高雨桐,宋秀蘋,李楠,尚涌琳,韓飛

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 沈陽 110016)

二至丸出自《扶壽精方》[1], 由女貞子FructusLigustriLucidi和墨旱蓮EcliptaeHerba兩味中藥材按照質(zhì)量比1∶1組成。研究表明,該制劑具有補(bǔ)益肝腎,滋陰止血之功效,臨床常被用于治療肝腎陰虛,眩暈耳鳴,咽干鼻燥,腰膝酸痛,月經(jīng)量多等癥狀[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明,二至丸具有抗骨質(zhì)疏松[3-6]、老年癡呆[7]、糖尿病[8],免疫調(diào)節(jié)[9],抗衰老[10],保肝[11-12]等作用, 因此具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。

目前,已報(bào)道的文獻(xiàn)對(duì)于二至丸及其組味藥材的研究較少,且大部分主要集中在二至丸制劑、單味藥材及其個(gè)別化學(xué)成分的定性或定量研究方面, 對(duì)女貞子-墨旱蓮藥對(duì)提取物的指紋圖譜與化學(xué)成分指認(rèn)研究較少。2020 年版《中國藥典》收載的二至丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未包括指紋圖譜研究內(nèi)容,且其含量測定指標(biāo)僅僅對(duì)女貞子主要活性成分特女貞苷進(jìn)行了含量測定[2,13],未對(duì)其他化學(xué)成分如蟛蜞菊內(nèi)酯等進(jìn)行控制。蟛蜞菊內(nèi)酯為墨旱蓮藥材的主要活性成分,具有保肝、抗免疫抑制、促骨分化,抗腫瘤等藥理作用[14]。

中藥材及其復(fù)方中所含的化學(xué)成分復(fù)雜多樣,其藥效的發(fā)揮是多種化學(xué)成分綜合作用的結(jié)果。基于女貞子-墨旱蓮藥對(duì)及其制劑二至丸的研究現(xiàn)狀,本研究采用HPLC法建立了女貞子-墨旱蓮藥對(duì)提取物的指紋圖譜,并通過超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)聯(lián)用技術(shù)鑒定了藥對(duì)提取物中所含成分的化學(xué)結(jié)構(gòu),以期為全面控制女貞子-墨旱蓮藥對(duì)及其制劑的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司),AG285型電子天平(梅特勒托利多科技有限公司),FA2004型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司),KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),Thermo ScientificTMUHPLC-Q-ExactiveTM(美國Thermo公司),Xcalibur 軟件(美國Thermo公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品木犀草苷(純度 ≥ 98.0%,批號(hào):AFBI0506)、特女貞苷(純度 ≥ 98.0%,批號(hào):AFBG1551)、木犀草素(純度 ≥ 98.0%,批號(hào):AFBL0755)、蟛蜞菊內(nèi)酯(純度 ≥ 98.0%,批號(hào):AF21041807)、女貞苷 G13(純度 ≥ 98.0%,批號(hào):AFBH1901)購自成都埃法生物科技有限公司;對(duì)照品芹菜素(純度 ≥ 98.0%,批號(hào):T30A11F112008)、蘆丁(純度 ≥98.0%,批號(hào):T20N11Z131674)購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈、甲醇(色譜純,杰帝貝柯化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司),甲酸(色譜純,山東西亞化學(xué)有限公司),純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.3 藥材

本實(shí)驗(yàn)收集了不同產(chǎn)地來源的女貞子、墨旱蓮藥材各10批,各批次產(chǎn)地和批號(hào)見表1,所有藥材經(jīng)沈陽藥科大學(xué)賈英教授鑒定均分別為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)和菊科植物鱧腸EcliptaprostrataL.的干燥地上部分。實(shí)驗(yàn)將各批次女貞子和墨旱蓮隨機(jī)配伍分為15組,分組情況見表2。

表1 女貞子和墨旱蓮飲片來源及批號(hào)信息Table 1 The origins and batch number of herbal pieces of Fructus Ligustri Lucidi and Ecliptae Herba

