巫春旭++盧雪梅++褚夫江++王敏++金小寶++朱家勇

摘 要：以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化堿性蛋白酶水解蠅蛆蛋白制備抗氧化肽的工藝條件。采用超濾、Sephadex G25凝膠過濾層析對蠅蛆蛋白水解物進(jìn)行分離純化，篩選高抗氧化活性組分。結(jié)果表明，酶法制備蠅蛆蛋白抗氧化肽的最佳工藝條件為：加酶量7000 U/g，底物質(zhì)量濃度1%，酶解時間15 min，酶解溫度50℃，pH值7.5。水解物經(jīng)超濾得到相對分子量大于10 kD、5～10 kD以及小于5 kD的組分，以小于5 kD組分清除DPPH自由基活性最強。該組分通過凝膠過濾層析進(jìn)一步分離得到2個組分，其中組分Ⅱ的清除DPPH活性明顯高于組分Ⅰ，達(dá)到81.83 ± 0.80%。酶解產(chǎn)物經(jīng)2步純化后，其DPPH清除活性得到了顯著提高，提高約57.88%。

關(guān)鍵詞：家蠅幼蟲；抗氧化肽；工藝條件；分離純化

中圖分類號： Q969.97 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/ nyyjs.20160909001

家蠅（Musca domestica）幼蟲，又名五谷蟲，俗稱蠅蛆，其干燥物為中藥羅仙子。據(jù)《本草綱目》記載，羅仙子具有“治小兒諸疳積、疳瘡，熱病譫妄，毒痢作吐”的功效。現(xiàn)代科學(xué)實驗表明，蠅蛆富含蛋白，并且其組成氨基酸較為齊全，另外還有豐富的維生素、甲殼素、礦物質(zhì)以及微量元素等，具有較高的營養(yǎng)價值[1]。從蠅蛆中提取的抗菌肽對耐藥菌株具有較強的抑制活性[2]，在雞飼料中添加蠅蛆肽具有調(diào)節(jié)和改善雞腸道菌群以及提高營養(yǎng)物質(zhì)可利用率的作用[3]，在鯽魚飼料中添加蠅蛆粉可增強魚體非特異性免疫功能[4]。說明蠅蛆在飼料、食品添加劑方面具有較高的潛在應(yīng)用價值。此外，研究發(fā)現(xiàn)蠅蛆提取物還具有清除氧自由基[5]、抗炎和抗動脈粥樣硬化的作用[6]，提示蠅蛆可能是一種良好的食品、保健品資源，為蠅蛆更深度的開發(fā)利用提供了新的方向。

抗氧化多肽作為天然抗氧化劑，與合成抗氧化劑相比，具有更高的安全性。而蠅蛆繁殖周期短，飼養(yǎng)成本低廉，因此，從蠅蛆中制備抗氧化肽不失為一種好的選擇。目前，主要通過酶解法和發(fā)酵法來制備抗氧化肽。本試驗以DPPH自由基清除率為抗氧化活性評價指標(biāo)，優(yōu)化酶解法制備蠅蛆抗氧化肽工藝條件，并對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，為蠅蛆抗氧化肽的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

種蠅，獲贈于廣東省疾病與控制中心，雙翅目（Diptera），蠅科（Muscidae），蠅屬（Musca），家蠅（M.domestica）；3日齡家蠅幼蟲，由實驗室自行繁殖飼養(yǎng)獲得；堿性蛋白酶（P4860-50ML），SIGMA公司產(chǎn)品；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），SIGMA公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

電子天平，Sartorius公司提供；分光光度計U-2900，HITACHI公司提供；HH-3A數(shù)顯恒溫三溫水浴鍋，金壇市精達(dá)儀器制造廠提供；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司提供；高速冷凍離心機，Eppendorf公司提供；Lab scale小型切向流超濾系統(tǒng)，Millipore公司提供；快速蛋白純化系統(tǒng)，由AKTA公司提供。

2 試驗方法

2.1 家蠅幼蟲的處理及蛋白提取

收集3日齡家蠅幼蟲，用蒸餾水反復(fù)清洗以去除雜物，經(jīng)沸水燙漂后置于50℃烘干，粉碎，索氏脫脂（溶劑為石油醚），烘干，過40目篩，備用。

稱取脫脂蛆粉50g，加水500mL，充分混勻，調(diào)pH至10.5左右，置于50℃恒溫水浴鍋，提取3h。浸提后以5000 r/min離心15min，取上清液。再調(diào)pH至4.5，于4℃下靜置2h。以5000 r/min離心15min，取沉淀，將pH調(diào)至7.0，透析以脫鹽，冷凍干燥后備用[7]。

