符彬彬 李清春 和軍飛 盧世豪 陳鑫 何凡 祁夢(mèng)凡 張化鵬 魯慧文 黃濤

摘要：目的 為探究核心蛋白聚糖（DCN）基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)大白母豬繁殖性能的影響。方法 利用DNA混池測(cè)序，確定DCN基因的SNPs，采用GenoPlexs基因分型技術(shù)對(duì)316頭大白母豬群進(jìn)行基因分型，并與大白母豬的繁殖性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果 在DCN基因內(nèi)含子4和外顯子4分別鑒定到rs346372784（C/T）和rs55618082（C/A）突變位點(diǎn)。其中，rs55618082（C/A）發(fā)生同義突變后導(dǎo)致DCN基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能發(fā)生變化。rs346372784（C/T）位點(diǎn)對(duì)大白母豬母系指數(shù)、繁殖指數(shù)、初生重、總仔數(shù)EBV、活仔數(shù)EBV有極顯著影響（P<0.01），對(duì)乳頭數(shù)、死胎數(shù)、活仔數(shù)有顯著影響（P<0.05）。rs55618082（C/A）位點(diǎn)對(duì)母系指數(shù)、繁殖指數(shù)、乳頭數(shù)、妊娠期、初生重、總仔數(shù)EBV、活仔數(shù)EBV有極顯著影響（P<0.01）。結(jié)論 DCN基因rs346372784（C/T）和rs55618082（C/A）突變影響大白豬的繁殖性能，可用于大白豬的標(biāo)記輔助選育。

關(guān)鍵詞：大白豬；DCN基因；多態(tài)性；繁殖性狀

中圖分類(lèi)號(hào)：S828.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

Effects of DCN gene polymorphisms on the reproductive performance of Yorkshire

Pigs

FU? Binbin1，LI? Qingchun1，HE? Junfei1， 2，LU? Shihao1，CHEN? Xin1，HE? Fan1，QI? Mengfan1，ZHANG? Huapeng1，LU? Huiwen2，HUANG? Tao1，2*

（1 College of Animal Science and Technology， Shihezi University，Shihezi， Xinjiang 832000， China; 2 Xinjiang Pig Breeding

Engineering and Technology Research Center，Changji， Xinjiang 831100， China）

Abstract：? Objectives To investigate the influence of single nucleotide polymorphisms （SNPs） within the Decorin （DCN） gene on the reproductive traits of Yorkshire sows. Methods The SNPs of DCN gene was determined by sequencing PCR product of mixed-pool DNA， and GenoPlexs genotyping technology was utilized to genotype a population of 316 Yorkshire sows

and to analyze the association with reproductive performance of Yorkshire sows.

Results Two mutation sites， rs346372784（C/T） in intron 4 and rs55618082（C/A） in exon 4 of the DCN gene， were identified in this study. rs55618082（C/A） exhibited a synonymous mutation， leading to changes in the secondary structure and free energy of the DCN gene mRNA. The rs346372784（C/T） locus exhibited highly significant effects on maternal index， reproductive index， teat number， birth weight， EBV of total litter size （P<0.01）， and EBV of numberborn alive in Yorkshire sows， as well as significant effects on stillbirths， and live piglet numbers （P<0.05）. The rs55618082（C/A） locus showed highly significant effects on with maternal index， reproductive index， teat number， gestation length， birth weight， EBV of total number born， and EBV of number born alive （P<0.01）. Conclusion The mutations at rs346372784（C/T） and rs55618082（C/A） in the DCN gene impact the reproductive performance of Yorkshire sows， indicating their potential as genetic markers for assisted breeding in the Yorkshire population.