表2 女貞子和墨旱蓮15批物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)的飲片批次Table 2 15 batches of Fructus Ligustri Lucidi and Ecliptae Herba substance benchmarks corresponding to the batches of decoction pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取特女貞苷、女貞苷G13、蟛蜞菊內(nèi)酯、木犀草素、芹菜素、蘆丁、木犀草苷對(duì)照品適量,精密稱定,置于 5 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻線,搖勻,制成各對(duì)照品貯備液。精密移取各儲(chǔ)備液適量至同一量瓶中,甲醇溶解并定容至刻線,搖勻,制成混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取女貞子和墨旱蓮藥材粉末各約0.5 g,置于50 mL具塞錐形瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液20 mL,稱質(zhì)量,超聲30 min后,放冷至室溫,再次稱質(zhì)量,并用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻。上清液經(jīng)過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件

2.2.1 指紋圖譜色譜條件 色譜柱:ZORBAX Extend C18(4.6 mm×250 mm,5 μm), 流動(dòng)相:乙腈(A)-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液(B),梯度洗脫程序: 0～5 min: 12%A, 5～38 min: 12%～25%A, 38～49 min: 25%～26%A, 49～58 min: 26%～30%A, 58～60 min: 30%A, 流速:1.0 mL·min-1, 檢測波長:265 nm, 柱溫: 35 ℃, 進(jìn)樣量: 10 μL。

2.2.2 化學(xué)成分鑒定的色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm), 流動(dòng)相:乙腈(A)-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液(B),梯度洗脫程序: 0～3 min: 5%～10%A, 3～5 min: 10%～15%A, 5～20 min: 15%～20%A, 20～40 min: 20%～50%A, 40～55 min: 50%～100%A, 流速:0.3 mL·min-1, 檢測波長:265 nm, 柱溫: 30 ℃, 進(jìn)樣量: 2 μL。

離子源為加熱電噴霧離子化源(H-ESI);正、負(fù)離子模式掃描;掃描范圍m/z100～1 500 Da;噴霧電壓 3.80 kV(正離子模式)、3.50 kV(負(fù)離子模式);載氣為氮?dú)?鞘氣壓力3.5 MPa(35 bar);輔助氣壓1.0 MPa(10 bar);毛細(xì)管溫度 320 ℃;輔助器加熱溫度 300 ℃。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)建立女貞子-墨旱蓮藥對(duì)的指紋圖譜;聚類分析采用SPSS 19.0軟件;正交偏最小二乘方判別分析采用SIMCA 14.1軟件;化學(xué)成分鑒定數(shù)據(jù)分析采用Xcalibur 軟件預(yù)測化學(xué)成分(美國Thermo公司)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性 吸取藥對(duì)提取溶劑(體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液)10 μL,按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析,結(jié)果表明,提取溶劑對(duì)測定樣品無干擾,方法專屬性良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取藥對(duì)提取物樣品(S1),按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。以9號(hào)峰(特女貞苷)為內(nèi)參比峰,分別計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示,各共有峰的相對(duì)峰面積RSD值均<3%,相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均<0.1%,表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥對(duì)提取物樣品(S1),按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)樣分析。以9號(hào)峰為內(nèi)參比峰,分別計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD。結(jié)果顯示,各色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD值均<4.2%,相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均<0.3%,表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥對(duì)提取物樣品(S1),按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件下分別于 0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。以9號(hào)峰為內(nèi)參比峰,分別計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示,各色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD值均<4.2%,相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均<0.25%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 不同產(chǎn)地女貞子-墨旱蓮指紋圖譜的建立

2.5.1 色譜圖建立 取各女貞子-墨旱蓮藥對(duì)提取物各批次樣品(S1～S15),按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件測定,記錄色譜圖。

2.5.2 內(nèi)參比峰的選擇 在藥對(duì)指紋圖譜中,9號(hào)峰(特女貞苷)出峰時(shí)間適中,峰面積穩(wěn)定,峰型和分離度較好,因此本文選定9號(hào)峰為內(nèi)參比峰。

2.5.3 共有峰的確立 將15批女貞子-墨旱蓮藥對(duì)樣品的HPLC指紋圖譜的AIA格式文件導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”,選定S1作為參照?qǐng)D譜,時(shí)間窗口設(shè)為0.3 min,采用中位數(shù)法和多點(diǎn)矯正生成15批藥對(duì)的共有模式色譜圖。色譜峰匹配共得到16個(gè)共有峰,15批女貞子-墨旱蓮藥對(duì)樣品的HPLC色譜疊加圖,如圖1所示。

