馬永勝,劉洋,楊文銘,邢煜剛,林啟泰,李澤昊,段王平,衛(wèi)小春

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科,骨與軟組織損傷修復(fù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030001)

關(guān)節(jié)軟骨(articular cartilage,AC)因無血管和神經(jīng)的解剖學(xué)特性而具有免疫特權(quán),非常適合同種異體移植手術(shù)[1]。同種異體骨軟骨移植(osteochondral allograft,OCA)技術(shù)治療由骨壞死、剝脫性骨軟骨炎和創(chuàng)傷性損傷等引起的軟骨缺損療效顯著[2-3]。傳統(tǒng)上,OCA技術(shù)是在移植物獲取后7 d內(nèi)植入的,具有較高的軟骨細(xì)胞活性,新鮮的同種異體骨軟骨移植物(osteochondral allografts,OCAs)5年生存率已經(jīng)超過80%[2-4]。然而,OCAs從尸體標(biāo)本獲取到植入,需要經(jīng)過取材、處理、保存、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、供體病原檢測(cè)等過程,這些至少需要14 d時(shí)間,如果涉及到移植物運(yùn)輸、手術(shù)安排等問題,時(shí)間窗口會(huì)延長到21 d甚至更長時(shí)間[5-6]。OCA的臨床結(jié)果很大程度上依賴于植入時(shí)存活的軟骨細(xì)胞量,但軟骨細(xì)胞存活率會(huì)隨OCAs保存時(shí)間的延長而下降[7-9]。有研究表明,移植物細(xì)胞存活率70%以下時(shí),術(shù)后效果很不理想[10]。如何延長和提高OCAs在體外保存過程中軟骨細(xì)胞的活力成為OCAs保存的最大困難。目前,體外保存OCAs的方法有玻璃化法、冷凍法和組織培養(yǎng)法等,其中組織培養(yǎng)法能夠保持軟骨細(xì)胞活力,所以廣受臨床醫(yī)生的歡迎[11]。組織培養(yǎng)法保存OCAs缺乏系統(tǒng)性的綜述,本文通過對(duì)近年來組織培養(yǎng)法保存OCAs的文獻(xiàn)進(jìn)行回顧和展望,為OCAs的臨床應(yīng)用提供參考。

1 組織培養(yǎng)法保存OCAs的優(yōu)勢(shì)

目前,體外保存OCAs的方法有玻璃化法、冷凍法和組織培養(yǎng)法。玻璃化保存法是將移植物置于特定的玻璃化溶液中快速降溫固化,通過玻璃化凍存液與水分子發(fā)生強(qiáng)烈的水合作用,增加溶液黏性,從而防止移植物細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成,有效避免軟骨細(xì)胞在降溫和復(fù)溫過程中的多種損傷。近年來,OCAs的玻璃化保存已成為日益流行的有效延長離體組織體外保存時(shí)間的一種方法[12]。然而,與組織培養(yǎng)法相比,玻璃化保存的OCAs在同種異體骨軟骨移植時(shí)表現(xiàn)出較低的軟骨細(xì)胞活力[13]。冷凍法可通過冷卻至極低溫度(-80 ℃)有效阻止任何可能對(duì)移植物造成損害的化學(xué)活動(dòng),保存移植物6個(gè)月甚至是1年的時(shí)間[14]。但軟骨細(xì)胞存活率低和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的丟失是其重要的缺陷[15]。低溫冷凍限制了軟骨細(xì)胞的活力,OCAs通過組織培養(yǎng)法保存能夠維持軟骨細(xì)胞的活力,更適用于臨床[8-9,16]。組織培養(yǎng)法是人工培養(yǎng)具有活性組織的方法,指將移植物放入含營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基內(nèi),于適宜溫度下保存,以保持OCAs的新鮮水平。組織培養(yǎng)法相對(duì)于玻璃化法和冷凍法保存AC,其主要優(yōu)勢(shì)是有效避免了細(xì)胞因冷凍而產(chǎn)生的損傷,能保持較高的軟骨細(xì)胞存活率和基質(zhì)含量[13]。由于軟骨細(xì)胞活力和ECM含量是同種異體骨軟骨移植成功的關(guān)鍵,所以組織培養(yǎng)法保存OCAs具有明顯的臨床優(yōu)勢(shì)。

2 組織培養(yǎng)法保存溶液及各種介質(zhì)