Key words： Yorkshire sows;DCN gene;polymorphism;reproductive traits

核心蛋白聚糖（decorin，DCN）最早是從牛胎盤(pán)中分離得到的富含亮氨酸的小蛋白多糖，包含一個(gè)糖胺聚糖（GAG）鏈和一個(gè)核心蛋白，具有12個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列［1-2］。DCN通過(guò)與多種蛋白質(zhì)相互作用，包括生長(zhǎng)因子、酪氨酸激酶受體、細(xì)胞外基質(zhì)成分和酶，發(fā)揮多效性功能［3］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)DCN可通過(guò)抑制TGF-β通路，參與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)功能［4-5］，及哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育生長(zhǎng)發(fā)育［6］的過(guò)程。目前研究表明，DCN基因廣泛參與不同物種中卵泡發(fā)育和生長(zhǎng)調(diào)控。在山羊中，Peng［7］發(fā)現(xiàn)DCN基因可顯著增加卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡并阻斷細(xì)胞G0/G1期周期進(jìn)程。在湖羊中，Yao［8］發(fā)現(xiàn)在顆粒細(xì)胞中l(wèi)nc FDNCR作為海綿吸附miR-543-3p，反式激活miR-543-3p的靶基因的DCN基因并抑制TGF-β通路，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)DCN基因可通過(guò)TGF-β通路調(diào)控豬顆粒細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡過(guò)程［9］。以上研究均表明DCN參與調(diào)控卵泡的功能。由于卵巢是承擔(dān)哺乳動(dòng)物繁殖的重要生殖器官，表明DCN基因可能是影響豬繁殖性狀的候選基因，但目前尚未見(jiàn)該基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）對(duì)大白母豬繁殖性狀影響的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究將DCN基因多態(tài)性與大白母豬繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在為大白母豬的繁殖性能的分子標(biāo)記輔助選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取新疆某豬場(chǎng)同一批次，生長(zhǎng)表現(xiàn)良好、飼養(yǎng)條件一致且表型記錄完整的大白母豬316頭，用剪刀剪取約1cm2大小耳組織樣，放入含75%乙醇的離心管中，于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃冰箱保存。

1.2 主要儀器、試劑

1.2.1 主要儀器

PCR儀（德國(guó)，SensoQuest）、恒溫水浴鍋（中國(guó)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)，ThermoFisher Scientific）、GelDoc XR+蛋白凝膠成像分析儀（美國(guó)，Bio-Rad）等。

1.2.2 主要試劑

血液、細(xì)胞和組織DNA提取試劑盒（中國(guó)，天根生化科技有限公司）、核酸染料（中國(guó)，北京索萊寶科技有限公司）、TAE緩沖液（中國(guó)，生工生物工程股份有限公司）、2×Rapid Taq Master Mix（中國(guó)，諾唯贊生物科技股份有限公司）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

取200 mg豬耳組織樣于離心管中剪碎，參照血液、細(xì)胞和組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)提供的豬DCN基因序列（Ensembl號(hào)：ENSSSCG00000000915），采用Primier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

隨機(jī)選取檢測(cè)合格的DNA樣品10個(gè)，每個(gè)樣品取7 μL構(gòu)建DNA混池并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物濃度為10 μmol·L-1，0.8 μL；2x Taq Master Mix 15 μL；ddH2O 12.4 μL；DNA體積為1.0 μL，PCR總體積為30 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳及測(cè)序

利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，將與預(yù)期長(zhǎng)度一致的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)chromas軟件進(jìn)行分析，將正反向測(cè)序序列與Ensembl所得序列通過(guò)chromas軟件進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)基因的SNPs位點(diǎn)。

1.3.5 多態(tài)位點(diǎn)分型

DNA樣本委托石家莊博瑞迪公司利用基于多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)Geno Plexs對(duì)目標(biāo)SNPs進(jìn)行基因分型。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2021對(duì)1-3胎次的產(chǎn)仔數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，參照張琰芳等［10］的方法分析各SNPs位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率、遺傳雜合度（expected heterozygosity，He）、遺傳純合度（heterozygosity observed，Ho）等，并進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)。根據(jù)SNPs在參考基因組的位置信息，通過(guò)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)查找突變的rs號(hào)。

利用在線軟件（RNA fold web server http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）對(duì)外顯子區(qū)突變前后的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

采用SPSS 26.0的一般線性模型（General Linear Model， GLM）分析各繁殖性狀在不同基因型之間的差異（公式1），不同基因型對(duì)應(yīng)的性狀用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

Yij=μ+Gi+Pj+eij.（1）

在式中Yij為產(chǎn)仔數(shù)性狀表型值，μ為群體均值，Gi表示基因型效應(yīng)，Pj表示胎次效應(yīng)，eij表示隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

對(duì)DCN基因兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1），擴(kuò)增產(chǎn)物條帶長(zhǎng)度為651 bp和359 bp，符合預(yù)期。

2.2 DCN基因SNPs位點(diǎn)篩選

利用chromas軟件對(duì)基因測(cè)序峰圖進(jìn)行分析?? 發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNPs位點(diǎn)（圖2，表2），經(jīng)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)查找比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)分別為：rs346372784（C/T）、rs55618082（C/A），均為已知突變位點(diǎn)，其中rs55618082（C/A）為同義突變，rs346372784（C/T）為內(nèi)含子突變。