圖1 15 批女貞子-墨旱蓮藥對(duì)藥材 HPLC 指紋圖譜疊加圖Fig.1 HPLC fingerprints of 15 batches of herb pair of Fructus Ligustri Lucidi and Ecliptae Herba

2.5.4 共有峰的指認(rèn) 取混合對(duì)照品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)樣分析,結(jié)果與藥對(duì)樣品指紋圖譜中的相應(yīng)色譜峰進(jìn)行比較,指認(rèn)了其中7個(gè)色譜峰,分別為蘆丁(5號(hào)峰)、木犀草苷(7號(hào)峰)、特女貞苷(9號(hào)峰)、木犀草素(11號(hào)峰)、女貞苷G13(12號(hào)峰)、蟛蜞菊內(nèi)酯(13號(hào)峰)和芹菜素(16號(hào)峰)?；旌蠈?duì)照品和供試品比對(duì)圖見圖2。

注:5號(hào)峰為蘆丁;7號(hào)峰為木犀草苷;9號(hào)峰為特女貞苷;11號(hào)峰為木犀草素;12號(hào)峰為女貞苷G13;13號(hào)峰為蟛蜞菊內(nèi)酯;16號(hào)峰為芹菜素圖2 對(duì)照品溶液色譜圖(A)及供試品溶液色譜圖(B)Fig.2 HPLC of mixed control solution(A) and herb pair of Fructus Ligustri Lucidi and Ecliptae Herba(B)

2.5.5 相似度計(jì)算 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”對(duì)15批女貞子-墨旱蓮藥對(duì)樣品的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果15批樣品相似度在0.865～0.992之間,相似度結(jié)果如表 3所示。提示不同來源的女貞子-墨旱蓮藥對(duì)組合的質(zhì)量存在一定的差異。

表3 不同批次女貞子-墨旱蓮藥對(duì)的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Similarities of 15 batches of herb pair of Fructus Ligustri Lucidi and Ecliptae Herba

2.6 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.6.1 聚類分析 采用 SPSS19.0 軟件,以女貞子-墨旱蓮藥對(duì)的16個(gè)共有峰的“峰面積/稱樣量”為變量,采用組間連接方法對(duì)15批藥對(duì)進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖3?？梢?當(dāng)判別條件距離為10 時(shí),15批女貞子-墨旱蓮藥對(duì)被分為3組,其中,S1、S3、S5、S7、S10、S12、S14批次為一組,S2、S4、S9、S11、S13為一組,S6、S8、S15為一組,表明不同產(chǎn)地的女貞子-墨旱蓮藥對(duì)的質(zhì)量存在一定差異,這與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果是一致的。

圖3 女貞子-墨旱蓮藥對(duì)樣品聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of 15 batches of herb pair of Fructus Ligustri Lucidi and Ecliptae Herba

2.6.2 偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA) 建立OPLS-DA模型篩選差異性化學(xué)成分,得分圖見圖4。由結(jié)果可知,S1、S3、S5、S7、S10、S12、S14批次分布在一組,S2、S4、S9、S11、S13分布在一組,S6、S8、S15分布在另一組,與聚類分析結(jié)果一致。結(jié)合R2X、R2Y和Q2三個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)評(píng)價(jià)OPLS-DA模型質(zhì)量,其中R2X=0.966,提示X矩陣結(jié)實(shí)率較高;Q2=0.657,提示模型具有較強(qiáng)的預(yù)測能力,2組樣本具有明確分離的趨勢;R2Y=0.553,即共有峰的變化(自變量)對(duì)產(chǎn)生分類(因變量)的解釋能力為55.3%,模型具有較高的擬合度。

圖4 15批次女貞子-墨旱蓮藥對(duì)樣品的 OPLS-DA 得分圖Fig.4 OPLS-DA score plots of 15 batches of herb pair of Fructus Ligustri Lucidi and Ecliptae Herba

