楊超輝 梁雙敏 葛長榮 肖智超

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.05.003

引文格式：楊超輝，梁雙敏，葛長榮，等.云南鹽津烏骨雞肉中鮮味肽的提取與鑒定[J].中國調(diào)味品，2024，49（5）：10-15，46.

YANG C H， LIANG S M， GE C R， et al.Extraction and identification of umami peptides from Yunnan Yanjin black-bone chicken[J].China Condiment，2024，49（5）：10-15，46.

摘要：利用超濾和凝膠過濾色譜法對鹽津烏骨雞肉中的鮮味肽進(jìn)行分離純化，結(jié)合感官評價得到鮮味最佳的組分F1，進(jìn)一步采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從F1組分中鑒定出鮮味肽，對鑒定出的鮮味肽進(jìn)行條件篩選、氨基酸組成和活性片段預(yù)測分析。結(jié)果表明，從鹽津烏骨雞肉中鑒定出921條多肽，篩選后得到551條多肽，通過鮮味活性預(yù)測得到鮮味片段出現(xiàn)頻率大于1的10條多肽，其中DTEEVEHGEE、EVHEEEVH、HEAEEVHEE、HEKLSEESEE、KVED、TPIPDLP 6條多肽可能具有較強(qiáng)的鮮味。

關(guān)鍵詞：鹽津烏骨雞；鮮味肽；分離鑒定；條件篩選；活性預(yù)測

中圖分類號：TS201.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A????? 文章編號：1000-9973（2024）05-0010-06

Extraction and Identification of Umami Peptides from Yunnan

Yanjin Black-Bone Chicken

YANG Chao-hui1，2， LIANG Shuang-min1，2， GE Chang-rong3， XIAO Zhi-chao1，2*

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，

China; 2.Yunnan Engineering Technology Research Center of Animal Products Processing，

Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 3.Yunnan Agricultural

University， Kunming 650201， China）

Abstract： The umami peptides from Yanjin black-bone chicken are separated and purified by ultrafiltration and gel filtration chromatography， and the component F1 with the best umami is obtained by sensory evaluation. The umami peptides are further identified from F1 component by liquid chromatography-tandem mass spectrometry， and condition screening， amino acid composition and active fragment prediction analysis are conducted on the identified umami peptides. The results show that 921 polypeptides are identified from Yanjin black-bone chicken， and 551 polypeptides are obtained after screening.Ten polypeptides with frequency greater than 1 are obtained by the prediction of umami activity， among which， DTEEVEHGEE， EVHEEEVH， HEAEEVHEE， HEKLSEESEE， KVED and TPIPDLP may have strong umami.

Key words： Yanjin black-bone chicken; umami peptides; separation and identification; condition screening; activity prediction

收稿日期：2023-10-17

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32260638）

作者簡介：楊超輝（1997—），男，碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工。

*通信作者：肖智超（1985—），男，副教授，博士，研究方向：畜產(chǎn)品加工、功能性食品。

鮮味是5種基本口味之一，是食品風(fēng)味評價體系中的重要因素。研究表明，鮮味化合物不僅能產(chǎn)生令人愉悅的味道，而且能改善整體感官質(zhì)量[1]。鮮味肽通常包含在肉制品、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和微生物制品中，其分子量通常低于3 000 Da[2]。Yamasaki等[3]最早從木瓜蛋白酶處理的牛肉中發(fā)現(xiàn)了鮮味八肽，此后在多種食品中均鑒定出鮮味肽，如臭鱖魚[4]、雞蛋蛋白[5]、牛肝菌[6]中。

