1.前言

環(huán)己基氨基磺酸鈉，又名甜蜜素，是一種在食品領(lǐng)域得到廣泛使用的非營養(yǎng)型合成甜味劑。人體攝入的環(huán)己基氨基磺酸鈉一旦超標(biāo)，將會刺激腸胃，對肝臟和腎臟造成負擔(dān)，增加患肥胖癥、代謝綜合癥等疾病風(fēng)險，影響身體健康，所以，英、日和美等40多個國家禁用環(huán)己基氨基磺酸鈉。在我國，GB 2760-2014 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對環(huán)己基氨基磺酸鈉和環(huán)己基氨基磺酸鈣的限量使用有明確的規(guī)定（以環(huán)己基氨基磺酸計），但是超標(biāo)現(xiàn)象時有發(fā)生。因此，科學(xué)高效的檢測食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的含量尤為重要。本文主要探討食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的氣相色譜測定法在新的國家標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)變化。

2.氣相色譜法概述

氣相色譜法以惰性氣體作為流動載體，是根據(jù)氣化后的被測物各組分與色譜柱固定相的不同相互作用而實現(xiàn)各組分有效分離的色譜技術(shù)。氣相色譜法一般包含三個步驟：分離、定性和定量。首先是被測樣品中被測組分的分離：檢驗員將被測樣品進行前處理得到上機試樣，設(shè)置好氣相色譜儀的各項實驗參數(shù)，開始氣相色譜實驗；上機試樣通過進樣器進樣后，被氣化，然后進入色譜柱；由于試樣中各組分在色譜柱的固定相中的保留時間不同，從而實現(xiàn)了各組分的分離；分離的各組分通過色譜柱終端的檢測器轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的電子信號，即氣相色譜圖，實驗員因此實現(xiàn)被測樣品目標(biāo)組分的化學(xué)檢測。其次是根據(jù)氣相色譜圖對被測樣品是否含有目標(biāo)組分進行定性分析：實驗員將一定濃度的目標(biāo)組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行相同的前處理得到標(biāo)樣；然后在相同實驗參數(shù)條件下進行氣相色譜實驗，得到目標(biāo)組分的氣相色譜圖及其保留時間；將試樣和標(biāo)液的氣相色譜圖進行比較分析，如果試樣的氣相色譜圖中存在與目標(biāo)組分保留時間相同的色譜峰，則實驗證明被測樣品中含有目標(biāo)組分，如果不存在與目標(biāo)組分保留時間相同的色譜峰，則實驗證明被測樣品中未檢測出目標(biāo)組分。最后是根據(jù)氣相色譜圖對被測樣品中含有的目標(biāo)組分進行定量分析：實驗員將目標(biāo)組分的梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進行相同的前處理和氣相色譜實驗，依次得到不同濃度目標(biāo)組分的色譜峰面積；以外標(biāo)法定量分析，將目標(biāo)組分的濃度作為橫坐標(biāo)，目標(biāo)組分的色譜峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將試樣的氣相色譜圖中目標(biāo)組分的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到試樣中目標(biāo)組分的濃度，最后根據(jù)計算可得出被測樣品中目標(biāo)組分的含量。氣相色譜法具有重現(xiàn)性好、回收率高、檢測限較低且線性范圍合適等特點，被廣泛應(yīng)用于食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的檢測。

3.新國標(biāo)中氣相色譜測定法的主要變化

國家衛(wèi)健委和市場監(jiān)管總局于2023年9月6日發(fā)布了GB 5009.97-2023《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的測定》（以下簡稱“新國標(biāo)”），該標(biāo)準(zhǔn)代替 GB 5009.97-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基礦酸鈉的測定》，于2024年3月6日正式實施。標(biāo)準(zhǔn)名稱中被測物由環(huán)己基氨基礦酸鈉改為環(huán)己基氨基磺酸鹽。新國標(biāo)仍把氣相色譜法作為測定環(huán)己基氨基磺酸鹽的第一法，與GB 5009.97-2016相比，氣相色譜法主要修改了適用范圍、前處理方法和儀器條件及參數(shù)。

3.1適用范圍

新國標(biāo)規(guī)定氣相色譜法適用于食品（蒸餾酒 、發(fā)酵酒 、配制酒、料酒及其他含乙醇的食品除外）中環(huán)己基氨基礦酸鹽的測定。從適用范圍的表述上，新標(biāo)準(zhǔn)明確強調(diào)了氣相色譜法不適用的具體范圍，即不適用于所有含乙醇的食品中的環(huán)己基氨基磺酸鹽的測定。相比于GB 5009.97-2016中規(guī)定的氣相色譜法不適用于白酒中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定，新標(biāo)準(zhǔn)中氣相色譜法不適用的具體范圍擴大了許多，實驗員需要特別注意。

