王永泰　王　炎　楊　朝　高集源　王雙凱　劉召娜

豆腐柴果實中黃酮類成分的電化學檢測

王永泰王炎楊朝高集源王雙凱劉召娜

（西安培華學院醫(yī)學院陜西西安710125）

豆腐柴的根、莖、葉、果實中不僅含有大量的果膠、粗纖維、蛋白質(zhì)，而且含有豐富的礦物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)，具有很高的藥用價值。目前對豆腐柴的研究主要集中在其根、莖、葉上，而對其果實的研究較少。文章采用乙醇回流、石油醚萃取的方法對豆腐柴果實中的黃酮類成分進行提取，通過電化學法對所提取的黃酮類成分進行檢測。

豆腐柴；果實；總黃酮；電化學法；檢測

豆腐柴（Turcz.）全身都是寶，其根、莖、葉、果實都具有較好的開發(fā)利用價值。豆腐柴葉顏色翠綠，葉汁凝膠持水力強、黏彈性好[1]，含有大量的粗纖維、果膠、維生素C和氨基酸等[2-3]，可被制作成柴豆腐[4]，具有較高的營養(yǎng)價值。除此之外，豆腐柴莖葉提取物有抗炎、鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)、保護坐骨神經(jīng)和治療軟組織損傷的作用[5-6]。如以豆腐柴為主要原料制備的復方豆腐柴搽劑具有明顯的消腫、止痛、抗炎和增強免疫的功能。在廣西，豆腐柴已被制作成健骨注射液，用來治療肥大性脊椎炎、風濕性關節(jié)炎、肩周炎等多種骨科疾病。豆腐柴的這些功能可能和其所含有的黃酮類成分有關[7-8]。黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，具有降壓、抗癌、抗炎以及降血糖等藥理活性。

目前對于豆腐柴中的黃酮類成分的研究主要集中在其根、莖、葉上[9]，而豆腐柴果實中的活性成分及其藥理作用還沒有被很好地挖掘出來。因此，本研究對豆腐柴果實中的黃酮類成分進行提取和檢測，挖掘豆腐柴果實的藥用價值，為合理地開發(fā)利用豆腐柴資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：豆腐柴果實，2022年7月采于陜西省。

化學試劑：無水乙醇、石油醚、氫氧化鈉、磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸、濃鹽酸、鋅粉、鎂粉等，均為分析純。

1.2 儀器設備

提取和檢測所用儀器設備：高速萬能粉碎機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵、電化學分析儀（CHI660）、調(diào)溫電熱套、金相砂紙、超聲清洗儀、超純水機。

1.3 試劑配制

蘆丁標準溶液配制：稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.02 g置于小燒杯中，用體積分數(shù)為75%的乙醇進行溶解，定容至50 mL容量瓶中，得到蘆丁標準溶液（4 ℃冰箱避光保存）。

pH為2的磷酸鹽緩沖液配制：稱取磷酸58.5 g、磷酸二氫鈉48 g，在充分攪拌的情況下，加水定容至1 L得到pH為2的磷酸鹽緩沖液。

1.4 實驗方法

1.4.1 豆腐柴果實中總黃酮提取液的制備

將新鮮采摘的豆腐柴果實洗凈、晾曬、烘干（50 ℃）至恒重，用粉碎機粉碎，將粉碎后的豆腐柴粉末收集備用。稱取豆腐柴果實粉末15.00 g，加入體積分數(shù)為75%的乙醇150 mL，搭建回流裝置，加熱回流提取1 h。然后進行抽濾，收集濾液。將濾渣再加入圓底燒瓶中，加入體積分數(shù)為75%的乙醇150 mL，用上述同樣方法加熱回流提取1 h，抽濾，將兩次濾液合并，棄去濾渣。將合并的濾液倒入500 mL圓底燒瓶中，放置在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行提取凝縮至90 mL左右，停止加熱。再用石油醚進行萃取，靜止10 min使其分層，下端液體放出，則得到豆腐柴果實總黃酮提取液。將提取液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，并用體積分數(shù)為60%的乙醇進行定容，保存?zhèn)溆茫? ℃冰箱進行保存）。