近年來，對優(yōu)質(zhì)地方雞肉的風(fēng)味研究較多。中國優(yōu)質(zhì)地方雞品種與商業(yè)型肉雞相比，具有風(fēng)味濃郁、肉質(zhì)緊實等特點，這主要是由于地方雞肉中水溶性化合物（氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸、氨基酸衍生物等）、脂肪酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)優(yōu)于商業(yè)型肉雞[7-8]。除上述物質(zhì)外，呈味肽也在雞肉風(fēng)味形成過程中起到關(guān)鍵作用。何穎等[9]從武定雞肉中分離鑒定出8條多肽，其中LDF、FVT和DLAGRDLTDYLMKIL 3條多肽被確定為武定雞肉中鮮味的關(guān)鍵組分。Liang等[10]通過動態(tài)定量描述分析和暫時性感官支配法對感官數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對雞湯的味道進(jìn)行表征，最后鑒定出9條味覺肽。其中，AGPSIVH、IKDPHVD和TPPKID具有鮮味特征，KDPHVD、FAGDDAPR和NALNDITSL具有增強(qiáng)鮮味的作用。

鹽津烏骨雞是云南優(yōu)質(zhì)地方雞種，主要生長于云南省昭通市鹽津縣，它集美味、保健、藥用于一體，體型、外貌和生長性能相對穩(wěn)定，屬于藥用肉蛋兼用型品種[11]。目前有關(guān)鹽津烏骨雞的研究主要集中在生長性能[12]和風(fēng)味物質(zhì)[13]方面，對鹽津烏骨雞鮮味肽的分離鑒定鮮有報道。本研究采用超濾凝膠過濾色譜對鹽津烏骨雞肉中的鮮味成分進(jìn)行分離純化，結(jié)合感官分析確定鮮味最強(qiáng)的組分，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定組分中的鮮味肽氨基酸序列和分子量，并對鑒定出的鮮味肽進(jìn)行篩選。本研究不僅填補(bǔ)了鹽津烏骨雞鮮味肽研究領(lǐng)域的空白，增加了新型鮮味肽的數(shù)量，而且對鹽津烏骨雞精深加工的方向、鮮味肽的研究利用及呈鮮機(jī)制的分析具有重要意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

選取同一飼養(yǎng)條件下同一批次的180日齡的鹽津烏骨雞，由云南省鹽津縣本城農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，屠宰后洗凈，于－20 ℃保存。

1.2? 試劑

葡聚糖凝膠G-15：上海源葉生物科技有限公司；蔗糖、鹽、味精（均為食品級）：沃爾瑪百貨有限公司；檸檬酸（食品級）：山東檸檬生化有限公司；異亮氨酸（食品級）：上海千味食品有限公司。

1.3? 主要儀器與設(shè)備

S18-LA170碎肉機(jī)? 九陽股份有限公司；XHF-D高速分散器、Scientz-18真空冷凍干燥機(jī)? 寧波新芝生物科技股份有限公司；H3-18K離心機(jī)? 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；MSC300超濾杯? 上海摩速科學(xué)器材有限公司；IT-09C10磁力攪拌器? 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HC-0120-06玻璃層析柱? 北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；BSZ-100自動部分收集器? 上海瀘西分析儀器廠有限公司；BT102S-1-CE恒流泵? 保定雷弗流體科技有限公司；LC-MS/MS儀? 美國賽默飛世爾科技公司。

1.4? 方法

1.4.1? 鹽津烏骨雞肉水提物的制備

參考Zhang等[14]的方法并略作改動。取解凍的鹽津烏骨雞，去皮，去除雞肉中可見油脂，清洗干凈血水。取250 g雞肉，絞碎后加入800 mL超純水，以100 000 r/min勻漿3次，每次20 s，靜置1 h后離心（4 ℃，8 000 r/min，10 min），取上清液過濾除去漂浮的油脂和無法沉淀的雜質(zhì)。按上述步驟，離心沉淀物加200 mL超純水重復(fù)提取1次，合并2次濾液儲存于4 ℃冰箱中備用。

