王洋 肖龍飛 耿弼江 沈龍祥

骨移植是目前臨床治療創(chuàng)傷、感染和腫瘤所導致嚴重骨缺損的主要手段[1]。自體骨移植因其良好的生物活性和無免疫原性而被認定為骨移植的“金標準”[2]。然而，供體來源有限和術后感染等嚴重并發(fā)癥限制了其在臨床上的廣泛應用[3]。為了解決上述問題，骨組織工程技術應運而生。

骨組織工程是結合生命科學、生物工程和材料科學所形成的新興交叉學科，旨在為骨缺損修復提供新的解決方案[4]。正如沃爾夫定律和機械恒溫器假說所言[5]，機械刺激可用于促進骨骼形成。成骨細胞和骨細胞都屬于刺激敏感細胞，單純將骨組織工程支架（BTES）填充到骨缺損處無法為周圍骨組織提供相應的機械刺激，這可能導致細胞物質(zhì)代謝減慢，不利于骨愈合[6]。近年來，除了將各種細胞和生物活性分子與BTES 相結合外，超聲波、光/熱和電/磁場等多種外源性物理刺激也被應用到組織工程技術中，國內(nèi)外諸多研究表明它們對骨組織再生具有一定的促進作用[7]。

超聲波是一種頻率大于20 kHz 的機械振動波，其在介質(zhì)中傳播時可以引起粒子間的局部振動，對細胞產(chǎn)生機械效應。這種效應可以增強細胞物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)細胞功能，引起細胞內(nèi)生化反應，從而促進組織修復和再生[8]。此外，超聲波對生物組織有較強的穿透能力且安全性較高，可以對組織深處的細胞和材料進行無創(chuàng)性干預[9]。低強度脈沖超聲（LIPUS）是一種聲強小于3 W/cm2、以脈沖形式輸出的超聲波[10]，其可以提供低強度的機械刺激，對細胞產(chǎn)生微機械作用[11]。早在1994 年和2000 年，LIPUS 就被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于治療新發(fā)骨折和骨不連[12-14]。

1 促進細胞增殖與遷移

LIPUS 已被證實可以提高BTES 中骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）和其他細胞的活力并促進細胞增殖[15]。Carina 等[16]將雙鏈DNA 的含量作為鎂-羥基磷灰石/膠原復合支架上BMSC 增殖的衡量標準，觀察到經(jīng)LIPUS 處理14 d 后，雙鏈DNA的含量增加了1.7 倍。Yang 等[17]利用LIPUS 刺激大鼠BMSC，發(fā)現(xiàn)其存活率提高了19.57%，且對LIPUS 的參數(shù)進一步調(diào)整后（6.92 V，1.02 MHz，7.3 min），BMSC 的存活率進一步提高了5.36%。Xie 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 刺激可以驅(qū)動BMSC從G0/G1 期轉(zhuǎn)變到S 期和G2/M 期，這可能是通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路和上調(diào)細胞周期蛋白D1 來實現(xiàn)的。Fan 等[19]使用CCK-8 法評估種植在鈦合金支架上BMSC 的活力和增殖情況，發(fā)現(xiàn)在LIPUS 刺激的第4 天和第7 天，細胞活力明顯增強且數(shù)量顯著增加。Cai 等[20]在鈦合金表面制備了鈦酸鋇壓電陶瓷涂層，并應用LIPUS 對附著其上的MC3T3-E1 細胞進行刺激，結果表明MC3T3-E1 細胞的黏附和增殖能力增強，細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，其機制可能與L 型鈣離子通道開放和Cav1.2 蛋白增加有關。Puts等[21]研究LIPUS 對饑餓小鼠骨樣細胞存活的影響，用聚焦LIPUS 刺激10 min 后，細胞生長和存活基因及與細胞間通訊相關基因的表達增強，細胞活力得到改善。

LIPUS 促進BMSC 遷移也得到實驗證實。Chen 等[22]將LIPUS 預處理后的BMSC 注射到大鼠股骨缺損部位，結果表明LIPUS 可以促進BMSC遷移，提高骨缺損愈合率，其機制可能與黏著斑激酶（FAK）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2 信號通路激活有關。Wang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 在LIPUS 的刺激下可以向牙槽骨缺損區(qū)遷移和歸巢。Xia 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 刺激可以顯著激活細胞自噬，增加基質(zhì)細胞衍生因子（SDF）-1 和趨化因子受體CXCR4 的表達，促進BMSC 遷移。此外，超聲可以激活機械感應-整合素蛋白，促進活化的整合素與黏著斑結合，從而促進細胞骨架與細胞外基質(zhì)之間的連接[25]。