為了判斷各變量對(duì)于藥對(duì)分組之間分類差異的重要性,本文提取了OPLS-DA模型中16個(gè)變量的變量投影重要性(VIP)圖,結(jié)果如圖5所示,并對(duì)16個(gè)共有峰進(jìn)行VIP值大小排序。以VIP>1.2作為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)分類結(jié)果貢獻(xiàn)較大的變量進(jìn)行篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn),3個(gè)變量是造成藥對(duì)各個(gè)分組之間差異的主要原因,它們分別是7號(hào)峰(VIP=1.601 02)、13號(hào)峰(VIP=1.423 77)、11號(hào)峰(VIP=1.256 31),后經(jīng)對(duì)照品比對(duì),7號(hào)峰、13號(hào)峰和11號(hào)峰分別為木犀草苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和木犀草素。提示這些化學(xué)成分是造成藥對(duì)提取物質(zhì)量差異的主要原因。

注:X1～X16.1～16號(hào)峰圖5 各批次女貞子-墨旱蓮樣品16個(gè)共有峰的VIP值Fig.5 VIP values of 16 common peaks in 15 batches of herb pair of Fructus Ligustri Lucidi and Ecliptae Herba

2.7 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS法鑒定女貞子-墨旱蓮藥對(duì)的化學(xué)成分

取女貞子-墨旱蓮藥對(duì)樣品(S1)適量,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件測定,分別進(jìn)行正、負(fù)離子全掃描得對(duì)應(yīng)的總離子流圖(Total ion chromatogram,TIC 圖),見圖6～7。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Xcalibur 軟件,通過高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析與對(duì)照品及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)從女貞子-墨旱蓮藥對(duì)樣品中共鑒別了55個(gè)化合物[15-21]。其中包含黃酮類化合物18 個(gè)、環(huán)烯醚萜類化合物16個(gè)、酚酸類化合物5個(gè)、苯乙醇苷類化合物5個(gè)、有機(jī)酸類化合物4個(gè)、香豆素類化合物3個(gè)、三萜類化合物3個(gè)、氨基酸類化合物1,詳細(xì)數(shù)據(jù)見表 4。通過與對(duì)照品的保留時(shí)間、精確分子量以及二級(jí)碎片離子數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,準(zhǔn)確鑒定了7種成分,其中黃酮類化合物 4個(gè),分別是蘆丁(峰13)、木犀草苷(峰16)、木犀草素(峰41)、芹菜素(峰46);環(huán)烯醚萜類化合物2個(gè),分別是特女貞苷(峰21)和女貞苷G13(峰47);香豆素類化合物1個(gè),為蟛蜞菊內(nèi)酯(峰44)。依據(jù)未知化合物的色譜保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、二級(jí)碎片信息結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),推測了另外48種化合物的元素組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖6 女貞子-墨旱蓮藥對(duì)供試品溶液在正離子模式下的總離子流色譜圖Fig.6 TIC of herb pair of Fructus Ligustri Lucidi-Ecliptae Herba in positive ion mode

圖7 女貞子-墨旱蓮藥對(duì)供試品溶液在負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖Fig.7 TIC of herb pair of Fructus Ligustri Lucidi-Ecliptae Herba in negative ion mode

表4 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 鑒定的女貞子-墨旱蓮藥對(duì)提取物中的化學(xué)成分Table 4 The chemical constituents in herb pair of Fructus Ligustri Lucidi-Ecliptae Herba identified by UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS

(續(xù)表一)

2.7.1 黃酮類化合物的質(zhì)譜解析 黃酮類化合物主要裂解方式是C環(huán)的RDA裂解,從而產(chǎn)生2個(gè)碎片離子,在質(zhì)譜條件下經(jīng)能量碰撞會(huì)失去H2O、CO2、CO 等一系列中性小分子。藥對(duì)提取物中鑒別出的黃酮類成分主要有:蘆丁、木犀草苷、木犀草素、芹菜素等。

化合物13的保留時(shí)間為8.77 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z611.160 66(測量誤差-0.83×10-6)和[M-H]-m/z609.146 61(測量誤差-0.37×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C27H30O16。然后,對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z301.034 33 [M-H-C12H20O9]-,m/z273.038 76 [M-H-C13H20O10]-,m/z255.031 32 [M-H-C13H22O11]-,m/z151.002 66 [M-H-C20H26O12]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22],經(jīng)與對(duì)照品比對(duì),確認(rèn)該化合物為蘆丁,其裂解方式見圖8。

圖8 蘆丁二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.8 Fragment ion spectrum and cleavage mode of Rutin