1.4.2? 鹽津烏骨雞肉水提物中鮮味肽的超濾分離

參考Su等[15]的方法并略作改動。鹽津烏骨雞肉水提物通過3 000 Da和1 000 Da的超濾膜于4 ℃下進(jìn)行分級純化：首先通過3 000 Da的超濾膜，再通過1 000 Da的超濾膜，得到組分U1、U2和U3，分別對應(yīng)分子量>3 000 Da、3 000～1 000 Da和<1 000 Da。收集超濾得到的所有組分，冷凍干燥成粉末，用于感官分析，選擇鮮味最強(qiáng)的組分用于下一步分離純化。

1.4.3? 超濾組分的凝膠過濾色譜分離

參考別朋宇等[16]的方法并略作改動。將鮮味較強(qiáng)的超濾組分U3經(jīng)超純水復(fù)溶，混合制成15 mg/mL的水溶液，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后，再通過Sephadex G-15 凝膠層析柱（1.6 cm×70 cm）分離出鮮味更強(qiáng)的組分。以超純水作為洗脫液進(jìn)行洗脫，設(shè)置流速為1 mL/min，每次上樣2 mL后，用自動部分收集器收集，每3 min收集一管，在220 nm波長處測定吸光值。分別將每個分離峰單獨收集、合并，冷凍干燥成粉末，用于感官分析，選擇鮮味最強(qiáng)的組分。

1.4.4? 鮮味肽序列的鑒定

采用LC-MS/MS分析鮮味得分最高的凝膠色譜分離純化組分的氨基酸序列和分子質(zhì)量。取3 mL樣品，用Empore固相萃取柱C18-SD（7 mm，3 mL）進(jìn)行脫鹽，多肽組分凍干后，用40 μL 0.1%的三氟乙酸水溶液復(fù)溶，上機(jī)待測。

參考桂海佳等[17]的方法并略作改動。色譜條件：采用Nano-HPLC液相系統(tǒng)Easy-nLC進(jìn)行分離，自動進(jìn)樣到Zorbax 300SB-C18色譜柱，再經(jīng)過液相色譜柱分離，流速為250 nL/min。設(shè)定0.1%甲酸水溶液為流動相A，0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）為流動相B；用95% A和5% B對液相色譜柱RP-C18（75 μm×150 mm，3 μm）進(jìn)行平衡；洗脫梯度設(shè)置：0～50 min，96%～50% A、4%～50% B；50～54 min，50%～0% A、50%～100% B；54～60 min，0% A、100% B。

質(zhì)譜條件：樣品經(jīng)高效液相色譜分離后用Q Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析時間：60 min；檢測方式：正離子；母離子掃描范圍（m/z）：300～1 800 amu；一級質(zhì)譜分辨率：70 000（m/z為200時）；AGC目標(biāo)：1e6；一級最大IT值：10 ms；掃描范圍數(shù)：1；動態(tài)排除：20.0 s；多肽和多肽的碎片的質(zhì)荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集10個碎片圖譜（MS2 scan）。MS2激活類型：HCD；隔離窗口：1.6 m/z；二級質(zhì)譜分辨率：17 500（m/z為200時）；顯微掃描：1；二級最大IT值：60 ms；碰撞能量歸一化：27 eV；最小填充比：0.1%。

質(zhì)譜測試數(shù)據(jù)用軟件MaxQuant 1.5.5.1檢索數(shù)據(jù)庫UniProt-Camelidae-89471（版本20201019，89 471條序列）并結(jié)合反庫，酶設(shè)置為不限定酶切位點：允許的最大漏切位點數(shù)量為2；一級離子質(zhì)量容差為20 mg/kg；二級離子質(zhì)量容差為0.1 Da；動態(tài)修飾為M氧化修飾；可信蛋白質(zhì)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為≤0.01。