2.1 保存溶液的選擇

目前,常用的組織培養(yǎng)液有乳酸林格液(ringer lactate solution,RLS)、Eagle最低必需培養(yǎng)液(eagle’s minimum essential medium,EMEM)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)、威斯康星大學(xué)溶液(university of Wisconsin,UW)、RPMI 1640培養(yǎng)液和X-VIVO培養(yǎng)液等。RLS是最早用于保存OCAs的保存液,是由電解質(zhì)和乳酸鹽組成的等滲溶液,雖然在RLS和4 ℃無菌環(huán)境保存是最基本的新鮮組織保存方法,但缺乏維持細(xì)胞生長的營養(yǎng),不能有效地支持軟骨細(xì)胞新陳代謝,無法長期維持軟骨細(xì)胞活性[17]。有學(xué)者比較RLS和DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基保存OCAs,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,OCAs在RLS中保存1周后軟骨細(xì)胞存活率顯著下降至70%以下;然而,保存在培養(yǎng)基中的OCAs有較高的軟骨細(xì)胞存活率,14 d后軟骨細(xì)胞存活率>85%[18]。將OCAs保存液從RLS改進(jìn)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以提高移植物軟骨細(xì)胞存活率,延長保存時(shí)間,具有更好的臨床效果。

2.2 營養(yǎng)介質(zhì)

為了使軟骨細(xì)胞存活更長的時(shí)間,基礎(chǔ)培養(yǎng)基必須補(bǔ)充多種營養(yǎng)成分。血清中含有細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)成分,在細(xì)胞培養(yǎng)和軟骨組織的保存中都有應(yīng)用。有研究表明,在保存液中加入胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)可以顯著提高軟骨細(xì)胞的存活率[19]。此外,Onuma等[20]從大鼠股骨遠(yuǎn)端采集的骨軟骨組織樣本,在含有0、1%、10%和50%同種異體血清的UW溶液中保存14 d,結(jié)果顯示在含有10%或更高濃度血清的UW溶液中,具有最高的軟骨細(xì)胞活力和最低的軟骨細(xì)胞退行性變化。也有研究顯示,在富含人血清蛋白的培養(yǎng)基中保存人類的OCAs可以顯著減少軟骨細(xì)胞的死亡率[14]。然而,不同批次的血清之間缺乏一致性,存在潛在的免疫反應(yīng)以及傳染病傳播的風(fēng)險(xiǎn)[21]。

生長因子是存在于生物體內(nèi),對(duì)生物的生長、發(fā)育具有廣泛調(diào)節(jié)作用的活性蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)。它可以代替培養(yǎng)基中血清高分子物質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞生長,是具有刺激細(xì)胞生長活性的細(xì)胞因子[22-23]。Mickevicius等[24]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加胰島素樣生長因子可以提高軟骨細(xì)胞的活力,改善軟骨的機(jī)電和組織學(xué)性能。Sprifermin是一種新型的重組人成纖維細(xì)胞生長因子18(human-recombinant fibroblast growth factor-18,rhFGF18),在體外刺激軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)生成,在體內(nèi)增加關(guān)節(jié)軟骨的新生基質(zhì)形成[25]。Meloni等[25]使用含有rhFGF18的培養(yǎng)基保存牛的OCAs,3周后進(jìn)行力學(xué)檢測(cè)和生化分析發(fā)現(xiàn),rhFGF18能促進(jìn)細(xì)胞外膠原蛋白和抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)的產(chǎn)生,保持關(guān)節(jié)軟骨固有的力學(xué)特性。在OCAs保存過程中,營養(yǎng)物質(zhì)的重要性是毋庸置疑的,添加什么樣的營養(yǎng)介質(zhì)和如何添加營養(yǎng)介質(zhì)還需要進(jìn)一步研究。

2.3 抗凋亡介質(zhì)