1.4.2 顯色反應

為了確定提取液中是否含有黃酮類成分，利用鹽酸鎂粉反應對本提取液進行檢測。這一反應是鑒定黃酮類化合物最常用的顯色反應。該方法步驟是先加入鎂粉（或鋅粉）振搖，然后再加入濃鹽酸。大多數(shù)黃酮類化合物、類黃酮、二氫黃酮和二氫黃酮醇反應后會顯現(xiàn)橙紅色至紫紅色，少數(shù)顯現(xiàn)紫色或藍色。當其B環(huán)有羥基（—OH）或甲氧基（—OCH3）取代時，顏色會變深。取5 mL豆腐柴提取液放入試管中，用藥匙取半勺鎂粉加入其中，輕微振搖，再加入少許濃鹽酸，觀察提取液的顏色變化。

1.4.3 電化學法檢測蘆丁標準曲線建立

電化學實驗采用三電極體系，以玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極和鉑電極作為對電極。用金相砂紙對玻碳電極表面進行打磨拋光處理，再進行超聲清洗3 min，自然晾干。取50 mL磷酸鹽緩沖液（pH=2），倒入電解池中。將三電極體系電極插入電解池中（在電解液表面以下1 cm）。取上述蘆丁標準溶液以每30 μL的梯度加入電解液中（0、30、60、90、120、150、180 μL），觀察電極產(chǎn)生的氧化還原峰電流強度。以峰電流值（A）為縱坐標，以蘆丁標準品的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 電化學法檢測蘆丁標準曲線的建立

蘆丁作為黃酮類物質(zhì)的標準品，本實驗將利用電化學法建立檢測蘆丁的標準曲線[10-12]。電化學法是利用玻碳電極作為工作電極，以磷酸鹽溶液作為緩沖液，通過加入蘆丁標準品進行電化學檢測。蘆丁的化學式如圖1，它含有5-羥基黃酮和鄰位二元醇結(jié)構，可以與不同的金屬離子形成特定位點的復合物，蘆丁含有電活性基團，具有良好的電化學信號，這是因為蘆丁的B環(huán)的羥基能夠發(fā)生氧化反應，生成苯醌式結(jié)構[10]。蘆丁標準品在玻碳電極上會有良好電化學信號。

圖1　蘆丁B環(huán)上的3′和4′位置羥基發(fā)生的氧化反應

在pH為2的磷酸鹽緩沖溶液中，利用玻碳電極作為工作電極建立蘆丁標準品檢測的標準曲線。如圖2所示，掃描電位區(qū)間是0～0.8 V，掃描速度為0.05 V/s。可以觀察到在電位0.5～0.6 V時有一對可逆的氧化還原峰。在0.55 V處出現(xiàn)一個較好的還原峰，在0.57 V處出現(xiàn)一個氧化峰，對應著蘆丁的氧化還原反應。隨著蘆丁的質(zhì)量濃度在2.4×10-4～14.4×10-4mg/mL范圍變化，其位于0.55 V處的還原峰電流不斷增大，位于0.57 V的氧化峰電流也不斷增大。這說明蘆丁在玻碳電極上的氧化還原信號隨著其質(zhì)量濃度的增大而增大，具有良好的響應信號。將不同質(zhì)量濃度下的氧化峰電流與質(zhì)量濃度進行數(shù)據(jù)分析總結(jié)，可以得到表1。

圖2　玻碳電極在含有一系列不同質(zhì)量濃度蘆丁標準品的磷酸鹽緩沖液（pH=2）中的循環(huán)伏安圖

（注：掃描速度為0.05 V/s）

表1　不同質(zhì)量濃度的蘆丁標準品產(chǎn)生的氧化峰相對電流

根據(jù)蘆丁標準品質(zhì)量濃度與其在玻碳電極上產(chǎn)生的氧化峰電流的關系，繪制出標準曲線如圖3所示，測定蘆丁標準品線性回歸方程為（μA）=0.183 3（10-4mg/mL）+0.99，2=0.991 5。蘆丁標準品質(zhì)量濃度在2.4×10-4～14.4×10-4mg/mL范圍時，氧化峰電流與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關系。因此，可以利用該線性關系對豆腐柴果實中的黃酮類成分進行檢測。

圖3　玻碳電極檢測蘆丁標準品的氧化峰相對電流與質(zhì)量濃度之間的線性關系

2.2 豆腐柴果實中黃酮類成分的檢測

2.2.1 顯色反應

本實驗豆腐柴果實中的黃酮類成分是采用加熱回流法進行提取的。為了確定提取液中是否含有黃酮類成分，首先利用鹽酸鎂粉反應對提取液進行檢測，取5 mL豆腐柴果實總黃酮提取液放入試管中，用藥匙取半勺鎂粉加入，輕微振搖，再加入少許濃鹽酸，溶液由黃色變成紅色（見圖4），證明該提取液中含有黃酮類成分。然后，再進一步對提取液中的黃酮類成分進行檢測。