2 促進成骨分化

研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 刺激可以促進成骨分化，增加Ⅰ型膠原蛋白（COL1）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2、骨橋蛋白（OPN）、Runt 相關轉(zhuǎn)錄因子（RUNX）2 和成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osx 等的表達[26-27]。Jin 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 可以在0.5%（v/v）脂質(zhì)微泡的存在下增強聚乳酸-乙醇酸/α-磷酸三鈣3D 打印支架上BMSC 的生長和成骨分化能力。Tang 等[29]用LIPUS 刺激苧麻基羧甲基纖維素，兩者的協(xié)同作用進一步促進了MC3T3-E1 細胞增殖和成骨分化。Setoguchi 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 與BMP-9 聯(lián)合作用可以顯著增加去分化脂肪細胞的成骨分化，但這種聯(lián)合作用可以被吲哚美辛所抑制。Camarero-Espinosa 等[31]使用聚己內(nèi)酯和聚乳酸制備了一種可降解的動態(tài)Janus 支架，其在LIPUS 的刺激下可以發(fā)生結構轉(zhuǎn)變，并促進BMSC 增殖和成骨分化。Feng 等[32]比較1 MHz 和3.2 MHz 的LIPUS 對多孔鈦合金支架的成骨作用，結果表明相較于對照組，1 MHz 頻率組與3.2 MHz 頻率組支架上細胞的ALP活性和OCN 水平均有所提升，但此兩組之間差異并無統(tǒng)計學意義。Yao 等[33]制備了一種環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸修飾的納米氣泡，發(fā)現(xiàn)LIPUS可促進由肌動蛋白微絲聚合、瞬時受體電位M7（TRPM7）調(diào)節(jié)和細胞外Ca2+內(nèi)流誘導的BMSC 成骨分化。

3 促進骨礦化與骨整合

LIPUS 被證明是促進體內(nèi)外骨礦化的有效手段。Maung 等[34]用LIPUS 對小鼠骨膜來源細胞進行處理，盡管未觀察到細胞增殖，但ALP 活性顯著增加，并有礦化結節(jié)形成。Jiang 等[35]用強度為100 mW/cm2的LIPUS 刺激脂肪干細胞，發(fā)現(xiàn)其可在體外誘導脂肪干細胞礦化結節(jié)的形成，并增加成骨相關基因和骨唾液蛋白的表達。Zhou 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，用LIPUS 刺激聚乙二醇二丙烯酸酯3D打印支架3 周，支架內(nèi)鈣沉積量增加10%以上。Kuang 等[37]研究證實，LIPUS 在體外對多孔陶瓷支架中的牙囊細胞具有促進骨礦化的作用。而Das等[38]研究證實，在體外用超聲波刺激壓電聚乳酸納米纖維支架可以增強支架中BMSC 的成骨分化，從而改善骨礦化。Feng 等[32]的體內(nèi)實驗表明，LIPUS 刺激3 周及6 周后，接種有MC3T3-E1 細胞的鈦合金支架鈣沉積量增加。

LIPUS 主要在早期促進體內(nèi)植入物骨整合[39-40]，有學者推斷其促進植入物骨整合可能與降鈣素基因相關肽α 的合成和分泌有關[41]。Liu 等[42]使用LIPUS 干預兔股骨和脛骨鈦合金植入物，3 周后植入物周圍骨組織密度、骨體積分數(shù)及骨小梁厚度均顯著增加。Cao 等[43]測量接種有MC3T3-E1 細胞的鈦合金支架孔隙占有率，發(fā)現(xiàn)經(jīng)LIPUS 處理3 周和6 周后，支架孔中新生骨體積更大。Ruppert等[44]將LIPUS 與局部振動器所產(chǎn)生的低幅度、高頻振動進行對比，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)LIPUS 刺激4 周，可促進大鼠股骨鈦合金植入物周圍骨整合，該作用較振動刺激器產(chǎn)生的效果更為顯著，而刺激8 周后兩者差異并不明顯。Zhou 等[45]用LIPUS 對卵巢切除大鼠股骨植入物進行處理，2～4 周后鈦植入物周圍骨的骨體積分數(shù)及植入物骨結合率顯著提高，證實LIPUS 能有效促進骨質(zhì)疏松骨組織中鈦合金植入物的骨整合。此外，Chen 等[46]發(fā)現(xiàn)，LIPUS與脂肪源性基質(zhì)細胞的結合可以促進兔髕骨與髕腱連接處的骨再生，愈合部位骨體積分數(shù)、骨小梁厚度和骨小梁數(shù)均顯著增加。

4 控制BTES 內(nèi)生物活性分子及藥物的釋放

超聲波因其顯著的組織穿透能力而非常適合作為植入物的刺激觸發(fā)器，這種高頻率振動波所產(chǎn)生的機械效應可以控制聲響應BTES 中生物活性物質(zhì)及藥物的釋放速率，從而對骨再生產(chǎn)生有益影響[47]。Kennedy 等[48]開發(fā)了一種超聲波可爆破的海藻酸鹽壁膠囊以封裝BMP-2 功能化修飾的金納米顆粒溶液，當膠囊受到超聲波沖擊后，膠囊內(nèi)金納米顆粒幾乎100%釋放，并誘導BMSC 的成骨分化。Zhu 等[49]將摻有BMP-2 負載微球的聚乳酸/聚乳酸-乙醇酸/聚己內(nèi)酯復合支架植入骨壞死部位，發(fā)現(xiàn)LIPUS 刺激可以促進微球中BMP-2 的釋放，使得復合支架周圍新形成骨的骨密度、礦化程度和成骨蛋白表達均得到顯著改善。Moncion 等[50]制備了一種摻有負載堿性成纖維細胞生長因子的全氟化碳纖維蛋白水凝膠，水凝膠暴露于超聲波會導致全氟化碳結構破壞，并加速堿性成纖維細胞生長因子的釋放速率，從而刺激骨缺損周圍血管生長。He 等[51]設計了一種由聚乳酸、海藻酸鹽和Ca2+交聯(lián)形成的聲學響應支架，該支架中封裝了SDF-1 和BMP-2；脈沖超聲作用后，支架中Ca2+依賴性交聯(lián)被破壞，加速支架降解并釋放SDF-1和BMP-2，從而將宿主內(nèi)源性BMSC 募集并捕獲到骨缺損部位。另有研究報道，超聲波作用可使BTES 內(nèi)固體顆粒尺寸更小且分散程度更高，這也可能是BTES 內(nèi)顆粒得以更好發(fā)揮作用的原因[52-53]。