化合物16的保留時(shí)間為9.47 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z449.107 48(測量誤差-1.06×10-6)和[M-H]-m/z447.093 81(測量誤差0.31×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C21H20O11。然后,對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z327.051 27 [M-H-C4H8O4]-,m/z285.040 50 [M-H-C6H10O5]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23],經(jīng)與對(duì)照品比對(duì),確認(rèn)該化合物為木犀草苷,其裂解方式見圖9。

圖9 木犀草苷二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.9 Fragment ion spectrum and cleavage mode of Luteoloside

化合物42的保留時(shí)間為21.40 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z287.054 75(測量誤差-0.71×10-6)和[M-H]-m/z285.040 99(測量誤差1.51×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C15H10O6。然后,對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z267.030 94 [M-H-H2O]-,m/z257.044 80 [M-H-CO]-,m/z241.049 91 [M-H-CO2]-,m/z151.002 99 [M-H-C8H6O2]-,m/z133.028 49 [M-H-C7H4O4]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24],經(jīng)與對(duì)照品比對(duì),確認(rèn)該化合物為木犀草素,其裂解方式見圖10。

圖10 木犀草素二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.10 Fragment ion spectrum and cleavage mode of Luteolin

化合物46的保留時(shí)間為26.07 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z271.262 73(測量誤差-0.49×10-6)和[M-H]-m/z269.046 08(測量誤差1.87×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C21H20O11。然后,對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z225.055 53 [M-H-CO2]-,m/z183.044 59 [M-H-C3H2O3]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[25],經(jīng)與對(duì)照品比對(duì),確認(rèn)該化合物為芹菜素,其裂解方式見圖11。

圖11 芹菜素二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.11 Fragment ion spectrum and cleavage mode of Apigenin

2.7.2 環(huán)烯醚萜類化合物的質(zhì)譜解析 環(huán)戊并吡喃是裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物的特征結(jié)構(gòu),側(cè)鏈上的官能團(tuán)常以CH3OH、H2O、CO2和糖分子的形式丟失。藥對(duì)提取物中鑒別出的環(huán)烯醚萜類成分主要有:特女貞苷、女貞苷G13、橄欖苦苷等。

化合物21的保留時(shí)間為10.73 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z687.245 73(測量誤差3.09×10-6)和[M-H]-m/z685.250 43(測量誤差0.62ppm), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C31H42O17。然后,對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z523.181 88 [M-H-Glc]-,m/z453.141 14 [M-H-C10H16O6]-,m/z421.153 05 [M-H-Glc-C4H6O3]-,m/z299.113 83 [M-H-C17H22O10]-,m/z223.061 51 [M-H-Glc-C14H20O7]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26],經(jīng)與對(duì)照品比對(duì),確認(rèn)該化合物為特女貞苷,其裂解方式見圖12,是女貞子中主要成分。

圖12 特女貞苷二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.12 Fragment ion spectrum and cleavage mode of Specnuezhenide

化合物47的保留時(shí)間為26.35 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z1 073.373 17(測量誤差3.09×10-6)和[M-H]-m/z1 071.368 29(測量誤差0.78×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C48H64O27。然后,對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z909.295 65 [M-H-Glc]-,m/z839.263 61 [M-H-Glc-C4H6O]-,m/z685.234 62 [M-H-Glc-C11H12O5]-,m/z523.184 63 [M-H-C23H32O15]-,m/z403.124 15 [M-H-C31H40O16]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26],經(jīng)與對(duì)照品比對(duì),確認(rèn)該化合物為女貞苷G13,其裂解方式見圖13。

圖13 女貞苷G13二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.13 Fragment ion spectrum and cleavage mode of GL3

2.7.3 香豆素類化合物的質(zhì)譜解析 香豆素類化合物結(jié)構(gòu)與雌二醇相似,結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯和呋喃骨架容易發(fā)生CO2和 CO 的中性丟失。藥對(duì)提取物中鑒別出的香豆素類成分主要有:蟛蜞菊內(nèi)酯、去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯。