1.4.5? 多肽的呈味活性預(yù)測

BIOPEP-UWM是一個開放的數(shù)據(jù)庫資源（https：//biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/），可用于預(yù)測已經(jīng)鑒定的鮮味肽的潛在生物活性。通過查詢數(shù)據(jù)庫，確定了目標(biāo)肽序列中具有的特定味覺活性片段的數(shù)目和氨基酸殘基的數(shù)目。通過分析和計算獲得目標(biāo)肽中生物活性片段的出現(xiàn)頻率，以此來預(yù)測其味覺活性。

1.4.6? 感官評價

1.4.6.1? 小組培訓(xùn)

參考Ruan等[18]的方法并略作改動。感官評價小組由10名實驗室成員組成（5男5女，年齡在23～28歲之間）。小組成員均健康、不吸煙、無味覺和嗅覺障礙。小組成員經(jīng)過感官訓(xùn)練后，可以準(zhǔn)確識別5種基本味道，包括酸味、甜味、苦味、咸味和鮮味。小組成員被要求通過訓(xùn)練后才能評價以下標(biāo)準(zhǔn)味覺溶液：甜味蔗糖溶液（10 mg/mL）、鮮味味精溶液（3.5 mg/mL）、咸味NaCl溶液（3.5 mg/mL）、苦味異亮氨酸溶液（2.5 mg/mL）、酸味檸檬酸溶液（0.8 mg/mL）。此濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液被認(rèn)定為5分。要求小組成員評價雞肉水提物各級分離純化組分的不同滋味特征，選擇鮮味最強(qiáng)的組分以供進(jìn)一步研究。具體感官評價標(biāo)準(zhǔn)細(xì)則見表1。

1

2

3

4

5

6

7

所有感官試驗均在（25±2） ℃的環(huán)境中進(jìn)行。這些樣品溶解在超純水中，轉(zhuǎn)移到一個塑料杯中，并隨機(jī)命名。為了避免在感官評價過程中小組成員疲勞和殘留的氣味，在評價兩個不同的樣品之間，小組成員被要求用50～60 mL的超純水漱口至少2次。

1.4.6.2? 凝膠過濾色譜分離組分感官評價

參考梁佳明等[19]的方法并略作改動。將凝膠過濾色譜各分離組分用超純水配成5 mg/mL的溶液，每次取5 mL，按超純水和待測液體積比為1∶1逐步稀釋。將稀釋好的樣品按照濃度遞減的順序給感官小組人員，每個樣品品嘗約5 s。在對每個樣品評價后漱口，再品嘗下一樣品。為避免感官疲勞和上一樣品在口中遺留的影響，提供2個空白對照品（超純水）進(jìn)行比較。直到感官人員剛好能區(qū)分某一稀釋水平的溶液與兩個空白樣之間的味道差異，記錄此時的稀釋倍數(shù)，即為稀釋因子。對評價人員的評價結(jié)果進(jìn)行記錄（4/5以上人數(shù)的結(jié)果為可靠，這里指8人），評價過程中不允許討論和交流，結(jié)果取3次重復(fù)試驗的平均值。同時，小組成員還對各組分的味覺特征進(jìn)行了描述。

1.5? 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用Origin 2018軟件繪圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 鹽津烏骨雞肉水提物超濾分級與感官分析

由圖1可知，隨著鹽津烏骨雞肉水提物的逐步超濾分級，分離組分的鮮味逐漸增強(qiáng)；與U1組分相比，U3組分表現(xiàn)出較強(qiáng)的鮮味強(qiáng)度（P<0.05），U3組分較U1組分甜味稍高但無顯著性差異（P>0.05），而在咸味強(qiáng)度上U3組分表現(xiàn)較高，與U1組分相比具有顯著性差異（P<0.05）。這與前人的研究結(jié)果一致，溫志鵬[20]發(fā)現(xiàn)隨著海帶酶解液的逐級分離，分離組分的鮮味、咸味的呈味強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而甜味和咸味可以促進(jìn)鮮味的感知。研究表明，小分子量組具有更強(qiáng)的鮮味，Liang等[21]將豬骨湯和豬骨洋蔥湯超濾后發(fā)現(xiàn)，分子量低于1 000 Da的組分均具有較高的鮮味強(qiáng)度。因此，收集鮮味最強(qiáng)的組分U3，進(jìn)行下一步的分離純化。

