加也呈升高的趨勢， 當(dāng)質(zhì)量比為25 mg/g時， 靈芝三萜得率達(dá)到最大值18.34 mg/g. 但當(dāng)樣品質(zhì)量比過高時， 所含雜質(zhì)增多， 樹脂因吸附其他物質(zhì)而使吸附率下降. 因此， 上樣液質(zhì)量比選擇25 mg/g， 以充分吸收靈芝三萜.

2.4.6 靈芝三萜純度分析

用式（4）計算靈芝三萜純度， 其純度由原來的42.57%提高至87.09%， 約為純化前2.05倍， 表明該方法簡單高效， 可用于靈芝三萜的純化分析.

2.5 高效液相色譜法鑒定分析

圖10為靈芝三萜類標(biāo)準(zhǔn)品混合組分與樣品的HPLC. 由圖10可見， 在1.2.8條件下進(jìn)行高效液相色譜分析， 得到的各色譜峰分離度良好， 其中三萜類標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時間分別為靈芝酸G： 56.875 min， 靈芝酸A： 65.442 min.? 由靈芝三萜標(biāo)準(zhǔn)品譜與樣品譜可見， 通過大孔樹脂純化后得到靈芝三萜提取液， 純化后得到以靈芝酸A和靈芝酸G為主要成分的靈芝三萜類化合物， 滿足實驗要求. 通過HPLC檢測分析， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到線性回歸方程為

靈芝酸A： y=2.039 3×106x-62 245.530 3，R2=0.999 2;

靈芝酸G： y=3.894 1×106x-61 808.139 3，R2=0.999 4.

結(jié)果表明， 靈芝三萜在0.01～0.1 mg/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系.

對兩種靈芝三萜類化合物進(jìn)行相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）計算， 結(jié)果分別為0.51%，0.41%， 表明儀器精密度良好. 計算兩種靈芝三萜酸峰面積， 結(jié)果表明， 二者無明顯變化， RSD結(jié)果分別為1.17%，1.25%， 表明該方法具有良好的可重復(fù)性. 對兩種靈芝三萜酸的 RSD結(jié)果進(jìn)行計算， 結(jié)果分別為1.38%，1.28%， 表明受試品溶液在48 h內(nèi)較穩(wěn)定. 通過對三萜成分含量測定發(fā)現(xiàn)， 靈芝中三萜的組成及含量存在明顯差異， 靈芝酸A和靈芝酸G分別占靈芝酸總量的26.17%，38.35%.

綜上所述， 本文采用酶+超聲波輔助提取法快速、 高效地提取靈芝中三萜類物質(zhì). 通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗確定靈芝三萜的最佳提取參數(shù)： 提取劑為φ=70%的乙醇， 液固比50∶1， 酶解最適溫度50 ℃， 超聲時間46 min， 酶解時間35 min， 酶量為4.8%. 在該條件下對靈芝孢子粉總靈芝三萜得率為0.98 mg/g. 選擇AB-8型大孔樹脂分離純化靈芝三萜類物質(zhì)， 通過考察動態(tài)吸附解吸條件確定最佳純化工藝為： 上樣液靈芝三萜類物質(zhì)濃度為25 mg/g， 上樣液流速為1.0 mL/min， 先靜態(tài)吸附3 h后用1管（4.5 mL）蒸餾水洗去雜質(zhì)， 再用φ=95%的乙醇作為洗脫劑并以1.0 mL/min流速洗脫. 在該條件下靈芝三萜類物質(zhì)純度由42.57%提高至87.09%.??? 通過HPLC分析洗脫液成分， 結(jié)果表明，? 保留時間為56.875，65.442 min時出現(xiàn)峰值， 分別為靈芝酸G和靈芝酸A， 因此純化后的靈芝三萜類化合物以靈芝酸A和靈芝酸G為主要成分析出.

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（責(zé)任編輯： 單 凝）

收稿日期： 2023-07-26.

第一作者簡介： 溫舒然（2000—）， 女， 漢族， 碩士研究生， 從事生物大分子空間結(jié)構(gòu)改造的研究， E-mail： wenshuran2023@163.com.

通信作者簡介：??? 詹冬玲（1977—）， 女， 漢族， 博士， 副教授，? 從事食品生物化學(xué)的研究， E-mail： zdlgale@126.com.

基金項目：?? 吉林省科技發(fā)展計劃重點(diǎn)研發(fā)項目（批準(zhǔn)號： 20210202109NC）.