化合物44的保留時(shí)間為23.30 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z315.049 53(測量誤差-2.52×10-6)和[M-H]-m/z313.036 16(測量誤差0.56×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C16H10O7。對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z315.049 53 [M+H]+,m/z297.039 06 [M+H-H2O]+,m/z271.059 36 [M+H-CO2]+,m/z269.044 22 [M+H-CH2O2]+,m/z287.054 87 [M+H-CO]+,m/z243.064 79 [M+H-C2O3]+。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16],經(jīng)與對(duì)照品比對(duì),確認(rèn)該化合物為蟛蜞菊內(nèi)酯,是墨旱蓮中主要成分,其裂解方式見圖14。

圖14 蟛蜞菊內(nèi)酯二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.14 Fragment ion spectrum and cleavage mode of Wedelolactone

2.7.4 酚酸類化合物的質(zhì)譜解析 酚酸類化合物主要發(fā)生CO2、H2O中性分子的丟失。藥對(duì)提取物中鑒別出的香豆素類成分主要有:綠原酸、新綠原酸、異綠原酸C等。

化合物37的保留時(shí)間為14.79 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z517.134 05(測量誤差-0.04×10-6)和[M-H]-m/z515.119 39(測量誤差0.84×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C25H24O12。對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z353.088 23[M-H-C9H6O3]-,m/z191.055 30 [M-H-C18H12O6]-,m/z179.034 41 [M-H-C16H16O8]-,m/z173.044 72 [M-H-C18H14O7]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[27],推測該化合物為異綠原酸C,其裂解方式見圖15。

圖15 異綠原酸C二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.15 Fragment ion spectrum and cleavage mode of Isochlorogenic acid C

2.7.5 苯乙醇苷類化合物的質(zhì)譜解析 苯乙醇苷類化合物是一類以取代苯乙醇為苷元的苷,其成苷的中心葡萄糖基常連有芳香?；Ｋ帉?duì)提取物中鑒別出的苯乙醇苷類成分主要有:松果菊苷、毛蕊花糖苷、紅景天苷等。

化合物10的保留時(shí)間為7.31 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z787.265 52(測量誤差-1.26×10-6)和[M-H]-m/z785.252 44(測量誤差1.17×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C35H46O20。對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z623.221 25[M-H-C6H10O5]-,m/z221.901 37 [M-H-C27H32O13]-,m/z161.023 54 [M-H-C26H40O17]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[28],推測該化合物為松果菊苷,其裂解方式見圖16。

圖16 松果菊苷二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.16 Fragment ion spectrum and cleavage mode of Echinacoside

化合物20的保留時(shí)間為10.69 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z625.212 69(測量誤差-2.03×10-6)和[M-H]-m/z623.198 85(測量誤差0.55×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C29H36O15。對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z461.165 65 [M-H-C9H6O3]-,m/z315.950 96 [M-H-C15H16O7]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[28],推測該化合物為毛蕊花糖苷,其裂解方式見圖17。

圖17 毛蕊花糖苷二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.17 Fragment ion spectrum and cleavage mode of Acteoside

2.7.6 氨基酸類化合物的質(zhì)譜解析 氨基酸是一類既含氨基又含羧基的化合物,氨基酸類化合物在裂解時(shí)一般會(huì)丟失NH3、H2O、HCOOH等特征碎片。藥對(duì)提取物中鑒別出的氨基酸類成分有D-(+)-色氨酸。

化合物4的保留時(shí)間為3.69 min, 在正、負(fù)離子一級(jí)全掃描模式下分別檢測到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z205.082 60(測量誤差-0.01×10-6)和[M-H]-m/z203.082 86(測量誤差3.19×10-6), Xcalibur 軟件預(yù)測其元素組成為C11H12O2N2。對(duì)其[M-H]-峰進(jìn)行裂解,得到相關(guān)的二級(jí)碎片離子m/z159.092 75 [M-H-CO2]-,m/z142.065 37 [M-H-CH3ON2]-,m/z116.049 43 [M-H-C3H5O2N]-。該化合物的裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[29],推測該化合物為D-(+)-色氨酸,其裂解方式見圖18。

圖18 D-(+)-色氨酸二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式Fig.18 Fragment ion spectrum and cleavage mode of D-(+)tryptophan