軟骨細(xì)胞死亡,尤其是由細(xì)胞凋亡引起的軟骨細(xì)胞死亡,與軟骨基質(zhì)降解和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)[24]。細(xì)胞凋亡也是OCAs獲取、保存和植入過程中軟骨細(xì)胞活力下降的原因之一[26]。研究發(fā)現(xiàn),OCAs保存過程中存在與細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶點(diǎn),如半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase),Fas受體和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等,這些凋亡相關(guān)受體在保存階段的基因表達(dá)顯著上升[27]。軟骨細(xì)胞有不同的凋亡調(diào)節(jié)途徑,一氧化氮(NO)途徑在其中占主導(dǎo)地位[26]。有報(bào)道稱,N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可預(yù)防NO誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和退行性改變[28]。Calvo等[26]在NAC富集培養(yǎng)基中保存OCAs,4周后,軟骨細(xì)胞存活率高達(dá)83.8%。此外有研究表明,AC淺表層細(xì)胞凋亡表達(dá)最高,在軟骨保存液中添加凋亡抑制劑依那西普,它可以通過抑制TNF-α來阻斷凋亡途徑,增強(qiáng)淺表層軟骨細(xì)胞的活力[29]。因此,明確促凋亡基因在OCAs保存過程中的機(jī)制,并抑制其表達(dá),保護(hù)淺表層細(xì)胞,減少移植后軟骨退化,是增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活力的有效方法。

2.4 抗炎介質(zhì)

炎癥因子在軟骨移植的作用機(jī)制尚未得知,但早有研究提到,在OCAs保存中炎癥因子的表達(dá)會(huì)顯著升高[27]。Ding等[30]實(shí)驗(yàn)證實(shí),OCAs保存過程中軟骨細(xì)胞死亡水平的上升可能導(dǎo)致基質(zhì)降解及MMP-1,MMP-3,MMP-13等蛋白酶的上調(diào),并提出可以在OCAs保存過程中添加抗炎介質(zhì),提高軟骨細(xì)胞存活率。從結(jié)構(gòu)上看,AC由ECM和軟骨細(xì)胞組成,它們通過平衡MMP及其組織抑制劑(tissue inhibitors of MMP,TIMP)的產(chǎn)生來維持ECM的穩(wěn)態(tài)。在軟骨保存液中加入抗炎介質(zhì)可能是增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活力的又一發(fā)展途徑。

3 組織培養(yǎng)法的保存環(huán)境

3.1 溫度

溫度的選擇一直是眾多學(xué)者爭(zhēng)論的話題,不同溫度產(chǎn)生不同的OCAs保存效果。組織培養(yǎng)法保存OCAs常用溫度主要為4 ℃、25 ℃和37 ℃,根據(jù)不同的保存方案選擇不同的保存溫度,可以延長軟骨細(xì)胞活力,得到更好的長期保存效果。

4 ℃保存一直是組織庫中OCAs的標(biāo)準(zhǔn)保存方法,具有微生物感染風(fēng)險(xiǎn)低、細(xì)胞代謝率低、保存成本低等優(yōu)點(diǎn)[31]。de Sousa等[14]把人軟骨組織保存在培養(yǎng)基中,分別存放在4 ℃和37 ℃環(huán)境中,14 d后發(fā)現(xiàn)37 ℃保存的軟骨細(xì)胞死亡率是4 ℃保存的2倍。Harb等[32]實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí),4 ℃保存比37 ℃保存有更好的軟骨細(xì)胞存活率。但移植過程中,OCAs從保存溫度向體溫轉(zhuǎn)變的代謝反應(yīng)也可能是導(dǎo)致移植失敗的機(jī)制之一,相比于37 ℃,在4℃長期保存并植入體內(nèi),細(xì)胞環(huán)境變化巨大,可能會(huì)對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生意料之外的損傷[33]。

膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)時(shí)的生理溫度大約為33 ～39 ℃,因此37 ℃保存OCAs對(duì)軟骨組織的長期維護(hù)可能更適合[34]。有研究表明,4 ℃冷藏保存的OCAs,軟骨細(xì)胞生存能力低于37 ℃保存,因此生理溫度更有利于軟骨細(xì)胞存活[7]。AC淺表層是軟骨最敏感和脆弱的區(qū)域,早期軟骨退化最明顯,特別是淺表層軟骨細(xì)胞的喪失,可能會(huì)導(dǎo)致臨床移植失敗[4]。有研究發(fā)現(xiàn)37 ℃保存OCAs不僅提高了軟骨細(xì)胞活力和基質(zhì)含量,而且保護(hù)了軟骨淺表層細(xì)胞,因此37 ℃環(huán)境下保存OCAs可能會(huì)成為未來組織保存的優(yōu)先選擇[35]。然而,37 ℃環(huán)境下保存OCAs具有細(xì)胞代謝率高,營養(yǎng)需求多及細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)高等缺點(diǎn)。