5 抗菌及抑制植入物炎癥反應

超聲波可以在聲敏劑存在的情況下發(fā)揮有效的抗菌作用[54]。Wu 等[55]開發(fā)了一種金納米顆粒修飾的鈦酸鋇壓電納米復合材料，超聲波刺激后該納米復合材料的抗菌效率可達99.23%，并能促進金黃色葡萄球菌感染傷口的愈合。此外，超聲波與其他物理刺激的協(xié)同作用可以進一步提高抗菌效果[56]。Zeng 等[57]在鈦植入物表面覆蓋由黑磷和聚多巴胺組成的復合涂層，依次用超聲波和近紅外光對該涂層刺激10 min 和20 min 后，其表現(xiàn)出較高的抗菌活性（97.3%），并可顯著促進體外成骨和體內(nèi)植入物的骨整合。

植入物植入骨缺損部位后會引起一系列免疫排斥反應。首先大量蛋白質(zhì)分子在支架附近聚集，募集免疫細胞（中性粒細胞）并促使炎癥因子釋放，從而誘導急性炎癥反應[58]。在慢性炎癥期間，巨噬細胞聚集并形成異物巨細胞，它可以降解支架表面的生物材料，從而影響生物相容性。炎癥反應消退后，大量肉芽組織形成，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維包膜，大量的纖維組織占據(jù)骨缺損部位，阻礙骨再生[59]。超聲波在抑制骨植入物炎癥反應中的作用已被證實。此外，LIPUS 可抑制脂多糖誘導的p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化并延緩局部肌肉萎縮[60]，促進細胞外基質(zhì)合成，抑制核因子（NF）-κB信號通路激活，從而抑制炎癥反應[61]。Wu 等[62]研究顯示，LIPUS 刺激后的極化鈦酸鋇/鈦合金支架周圍組織中出現(xiàn)高比例的CD68 CD206 M2 型巨噬細胞，極化鈦酸鋇/鈦合金支架可以通過抑制MAPK/c-Jun 氨基末端激酶(JNK)信號通路并激活巨噬細胞中的氧化磷酸化和三磷酸腺苷（ATP）合成來調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。

6 植入支架超聲成像

植入支架體內(nèi)環(huán)境的評估對于其臨床轉(zhuǎn)化起至關重要的作用[63]。Kim 等[64]在小鼠模型中首先使用了超聲彈性成像來評估聚（1,8-辛二醇-檸檬酸酯）支架降解，發(fā)現(xiàn)支架彈性模量與支架重量損失（降解）相關。隨后，Park 等[65]和Zhou 等[66]分別用超聲彈性成像評估聚氨酯組織結構降解和聚乳酸-乙醇酸原位成型植入物降解。Prada 等[67]通過超聲波在豬顱骨缺損模型中實現(xiàn)了對聚烯烴基聚合物假體的成像。Harvestine 等[68]將BMSC 封裝在海藻酸鹽水凝膠中并在成骨條件下培養(yǎng)4 周，使用熒光壽命成像和超聲反向散射顯微鏡對其進行評估，線性回歸分析確定了成像參數(shù)（如熒光壽命、聲衰減系數(shù)等）與生化測試之間的強相關性，以此證明了超聲波應用于骨組織工程植入物成像的可行性。Melchor 等[69]將接種人軟骨細胞的3D打印聚乳酸支架放入超聲波集成的生物反應器中培養(yǎng)，通過對超聲波信號的分析，從而實現(xiàn)對軟骨組織形成過程的無創(chuàng)實時監(jiān)測。

7 結語

超聲波作為一種兼具機械刺激和成像功能的技術，對骨組織工程具有十分積極的影響。LIPUS更是因為操作方便、療效確切等優(yōu)勢被批準用于臨床治療骨折和骨不連，這為日后LIPUS 響應性BETS 走向臨床提供了無限可能。然而，由于組織工程材料種類各異，LIPUS 各項參數(shù)（頻率、強度和時間）的最佳值未能確定，這是未來需進一步研究的方向。此外，盡管大量研究已證實LIPUS對骨再生有利，但LIPUS 對BETS 本身的作用及其機制還有待進一步研究，這將為新型LIPUS 響應性材料的開發(fā)提供思路。