圖4　豆腐柴果實提取物的鹽酸鎂粉顯色反應

2.2.2 電化學法檢測豆腐柴果實提取液中黃酮類成分的含量

取10 μL豆腐柴果實提取液，加到50 mL磷酸鹽緩沖液中，利用玻碳電極在相同的條件下進行電化學實驗測試，得到氧化峰電流為3.1 μA，根據(jù)蘆丁標準曲線計算得出50 mL磷酸鹽緩沖液中黃酮類成分的質(zhì)量濃度為11.5×10-4mg/mL，通過計算可得15 g豆腐柴果實中黃酮類成分的質(zhì)量分數(shù)為3.8%。

為了驗證該實驗方法是否準確，實驗中對樣品進行了電化學法的加標回收實驗。取一定量的豆腐柴果實提取液，加入一定量的蘆丁標準品溶液，搖勻，按樣品測定方法測定，計算回收率（= 4），結(jié)果平均回收率為100.9%，表明該方法較準確可靠。

3 結(jié)論

為了檢測豆腐柴果實中黃酮類成分的含量，本研究采用加熱回流提取法對豆腐柴果實中黃酮類成分進行提取，并利用電化學法對豆腐柴果實中黃酮類成分進行檢測。蘆丁標準品質(zhì)量濃度在2.4×10-4～14.4×10-4mg/mL范圍時，電化學信號與其質(zhì)量濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關系。因此，利用該線性關系對豆腐柴果實中的黃酮類成分進行檢測，結(jié)果表明豆腐柴果實中黃酮類成分的質(zhì)量分數(shù)為3.8%。電化學法具有成本低、簡便、快速的優(yōu)點，可以用于黃酮類物質(zhì)的檢測。

[1]徐安書. 豆腐柴葉凝膠的影響因素研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2022，50（2）：172-175.

[2]陳磊，周忠雨，王曉瓊，等. 豆腐柴中功能性成分提取及產(chǎn)品開發(fā)的研究進展[J]. 食品研究與開發(fā)，2021，42（7）：209-214.

[3]趙若寒，劉佳奇，張藝，等. 豆腐柴果膠凝膠特性及其凝膠食品應用[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2022，34（9）：2013-2019.

[4]李剛鳳，嚴紅波，康明，等. 豆腐柴葉豆腐的加工工藝優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā)，2017，38（14）：68-74.

[5]曾奕秀，劉振軍，熊雙麗. 堿水提取豆腐柴葉總黃酮工藝及其抗氧化活性[J]. 糧食與油脂，2020，33（8）：81-85.

[6]張建設，邱林，王曉云，等. 豆腐柴研究進展與應用綜述[J]. 中國野生植物資源，2023，42（8）：64-68.

[7]汪海斌，王燕燕. 豆腐柴有效成分及藥理作用[J]. 醫(yī)藥導報，2015（4）：492-494.

[8]王海潮，曹穩(wěn)根，張興桃，等. 索氏提取法提取豆腐柴根莖葉中的總黃酮[J]. 光譜實驗室，2013，30（5）：2428-2432.

[9]朱柳玲，董海青. 豆腐柴的開發(fā)利用[J]. 新農(nóng)村，2021（10）：8-9.

[10]華俊，何曉英，廖鈁，等. 蘆丁的方波溶出伏安行為及其分析檢測[J]. 電化學，2008，14（1）：87-90.

[11]王春艷，周健. 電化學在黃酮類化合物含量檢測中的應用[J]. 宜春學院學報，2021，43（3）：29-33.

[12]賴紅偉，舒適，薛夢蝶，等. 電化學法快速測定芹菜總黃酮含量[J]. 食品研究與開發(fā)，2018，39（16）：130-133.

10.3969/j.issn.2095-1205.2024.03.28

TQ28

B

2095-1205(2024)03-89-04

西安培華學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目“豆腐柴果實中黃酮類化學成分研究”（PHDC2022070）

王永泰（2000—），男，漢族，甘肅定西人，本科在讀，研究方向為藥學。

劉召娜（1983—），女，漢族，山東日照人，博士研究生，副教授，研究方向為藥物分析與檢測。