2.2? 超濾組分的凝膠過濾色譜分離與感官分析

鹽津烏骨雞肉水提物經(jīng)過超濾后，已經(jīng)去除了大部分分子量大于1 000 Da的肽段，但是部分肽段超濾不完全，U3組分仍是一個復(fù)雜的混合肽樣品，為了進(jìn)一步縮小目標(biāo)鮮味肽的分子質(zhì)量范圍，使用凝膠過濾色譜對U3組分進(jìn)一步分離純化。

由圖2中A可知，Sephadex G-15具有良好的分離效果，并且可以有效地收集不同的組分，一共分離得到4個組分（F1、F2、F3、F4），將4個組分單獨分開收集，凍干后進(jìn)行感官分析。由圖2中B可知，F(xiàn)1具有較強(qiáng)的鮮味和咸味（P<0.05），鮮味強(qiáng)度甚至超過了標(biāo)準(zhǔn)溶液。F1組分的甜味稍高但與其他組分無顯著性差異（P>0.05）。由于鮮味、咸味和甜味之間的相互作用，咸味和甜味可以增強(qiáng)鮮味[22-23]。

由表2可知，F(xiàn)1組分的稀釋因子較高，達(dá)到512，表明F1組分具有較強(qiáng)的鮮味，與感官雷達(dá)圖結(jié)果一致。并且隨著組分不斷分離，咸味強(qiáng)度逐漸減弱，苦味強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，這可能是因為凝膠過濾有一定的脫鹽效果，而鮮味和甜味的減弱也逐漸使苦味暴露出來。綜合以上感官分析結(jié)果，將F1組分用于后續(xù)肽的鑒定。

2.3? LC-MS/MS分離鑒定鹽津烏骨雞肉中的肽

通過LC-MS/MS鑒定F1組分中肽的氨基酸序列和對分子質(zhì)量進(jìn)行分析，統(tǒng)計結(jié)果見表3。F1組分中共含有921條肽段，其中分子量<1 000 Da的肽段最多，共有569條，占比61.78%；其次是分子量在1 000～1 500 Da范圍內(nèi)的肽，共有287條，占比31.16%。其余部分為分子量>1 500 Da的多肽。從氨基酸數(shù)量來看，含有3～10個氨基酸的肽段最多，有681條，占比73.95%；其次是含有11～15個氨基酸的肽段，有205條，占比22.26%；余下少量的是含有大于15個氨基酸的多肽。

此外，本次試驗還統(tǒng)計了921條多肽中每種氨基酸出現(xiàn)的數(shù)量，見圖3。

有3 334個親水性氨基酸，3 120個疏水性氨基酸；出現(xiàn)數(shù)量最多的前五種氨基酸分別是2種親水性氨基酸：賴氨酸（752個）和谷氨酸（610個）；3種疏水性氨基酸：脯氨酸（704個）、纈氨酸（553個）和甘氨酸（478個）。疏水性氨基酸和親水性氨基酸出現(xiàn)的數(shù)量比例為1∶1.06。研究表明，肽的鮮味強(qiáng)度與其氨基酸的親水性和疏水性高度相關(guān)，其中親水性氨基酸通常與甜味和鮮味相關(guān)，而疏水性氨基酸則與不愉快的味道相關(guān)，如苦味[24]。相反，從整體的感官表現(xiàn)來看，疏水部分不會削弱鮮味，反而會賦予肽一定的鮮味，因此，疏水部分也是鮮味肽的重要組成部分[25]。