2.3 DCN基因型頻率、等位基因頻率分布及遺傳多樣性分析

由表3可知，316個(gè)DNA樣品中有2個(gè)樣品因分型失敗。2個(gè)SNP位點(diǎn)中，rs346372784（C/T）位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為T(mén)T型；rs55618082（C/A）位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為AC型?；蜻z傳多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表3，2個(gè)SNPs位點(diǎn)均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（P>0.05），其中，rs55618082（C/A）位點(diǎn)多態(tài)信息含量（PIC）為0.35屬于中度多態(tài)（0.25

2.4 DCN基因CDS區(qū)突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由圖3可知，DCN基因rs55618082（C/A）發(fā)生A>C突變后導(dǎo)致DCN基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，突變后的最小自由能為-381.10 kcal·mol-1，高于突變前的-381.70 kcal·mol-1，提示DCN基因rs55618082（C/A）發(fā)生A>C突變可能會(huì)影響其mRNA穩(wěn)定性。

2.5 DCN基因多態(tài)位點(diǎn)對(duì)大白母豬妊娠期和乳頭數(shù)的影響

rs346372784（C/T）位點(diǎn)TT型、CC型個(gè)體總?cè)轭^數(shù)顯著高于CT型個(gè)體（P<0.05）。rs55618082（C/A）位點(diǎn)AA型個(gè)體和AC型個(gè)體總?cè)轭^數(shù)分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）高于CC型個(gè)體；CC型個(gè)體妊娠期分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）高于AC型個(gè)體和AA型個(gè)體。其他性能在各基因型個(gè)體間均無(wú)顯著差異（P>0.05，表4）。

2.6 DCN基因多態(tài)位點(diǎn)對(duì)大白豬產(chǎn)仔性狀的影響

rs346372784（C/T）位點(diǎn)CT型個(gè)體死胎數(shù)顯著高于TT型個(gè)體（P<0.05），CC型個(gè)體活仔數(shù)顯著高于CT、TT型個(gè)體（P<0.05），CC型個(gè)體初生重極顯著高于CT型個(gè)體（P<0.01）、顯著高于TT型個(gè)體（P<0.05），CT型個(gè)體初生重顯著低于TT型個(gè)體（P<0.05）。rs55618082（C/A）位點(diǎn)CC型個(gè)體初生重極顯著高于AA和AC型個(gè)體（P<0.01）。其他性能在各基因型個(gè)體間均無(wú)顯著差異（P>0.05，表5）。

2.7 DCN基因多態(tài)位點(diǎn)對(duì)大白豬繁殖性狀EBV的影響

rs346372784（C/T）位點(diǎn)CC型母系指數(shù)、活仔數(shù)EBV、繁殖指數(shù)極顯著高于CT型和TT型個(gè)體（P<0.01），CC型個(gè)體的總仔數(shù)EBV顯著高于CT型個(gè)體（P<0.05）、極顯著高于TT型個(gè)體（P<0.01）。rs55618082（C/A）位點(diǎn)AA型個(gè)體總仔數(shù)EBV、活仔數(shù)EBV、母系指數(shù)顯著高于CC型個(gè)體（P<0.05），AC型個(gè)體總仔數(shù)EBV、活仔數(shù)EBV、母系指數(shù)極顯著高于CC型個(gè)體（P<0.01），CC型個(gè)體繁殖指數(shù)極顯著低于AA和AC型個(gè)體（P<0.01）。其他性能在各基因型個(gè)體間均無(wú)顯著差異（P>0.05，表6）。

3 討論

3.1 DCN基因的遺傳多樣性分析

為深入探究DCN基因與大白母豬繁殖性狀的相關(guān)性，本研究通過(guò)DNA混池測(cè)序技術(shù)，在DCN基因中篩查到2個(gè)已知的SNPs位點(diǎn)，分別為rs55618082（C/A）、rs346372784（C/T）。通過(guò)基因分型技術(shù)在大白母豬群中對(duì)這兩個(gè)SNPs進(jìn)行基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個(gè)SNPs位點(diǎn)均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，說(shuō)明該群體未受人工干預(yù)選育。rs55618082（C/A）、rs346372784（C/T）位點(diǎn)純合度均高于雜合度。rs55618082（C/A）位點(diǎn)屬于中度多態(tài)，rs346372784（C/T）位點(diǎn)屬于低度多態(tài)。研究報(bào)道與微衛(wèi)星標(biāo)記相比，SNP的多態(tài)性較低，但因?yàn)镾NP標(biāo)記豐富且在整個(gè)基因組中分布廣泛［11］，可在一定程度上彌補(bǔ)其相較于微衛(wèi)星等其他分子標(biāo)記方法中多態(tài)性較低的問(wèn)題，所以與性狀聯(lián)系密切的SNP可作為重要性狀標(biāo)記輔助選擇的標(biāo)記。