2.2 家蠅幼蟲蛋白酶解單因素試驗

以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)分別考察加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時間、溫度和pH 5個因素對家蠅幼蟲蛋白抗氧化肽制備的影響，每個因素設(shè)置5個水平進(jìn)行單因素試驗。

2.3 家蠅幼蟲蛋白酶解正交試驗

在前期單因素試驗基礎(chǔ)上，以加酶量、底物濃度、時間、溫度和pH 5個因素設(shè)計正交表L18（37）進(jìn)行正交試驗，見表1。

2.4 DPPH自由基清除活性測定

DPPH是一種合成的以氮為中心的穩(wěn)定自由基，已廣泛用于各種提取物或化合物的抗氧化活性評價及篩選工作中。本試驗以DPPH自由基清除率為抗氧化活性評價指標(biāo)，分離并篩選活性組分。

取0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液2mL，與2mL待測樣品混勻，室溫避光反應(yīng)30min，在517nm處測得吸光度為Ai；取2 mL待測樣品與等體積無水乙醇混合，反應(yīng)30min，在517nm處測得吸光度為Aj；取2mL蒸餾水與等體積的DPPH溶液混合，同上操作，在517 nm處測得吸光度為A0，則待測樣品對DPPH的清除率為：K=（A0 – Ai + Aj）/A0 × 100%[8]

2.5 超濾

采用小型切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行家蠅幼蟲蛋白酶解液的分離，濾膜截留分子量分別為10kD和5kD。超濾時進(jìn)口壓為0.14MPa，出口壓為0.08MPa。超濾完成后分別收集各分子段組分，并測定DPPH清除活性，選擇活性最高的組分進(jìn)行凝膠柱層析分離。

2.6 Sephadex G25凝膠柱層析

實驗采用GE HiPrep26/10預(yù)裝脫鹽柱，其填料為 SephadexG25，柱體積為53mL。上樣量為500μL，洗脫液為脫氣蒸餾水，線性流速為30cm/h，檢測波長254 nm，按峰收集，并分別測定DPPH清除活性。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗分析

3.1.1 加酶量對酶產(chǎn)物抗氧化活性的影響

設(shè)定底物質(zhì)量濃度為1%，加酶量分別為1000U/g、3000U/g、5000U/g、7000U/g、9000U/g，在pH值為8.0，溫度為50℃的條件下反應(yīng)20min，后置于85℃水中滅酶5～10min，經(jīng)5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10min后，分別測定上清DPPH清除活性，結(jié)果見圖1。由圖1可知，酶解產(chǎn)物DPPH清除率隨加酶量的增加呈逐步升高趨勢，并且在5000 U/g之前提升明顯，之后則趨于平緩，在7000 U/g左右達(dá)到最大。若考慮到成本，加酶量設(shè)在6000 U/g左右為宜。

3.1.2 底物質(zhì)量濃度對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

設(shè)定加酶量為5000 U/g，pH值為8.0，溫度50℃，時間20min，底物質(zhì)量濃度分別設(shè)置為1%、2%、3%、4%和5%，考察不同底物質(zhì)量濃度對酶解產(chǎn)物DPPH清除率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在底物質(zhì)量濃度為2%左右時，DPPH清除率達(dá)到最大，濃度過低或過高都不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。因此，底物濃度為2%左右最佳。

3.1.3 時間對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

設(shè)定加酶量5000U/g，底物質(zhì)量濃度為1%，pH值為8.0，溫度50℃，平行設(shè)置5個組分別反應(yīng)5、10、15、20、25min，考察不同反應(yīng)時間對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在15min之前，酶解產(chǎn)物對DPPH的清除率隨時間的增加而提高；而15min之后，DPPH清除率不再升高，反而有輕微下降趨勢。因此，反應(yīng)時間控制在15min左右較為合適。

3.1.4 溫度對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

設(shè)定加酶量5000U/g，底物質(zhì)量濃度為1%，pH值為8.0，溫度分別設(shè)置為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，考察不同溫度對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，酶解產(chǎn)物DPPH清除率隨溫度的升高呈略微先增后降的趨勢，但是變化較小，溫度設(shè)置在50～55℃之間對DPPH清除活性影響不大。