Stoker等[10]認(rèn)為4 ℃保存不利于軟骨細(xì)胞生長,37 ℃保存可能會(huì)增加細(xì)菌和真菌的污染,25 ℃更有利于OCAs的保存,并以此開發(fā)了密蘇里州同種異體骨軟骨移植的保存系統(tǒng)(Missouri osteochondral allograft preservation system,MOPS)。MOPS保存方案與標(biāo)準(zhǔn)保存方案相比,保存時(shí)間明顯延長,保存效果更好[10]。但是25 ℃保存OCAs研究較少,未知領(lǐng)域較多。

3.2 氣體

外部環(huán)境對(duì)OCAs保存具有很大的影響,在不同的氣體環(huán)境下,OCAs保存效果也有顯著的差異性。相關(guān)研究報(bào)道了CO2、H2和O2在OCAs保存中的不同作用[7,36-37],為OCAs的保存環(huán)境提供更多的選擇。

CO2在OCAs保存過程中是影響培養(yǎng)基pH的重要變量,5% CO2能將培養(yǎng)基的pH值維持在7.35～7.45之間,如果沒有足夠的CO2,會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基酸堿失衡,從而影響軟骨細(xì)胞活力[24,35]。Dontchos等[36]將牛的OCAs放入已添加DMEM培養(yǎng)基的圓底試管中,試管分別在大氣環(huán)境或5% CO2環(huán)境中孵育20 min,密封后于4 ℃冷藏室保存。14 d后數(shù)據(jù)顯示,OCAs預(yù)先在5% CO2中的平衡可使pH正常化,并降低淺表層軟骨細(xì)胞的死亡率,而大氣環(huán)境中預(yù)平衡,冷藏期間培養(yǎng)液pH升高,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞存活率降低。因此,添加CO2可能是減少保存期間軟骨細(xì)胞死亡的有效選擇[24,35-36]。

另一種有前途的保存OCAs軟骨細(xì)胞活性的方法是在保存液中添加H2,這種氣體具有抗炎、抗凋亡和抗氧化的特性[38-39]。有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),保存液中加入氫分子可以提高心臟、腎臟等器官或組織的體外保存效果,同時(shí)氫分子減輕冷藏期間同種異體移植物的缺血再灌注損傷,并改善早期移植的組織功能,提高移植后的細(xì)胞存活率[40]。Yamada等[37]采用富含氫的無血清培養(yǎng)基在4℃環(huán)境下保存大鼠的骨軟骨移植物,21 d后數(shù)據(jù)顯示,富含氫的培養(yǎng)基可以提高軟骨細(xì)胞的活力。Han等[5]比較不加氫氣的DMEM溶液,和分別添加氫氣濃度為0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L的DMEM溶液,4 ℃保存28 d,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示添加氫氣的DMEM組軟骨細(xì)胞存活率更高,其中氫濃度為0.8 mmol/L保存效果最好。因此,H2對(duì)離體組織培養(yǎng)具有保護(hù)作用,是保存OCAs的新選擇。

O2是人體進(jìn)行新陳代謝的關(guān)鍵物質(zhì),是人體生命活動(dòng)的第一需要。Denbeigh等[7]在無血清的培養(yǎng)基中放入人的OCAs,然后分別保存在21% O2和2% O2的環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氧含量的變化沒有顯著影響軟骨細(xì)胞的活力。在人體內(nèi)OCAs缺乏血液供應(yīng),關(guān)節(jié)腔相對(duì)密閉,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞處于一個(gè)低氧環(huán)境,為了適應(yīng)這種環(huán)境,軟骨細(xì)胞產(chǎn)生了一系列的低氧相關(guān)分子[10]。有研究發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)腔O2微環(huán)境改變,是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),維持軟骨下骨低氧微環(huán)境可有效延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[41]。因此,O2濃度是否在OCAs體外保存時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生影響,還需要進(jìn)一步研究。

4 組織培養(yǎng)液的更換頻率

合適的OCAs保存液更換頻率可以維持保存過程中軟骨細(xì)胞的活性,同時(shí)有利于降低組織庫保存的成本及組織污染的概率。Stoker等[10]比較了保存期間7 d更換一次培養(yǎng)基和不更換培養(yǎng)基對(duì)軟骨細(xì)胞存活率和ECM的影響,結(jié)果提示,培養(yǎng)基的更換沒有對(duì)軟骨細(xì)胞活力和ECM產(chǎn)生影響。然而,Qi等[31]發(fā)現(xiàn)2 d更換一次保存液,可以明顯提高軟骨細(xì)胞存活率。保存溶液的更換頻率和OCAs的體積及保存液的容積密切相關(guān),不同的移植物體積與培養(yǎng)液容積比,會(huì)產(chǎn)生不同的更換頻率,但關(guān)于這一點(diǎn)目前還沒有更進(jìn)一步的研究。不同動(dòng)物之間及動(dòng)物和人類之間,軟骨細(xì)胞需要的營養(yǎng)環(huán)境是否相同值得深思。在OCAs保存期間不更換保存液會(huì)降低細(xì)菌感染率,但可能會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞所需營養(yǎng)缺乏和代謝廢物堆積,從而降低軟骨細(xì)胞活性[31]。OCAs保存液合理更換是維持軟骨細(xì)胞活力的重要因素。