對分離純化得到的多肽采用MaxQuant軟件進(jìn)行分析，已知測試的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)越吻合，得分越高，去除解譜得分低于20的多肽，剩余617條多肽。有研究表明，目前已報道的鮮味肽的相對分子質(zhì)量大多低于1 500 Da，且具有鮮味特性的中長鏈多肽數(shù)量更多，遠(yuǎn)超過短肽數(shù)量[26—28]。因此，進(jìn)一步篩選去除了分子量大于1 500 Da和氨基酸數(shù)量大于15個的多肽，最后剩余551條多肽。組成鮮味肽的主要氨基酸是鮮味氨基酸，如天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺，在呈現(xiàn)多肽的鮮味方面具有重要作用。張佳男等[29]對近年來報道的鮮味肽進(jìn)行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)含有鮮味氨基酸的鮮味肽數(shù)量占比最多，約為79%。此外，甜味氨基酸（如丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甘氨酸）在呈現(xiàn)鮮味的過程中與其他味道有一定的協(xié)同作用[24]。因此，可以將多肽中的鮮味和甜味氨基酸組成片段作為篩選條件進(jìn)一步篩選。

2.4? 鹽津烏骨雞肉中鮮味肽的活性預(yù)測

為了進(jìn)一步篩選鮮味肽，對剩余的551條多肽進(jìn)行活性片段預(yù)測分析。鮮味活性片段出現(xiàn)頻率>1的多肽共10個，見表4。對這10個潛在的鮮味肽進(jìn)行分析和下一步試驗。

注：“－”表示目標(biāo)肽序列中不具有相應(yīng)的味覺活性片段；肽段的綜合得分越高，表明鑒定結(jié)果越可信。

由表4可知，10個肽段都出現(xiàn)了較高的鮮味活性片段，鮮味肽的味覺活性主要歸因于帶電基團(tuán)（正負(fù)）之間的相互作用，堿性氨基酸和酸性氨基酸共同作用產(chǎn)生鮮味[30]，而這10個肽段均含有Glu和Asp，也是酸味活性片段出現(xiàn)的主要原因[31]。對目前已經(jīng)報道的鮮味肽進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，一些具有苦味的氨基酸如脯氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、組氨酸等均是鮮味肽的組成成分[32]。因此，不能片面地認(rèn)為含有苦味活性片段會削弱鮮味肽的鮮味。其中DTEEVEHGEE、EVHEEEVH、HEAEEVHEE、HEKLSEESEE、KVED、TPIPDLP同時出現(xiàn)了咸味和甜味活性片段。有研究表明，甜味和咸味氨基酸對鮮味有很好的促進(jìn)作用[25]，這6個肽段可能具有較強(qiáng)的鮮味，同時其可信度也較高。這6條肽的二級質(zhì)譜圖見圖4，分子質(zhì)量分別為1 172.45，1 006.44，1 107.45，1 215.53，489.24，751.41 Da。但是，僅憑生物活性片段預(yù)測不能直接確定肽的味覺活性，因而在后續(xù)的研究中有必要對多肽進(jìn)行合成，進(jìn)一步驗證肽的味覺特征。

3? 結(jié)論

鹽津烏骨雞水提物經(jīng)過超濾、凝膠過濾色譜分離純化，得到鮮味最強(qiáng)的多肽組分F1。采用LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)一步鑒定出F1中含有921條多肽，以軟件解譜得分、肽分子量和氨基酸數(shù)量為指標(biāo)篩選后剩余551條多肽。通過活性片段預(yù)測得到10條鮮味片段出現(xiàn)頻率最高（片段出現(xiàn)頻率>1）的多肽，對10條多肽進(jìn)行活性片段和氨基酸組成分析，表明DTEEVEHGEE、EVHEEEVH、HEAEEVHEE、HEKLSEESEE、KVED、TPIPDLP 6條肽可能具有較強(qiáng)的鮮味。本研究填補(bǔ)了在鹽津烏骨雞鮮味肽方面的研究空白，為下一步合成肽的呈味特性研究奠定了基礎(chǔ)。

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