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在樣品提取過程中,考查了超聲提取和回流提取,超聲提取的效率優(yōu)于回流提取。提取溶劑考察結(jié)果表明,以60%甲醇[30]為提取溶劑時(shí)各成分綜合提取率明顯高于以純水、30%、40%、50%甲醇和60%乙醇提取;提取溶劑體積考察結(jié)果表明,發(fā)現(xiàn)提取溶劑體積為 20 mL時(shí)各成分較提取溶劑為10 mL時(shí)提取完全,且增加提取溶劑至30 mL 和50 mL,各成分提取效率基本不變;提取時(shí)間考察結(jié)果表明,提取時(shí)間為30 min 時(shí),效果最佳。

本實(shí)驗(yàn)指紋圖譜研究中,通過DAD檢測器進(jìn)行200～400 nm的全波長掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在265 nm波長處,基線平穩(wěn),大多數(shù)化合物具有較好的響應(yīng),故設(shè)置265 nm為檢測波長;洗脫系統(tǒng)考察結(jié)果表明,在檢測波長下,乙腈-水系統(tǒng)較甲醇-水系統(tǒng)可獲得更多的色譜峰,且基線更平穩(wěn)。酸性添加劑的考察結(jié)果表明, 水相中添加0.1%甲酸作為流動(dòng)相洗脫時(shí)各成分色譜峰分離度符合要求,且各色譜峰出峰時(shí)間適中;柱溫考察結(jié)果表明,柱溫35 ℃ 時(shí)分離度和峰形較25、30、40 ℃時(shí)好;流速考察結(jié)果表明,流速為1.0 mL·min-1時(shí)各峰的分離度較流速為0.8、0.9、1.2 mL·min-1時(shí)好,分析時(shí)間亦合適。

本實(shí)驗(yàn)建立的女貞子-墨旱蓮藥對(duì)提取物的HPLC指紋圖譜,建立16個(gè)共有峰并指認(rèn)特女貞苷(女貞子藥典規(guī)定的質(zhì)量控制指標(biāo))、蟛蜞菊內(nèi)酯(墨旱蓮藥典規(guī)定的質(zhì)量控制指標(biāo))等7個(gè)化學(xué)成分。綜合運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)、聚類分析和正交偏最小二乘方判別分析等多種統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)不同批次藥對(duì)提取物的指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明15批樣品質(zhì)量較為穩(wěn)定,相似度在0.865～0.992之間。聚類分析和正交偏最小二乘方判別分析均將15批樣品分為3類:S1、S3、S5、S7、S10、S12及S14為第Ⅰ類,S2、S4、S9、S11及S13為第Ⅱ類,S6、S8、S15為第Ⅲ類。建立的正交偏最小二乘法判別分析模型穩(wěn)定可靠,將三類明顯區(qū)分,并篩選出7號(hào)峰、13號(hào)峰和11號(hào)峰為造成各產(chǎn)地藥材質(zhì)量差異的特征色譜峰。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析,是一種快速、有效、合理的方法,為評(píng)價(jià)女貞子-墨旱蓮藥對(duì)藥材的整體質(zhì)量控制和臨床研究提供依據(jù)。

本文采用具有較強(qiáng)分離、檢測能力的 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 聯(lián)用技術(shù)鑒定女貞子-墨旱蓮藥對(duì)提取物的化學(xué)成分,根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量、多級(jí)質(zhì)譜碎片信息、對(duì)照品比對(duì)及文獻(xiàn)報(bào)道,借助軟件預(yù)測其分子式,共鑒定出55個(gè)化合物,主要包括黃酮類、環(huán)烯醚萜類、酚酸類、香豆素類、三萜類等。同時(shí)結(jié)合對(duì)照品對(duì)指紋圖譜指認(rèn)的7個(gè)化合物加以驗(yàn)證,并推斷可能的裂解方式,根據(jù)質(zhì)荷比文獻(xiàn)報(bào)道等推測其他48個(gè)化學(xué)成分,從而較為全面地覆蓋藥對(duì)的成分信息。目前有關(guān)二至丸UPLC-MS針對(duì)化學(xué)成分方面的研究,多數(shù)均針對(duì)于單味藥材,女貞子或墨旱蓮進(jìn)行成分鑒定,相比較于已有報(bào)道,本文針對(duì)的是2味藥材組成的藥對(duì)開展的成分鑒定,可為后續(xù)二至丸制劑的成分體內(nèi)研究和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。