5 淺表層軟骨細(xì)胞在OCA中的重要性

OCA技術(shù)修復(fù)大型動(dòng)物模型時(shí),冷凍OCAs在移植術(shù)后6個(gè)月關(guān)節(jié)表面明顯不規(guī)則,而新鮮OCAs表面平滑[42]。這種現(xiàn)象可能與軟骨軟化和淺表層細(xì)胞減少有關(guān)[43]。因此,軟骨表面的健康狀況可能是術(shù)后功能恢復(fù)的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo),在骨軟骨組織新鮮保存過程中維持淺表層軟骨細(xì)胞活力至關(guān)重要。此外,軟骨淺表層還擁有抵抗關(guān)節(jié)腔內(nèi)剪切應(yīng)力和降低關(guān)節(jié)摩擦力的作用[44]。淺表層軟骨細(xì)胞的丟失增加了退行性變的速度,相應(yīng)的軟骨基質(zhì)蛋白的丟失也隨之增加[29]。因此,體外保存時(shí),保護(hù)淺表層軟骨細(xì)胞的活性將有利于提高OCAs移植后的生存率,維持軟骨的生理功能和機(jī)械性能的完整性。

6 總結(jié)與展望

OCAs保存液的研發(fā)可以延長保存期間軟骨細(xì)胞活性,使其達(dá)到手術(shù)前移植的標(biāo)準(zhǔn)(存活率>70%)。目前,已有OCAs保存液進(jìn)入臨床或商業(yè)應(yīng)用[45-49]。盡管該領(lǐng)域取得了一些研究進(jìn)展,但尚不清楚軟骨保存的最佳方案。而且,OCAs的最佳保存條件缺乏臨床證據(jù),需要進(jìn)行更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床轉(zhuǎn)化研究分析如何保持軟骨細(xì)胞的活性和軟骨基質(zhì)的完整性,增強(qiáng)OCAs的體外保存效果,提高OCA手術(shù)成功率[7,10]。

淺表層軟骨細(xì)胞的存活與否,與移植軟骨的整體細(xì)胞活力息息相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),淺表層的軟骨細(xì)胞會(huì)分泌一種潤滑素——蛋白多糖-4(proteoglycan 4,PRG4)來維持低摩擦的關(guān)節(jié)表面,該區(qū)域軟骨細(xì)胞的死亡可能會(huì)在OCAs植入后產(chǎn)生有害影響[50-52]。軟骨細(xì)胞活性存在區(qū)域差異,在保存時(shí),與中層和深層相比,淺表層的軟骨細(xì)胞最先發(fā)生死亡[13]。Ball等[18]也觀察到類似的趨勢(shì),移植物的淺表層細(xì)胞活力在保存7 d時(shí)已經(jīng)開始下降。考慮到淺表層具有抵抗剪切應(yīng)力和分泌蛋白多糖-4將關(guān)節(jié)摩擦降至最低水平的作用,該區(qū)域軟骨細(xì)胞丟失的影響不可低估[35,51]。因此,在OCAs保存過程中,軟骨細(xì)胞淺表層區(qū)域損傷或退變后,其分泌的蛋白多糖-4減少,可能是導(dǎo)致OCAs移植失敗的關(guān)鍵因素。目前已有研究發(fā)現(xiàn),不同的溫度、氣體和保存液介質(zhì)對(duì)淺表層軟骨細(xì)胞的保存效果均有影響且各不相同[29,35-36],在未來,組織培養(yǎng)法保存OCAs應(yīng)該從不同的方向,對(duì)軟骨淺表層細(xì)胞的存活率及ECM的完整性進(jìn)行研究,即從淺表層著手解決OCAs植入后軟骨退化問題,增加其植入后的存活率,使同種異體骨軟骨移植更廣泛應(yīng)用于臨床。