3.2前處理方法

3.2.1試劑、標(biāo)準(zhǔn)品及其配制

新國標(biāo)使用的試劑：正Kq2xb2sb6Py6N0+Q0PMiaH02wdgGVBgk7JWSSB7e/YU=庚烷[CH3（CH2）5CH3]（色譜純），石油醚（沸程為30℃-60℃），硫酸（H2SO4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%-98.0%，密度1.84g/mL），亞硝酸鈉（NaNO2），淀粉酶（酶活力 >1500U/g），無水乙醇（CH3CH2OH）。新國標(biāo)改變了試劑的使用，破乳化試劑由無水乙醇替代和氯化鈉，取消了蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀和硫酸鋅，取消了氫氧化鈉試劑，增加了淀粉酶試劑。亞硝酸鈉溶液（50g/L）和硫酸溶液（200g/L）的配制無變化。

新國標(biāo)仍選用環(huán)己基氨基礦酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（C6H12NSO3Na）作為標(biāo)準(zhǔn)品。但是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制溶度變大了，環(huán)己基氨基礦酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液由5.00 mg/mL改成了6 mg/mL，環(huán)己基氨基礦酸標(biāo)準(zhǔn)中間液由1.00 mg/mL改成了1200 μg/mL。環(huán)己基氨基礦酸鈉折算為環(huán)己基氨基礦酸的換算系數(shù)由0.8909改成了0.8907。

3.2.2儀器與設(shè)備

新國標(biāo)使用的儀器與設(shè)備：氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測器（FID））、分析天平（感量1mg、0.1mg）、渦旋混合器、高速離心機、超聲波發(fā)生器、粉碎機、研磨機、勻漿機、恒溫水浴裝置。新國標(biāo)增加了研磨機和勻漿機儀器的使用，離心機的轉(zhuǎn)速要求提高了，實驗中使用的最大轉(zhuǎn)速由原來的3000 r/min改成了9000 r/min。

3.2.3試樣的制備和提取

新國標(biāo)對試樣的制備有諸多改變，提高了對試樣勻質(zhì)的要求。主要表現(xiàn)為：含二氧化碳的液體試樣采用超聲法替代加熱法除去氣泡；對非均勻的液態(tài)、半液體試樣增加了勻漿機對其進行混勻，提高了試樣的均勻性；針對巧克力、巧克力制品、奶酪、黃油等試樣，明確要求在-18℃冷凍后，用粉碎機粉碎并攪拌均勻；而在固態(tài)試樣制備時新增了研磨機粉碎。

新國標(biāo)對于試樣提取的規(guī)定發(fā)生了顯著變化，既優(yōu)化了試驗方法，又提高了檢測效率。首先，各種類型樣品的取樣量減少了，并且還進行了統(tǒng)一，全部規(guī)定為稱取試樣2g。其次，對試樣的分類提取發(fā)生了變化。新國標(biāo)將試樣提取分為四類：巧克力、奶油、奶酪、乳粉、調(diào)味面制品、油腐乳、油豆豉、肉及肉制品、水產(chǎn)品罐頭等含較高油脂試樣；果凍、糖果、米粉、淀粉制品等試樣；其他固體、半固體試樣和液體試樣。最后，優(yōu)化了試樣提取的實驗方法。對于上述列舉的含較高油脂試樣，仍采用石油醚提取2次，與GB 5009.97-2016的不同之處在于，加入20mL石油醚提取時，增加了渦旋5min；超聲時間延長至10min，離心條件改成了5000 r/min 離心3 min；提取完成后棄去石油醚層，60℃±2℃水浴揮去殘留石油醚，殘渣加水減少至20mL（特別強調(diào)：巧克力、奶油、奶酪、乳粉等試樣需在水浴鍋中60℃±2℃加熱20min），增加渦旋5min，超聲提取時間延長至30min，混勻后放至室溫備用；取消了后續(xù)沉淀、過濾、定容三個步驟。針對果凍、糖果、米粉、淀粉制品等試樣，新國標(biāo)提出了新的提取方法：稱取 2g試樣（精確至0.001g）于離心管中，加入20mL水（米粉、淀粉制品等試樣需再加入0.2g淀粉酶），混合均勻后，60℃±2℃水浴加熱20min，渦旋5min，超聲提取10min，混勻后放至室溫備用。對于其他固體、半固體試樣：稱取2g試樣（精確至0.001g）于離心管中，加入20mL水，渦旋5min，超聲提取30min，混勻后放至室溫備用。對于液體試樣：稱取2g試樣（精確至0. 001g）于離心管中，加水至20mL，渦旋5min，超聲提取10min，混勻后放至室溫備用，與GB 5009.97-2016相比，增加了渦旋和超聲提取，取消了定容。

3.2.4 衍生化

衍生化是環(huán)己基氨基磺酸鹽檢測前處理實驗的關(guān)鍵步驟，新國標(biāo)調(diào)整了衍生化實驗的方法和步驟：取消了移液這一步驟，直接將裝有試樣提取液的離心管置于冰浴，冰浴時間由5min改成了10min，依次加入的正庚烷由5mL改成了10mL，亞硝酸鈉溶液（50g/L）由2.5mL改成了5mL，硫酸溶液（200g/L）由2.5mL改成了5mL，混勻，于冰浴中放置30min，其間振搖3-5次，取消了氯化鈉的加入，取出后渦旋，渦旋時間由1min改成3min，再進行低溫離心，明確規(guī)定于4℃條件下離心，離心條件由3000r/min離心10min改成9000r/min離心3min。GB 5009.97-2016中要求統(tǒng)一加入氯化鈉來破乳化，但新國標(biāo)中規(guī)定：如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可緩慢滴加無水乙醇，同時輕搖離心管，直至破乳，于4℃條件下9000r/min離心3min。最后，取上清液過有機相微孔濾膜（0.45μm孔徑），供上機測定。