3.2 rs55618082（C/A）位點(diǎn)對(duì)大白母豬繁殖性能的影響

研究表明同義突變可以通過(guò)改變剪切位點(diǎn)以及mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)等多種機(jī)制影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而影響其蛋白質(zhì)的功能，最終引起個(gè)體表型發(fā)生變化［12-13］。如王思霽［14］發(fā)現(xiàn)MYO15A基因c.9861C>T同義突變會(huì)導(dǎo)致其mRNA的剪接異常進(jìn)而引起人耳聾。小鼠IGF-1基因發(fā)生c.258A>G同義突變導(dǎo)致其血清中IGF-1分泌水平顯著降低［15］。此外，研究發(fā)現(xiàn)同義突變可影響RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)并發(fā)生等位基因特異的RNA編輯，從而引起表型的變化［16］。如Sharma［17］發(fā)現(xiàn)KRAS基因發(fā)生c.30A>C同義突變后KRAS基因mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)從野生型的“Y”狀變?yōu)橥蛔冃偷摹發(fā)”狀并增強(qiáng)其mRNA的表達(dá)。對(duì)此，本研究對(duì)DCN基因rs55618082（C/A）位點(diǎn)同義突變前后的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)突變前后基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能均發(fā)生改變。通過(guò)與大白母豬繁殖性能的進(jìn)一步關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)rs55618082（C/A）位點(diǎn)對(duì)大白母豬的母系指數(shù)、繁殖指數(shù)、乳頭數(shù)、妊娠期長(zhǎng)、初生重、總仔數(shù)EBV、活仔數(shù)EBV呈極顯著相關(guān)（P<0.01）。提示DCN基因rs55618082（C/A）位點(diǎn)對(duì)大白母豬繁殖性能相關(guān)的影響可能與DCN基因發(fā)生同義突變后影響其mRNA穩(wěn)定性或蛋白翻譯效率等相關(guān)，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3 rs346372784（C/T）位點(diǎn)對(duì)大白母豬繁殖性能的影響

在人類(lèi)基因組中，有98%為非編碼序列，其中一部分以內(nèi)含子形式存在［18］。前期研究者認(rèn)為基因內(nèi)含子區(qū)的序列不編碼蛋白質(zhì)，因此不具備生物學(xué)功能，并且不會(huì)對(duì)生物體造成影響［19］。隨著研究的深入，研究工作者逐漸發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)含子區(qū)域的部分序列也會(huì)參與一些生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)控，使得位于其中的突變會(huì)對(duì)生物體表型產(chǎn)生影響。如陳君霖［20］發(fā)現(xiàn)SLC25A13基因IVS6-11A> G內(nèi)含子突變可以通過(guò)改變剪接方式導(dǎo)致Citrin缺陷病致病突變。王玲芳等［21］發(fā)現(xiàn)大白豬TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)的內(nèi)含子突變可以影響母豬的總產(chǎn)仔數(shù)。徐夢(mèng)思等［22］研究表明TGFβRI基因內(nèi)含子多態(tài)性與豬產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)的rs346372784（C/T）位點(diǎn)位于DCN基因第4內(nèi)含子區(qū)，通過(guò)與大白豬群體的繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs346372784（C/T）位點(diǎn)CC型個(gè)體活仔數(shù)、繁殖指數(shù)、總仔數(shù)EBV、活仔數(shù)EBV、母系指數(shù)與CT型個(gè)體或TT型個(gè)體呈現(xiàn)顯著或極顯著相關(guān)。合適的樣本數(shù)量有利于增加獲取的遺傳標(biāo)記的可靠性［23］，本研究發(fā)現(xiàn)大白豬群體中rs346372784（C/T）位點(diǎn)CC基因型頻率較小，僅有11頭，這可能導(dǎo)致結(jié)果存在一定的差異，需要在后期擴(kuò)大樣本容量進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

本研究在大白母豬DCN基因中篩查到的2個(gè)SNPs（rs346372784（C/T）和rs55618082（C/A））均對(duì)大白母豬繁殖性能有顯著或極顯著影響，有望作為大白母豬繁殖性能的潛在分子遺傳標(biāo)記，為大白母豬分子輔助育種提供參考依據(jù)。

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