3.1.5 pH對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

設(shè)定加酶量5000U/g，底物質(zhì)量濃度為1%，溫度50℃，pH值分別為6.5、7、7.5、8.0、8.5，考察不同pH值對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著pH的增加，酶解產(chǎn)物活性呈先增后減的趨勢，當(dāng)pH值在7.5時，DPPH清除率達(dá)到最大。因此，最適pH在7.5左右。

3.2 正交試驗分析

采用正交試驗確定最佳酶解工藝條件試驗結(jié)果見表2。從表2中各因素的R值可知，各因素對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響大小順序為：B>A>C>E>D，最優(yōu)條件組合為A3B1C3D2E2，即加酶量7000 U/g，底物質(zhì)量濃度1%，酶解反應(yīng)時間15 min，酶解溫度50℃，pH值7.5。

3.3 蠅蛆蛋白酶解液的超濾分離結(jié)果

蠅蛆蛋白酶解液經(jīng)超濾分離得到3個分子段組分，分別為Mr ≥ 10 kD、5 kD ≤ Mr ≤ 10 kD以及Mr ≤ 10kD 。不同分子段組分質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的關(guān)系如6圖所示。從圖6中可以看出，3個組分DPPH清除率均隨質(zhì)量濃度的增大而升高，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。分子量大于10kD的組分清除DPPH自由基活性明顯低于10kD以內(nèi)的組分，而分子量在之內(nèi)的組分清除DPPH自由基活性最強，因此選擇分子量10kD以內(nèi)的組分進(jìn)行下一步分離。

3.4 Sephadex G25凝膠層析結(jié)果

凝膠柱層析為空間排阻色譜，其原理是按照分子量大小不同進(jìn)行分離，分子量越大，出峰越快。Sephadex G25葡聚糖凝膠柱的分離范圍是1000～5000，適合超濾得到DPPH清除活性最強組分（分子量5kD以內(nèi)）的分離，其分離結(jié)果如圖7所示。超濾得到Mr ≤ 5kD組分經(jīng)Sephadex G25分離得到2個主峰分別為組分Ⅰ和組分Ⅱ，比較同濃度（1mg/mL）組分Ⅰ、組分Ⅱ以及未純化酶解液DPPH清除活性（表3），可知，組分Ⅱ的DPPH清除活性明顯高于組分Ⅰ，達(dá)到81.83±0.80%，較未純化酶解液清除率提高了57.88%。

4 結(jié)論與討論

蠅蛆體內(nèi)具有多種活性成分，是重要的資源昆蟲之一。蠅蛆作為飼料或添加劑應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，可增強家禽免疫力、提高肉的質(zhì)量[9]；不僅如此，從蠅蛆中提取的蛋白、多肽還具有一定的清除自由基、抗動脈粥樣硬化的作用，因此可作為功能食品資源開發(fā)利用。

本文以DPPH自由基清除率為抗氧化能力評價指標(biāo)，通過單因素和正交試驗確定了蠅蛆蛋白制備抗氧化肽的最佳酶解工藝條件為：加酶量7000U/g，底物質(zhì)量濃度1%，酶解時間15min，酶解溫度50℃，pH值7.5。經(jīng)超濾和Sephadex G25柱層析的2次純化后，其DPPH清除活性提高了57.88%，達(dá)到81.83 ± 0.80%，具有較強的抗氧化活性，因此有望作為抗氧化劑應(yīng)用于功能、保健食品。

在本試驗中，2步純化結(jié)果都表明，分子量小的組分表現(xiàn)出更好的抗氧化活性，這一結(jié)論與大豆多肽類似[10]。不過，由于單一蛋白酶水解的位點有限，因此水解產(chǎn)物仍有可進(jìn)一步水解的空間。因此，后續(xù)可以嘗試結(jié)合其他多種蛋白酶進(jìn)行水解。但是，酶解得到的多肽抗氧化活性是否隨分子量的減小一直呈上升趨勢呢？這有待進(jìn)一步研究。若蛋白水解致使抗氧化活性的提高與其水解導(dǎo)致活性位點暴露有關(guān)的話，那么必定存在這樣的情況，即水解到一定程度后，活性位點已經(jīng)完全暴露，繼續(xù)水解不會再使抗氧化活性得到提高，因此找到合適的多酶配合水解方案以及合適的水解度將能有效提高水解效率，并減少不必要的資源浪費。

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作者簡介：巫春旭（1993-），男，廣東藥科大學(xué)研究生，研究方向：昆蟲活性物質(zhì)功能。