3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的制備及衍生化

新國標(biāo)中標(biāo)準(zhǔn)系列工作液制備了7個濃度梯度，分別準(zhǔn)確移取0.05mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.5mL、5.0mL環(huán)己基氨基礦酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（1200μg/mL）于離心管中，用水稀釋至20mL，按上述3.2.4步驟衍生化。此時正庚烷中待測物的濃度分別相當(dāng)于 6μg/mL、12μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL、300μg/mL、600μg/mL，臨用現(xiàn)配。與GB 5009.97-2016相比，濃度梯度由6個增加至7個；標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度由衍生化之前待測物的制備濃度改成了衍生化之后正庚烷中待測物的濃度；濃度覆蓋范圍由10μg/mL至500μg/mL拓展成6μg/mL至600μg/mL；標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的最小濃度梯度6μg/mL，正好對應(yīng)取樣量為2g時本方法的的定量限0.03g/kg。

3.3儀器條件及參數(shù)

新國標(biāo)規(guī)定的色譜柱由內(nèi)涂5%苯基甲基聚硅氧烷的弱極性石英毛細管柱（30m×0.53mm×1μm）改成了內(nèi)涂50%苯基-50%甲基聚硅氧烷的中等極性毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm）。柱溫升溫程序：初溫由55℃改成了50℃，保持3min，10℃/min升溫至90℃改成了10℃/min升溫至70℃，保持0.5min，最后由20℃/min升溫至200℃改成了30℃/min升溫至220℃，保持3min。進樣口溫度（230℃）、進樣量（1μL）、進樣方式（分流進樣）、分流比（1：5）和檢測器（氫火焰離子化檢測器（FID，溫度260℃）均未發(fā)生改變。載氣：高純氮氣，流速由12.0mL/min改成了2.0mL/min。氫氣：流速由30mL/min改成了32mL/min?？諝猓毫魉儆?30mL/min改成了300mL/min。

4.結(jié)果與分析

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液經(jīng)過衍生化實驗處理，依次注入氣相色譜儀中測得氣相色譜圖譜，從而測得對應(yīng)衍生物的峰面積，以環(huán)己基氨基礦酸的濃度為橫坐標(biāo)，以衍生物環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇兩峰面積之和為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試樣溶液經(jīng)過衍生化實驗處理，注入氣相色譜儀中，測得氣相色譜圖譜，首先根據(jù)保留時間來進行定性，然后將目標(biāo)兩峰面積之和作為測定面積計算，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣溶液中待測物的濃度。若試樣中目標(biāo)兩峰面積之和超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，應(yīng)用正庚烷稀釋后再進樣分析。

試樣中環(huán)己基氨基磺酸含量按式（1）計算。X代表試樣中環(huán)己基氨基礦酸的含量，單位為克每千克（g/kg）；p代表由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測溶液中環(huán)己基氨基礦酸的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）。V代表加入正庚烷體積，單位為毫升（mL）；m代表試樣質(zhì)量，單位為克（g）；f代表稀釋倍數(shù)。計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的2次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

式（1）

在重復(fù)性條件下獲得的2次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。當(dāng)取樣量為2g時，本方法檢出限為0.01g/kg，定量限為0.03g/kg。與GB 5009.97-2016相比，待測溶液中環(huán)己基氨基礦酸的質(zhì)量濃度單位由mg/mL改成了μg/mL；計算代入的體積V由試樣最終定容體積改成了正庚烷體積；增加了稀釋倍數(shù)f；精密度要求由10%改成了15%，有所放寬。

結(jié)論

標(biāo)準(zhǔn)的變更需要針對變化了的標(biāo)準(zhǔn)方法進行相應(yīng)的方法驗證，從而佐證該實驗室可以科學(xué)準(zhǔn)確的采用新的標(biāo)準(zhǔn)方法開展相關(guān)檢驗檢測活動。食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的氣相色譜測定法在新國標(biāo)GB 5009.97-2023《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的測定》中修改了適用范圍、前處理方法以及儀器條件和參數(shù)，進一步明確了標(biāo)準(zhǔn)方法的適用范圍，提高了樣品中環(huán)己基氨基磺酸鹽的提取率，優(yōu)化了待測物目標(biāo)峰（環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇兩峰）的保留時間和峰形，使得環(huán)己基氨基磺酸的檢測效率更高，檢測結(jié)果更加科學(xué)準(zhǔn)確。

作者簡介

文海瓊（1989-），女，質(zhì)量工程師（中級），碩士研究生；研究方向：質(zhì)量檢測與質(zhì)量管理。