馬玉欣，馬 淵，徐勝杰，宋積壽，馬 琴，傅思武

西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，甘肅 蘭州 730030

在法醫(yī)學(xué)中，死亡時(shí)間是指死后間隔時(shí)間（postmortem interval，PMI）或人體死亡后到法醫(yī)推斷所經(jīng)過的時(shí)間，也就是從死亡發(fā)生到法醫(yī)進(jìn)行檢驗(yàn)的時(shí)間區(qū)間[1]。從傳統(tǒng)方法根據(jù)尸體溫度、尸體現(xiàn)象、尸體腐敗程度、胃腸內(nèi)容物消化程度、膀胱尿量及昆蟲變化等數(shù)據(jù)綜合分析來推斷PMI，到如今檢測(cè)尸體體液中的生化變化、死后機(jī)體生物分子物質(zhì)，如脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）及蛋白質(zhì)等物質(zhì)的降解變化規(guī)律、超聲反應(yīng)、代謝組學(xué)、影像學(xué)及利用眼組織結(jié)構(gòu)等眾多方法綜合推斷PMI，為法醫(yī)學(xué)提供了較好的方法。然而，受自身和環(huán)境的雙重影響，溺亡尸體的變化較陸地更為復(fù)雜。目前，除了硅藻和生化檢驗(yàn)等方法，隨著對(duì)腸道菌群研究的逐漸深入，可利用基于腸道菌群16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)與機(jī)器學(xué)習(xí)算法來推斷PMI[2]。

1 腸道菌群

腸道菌群是指人體腸道中存在的細(xì)菌總數(shù)，數(shù)量龐大，是人體細(xì)胞總數(shù)的10 倍。腸道菌群在出生前發(fā)育，于嬰兒期和兒童期發(fā)展。人出生時(shí)，腸道內(nèi)處于無菌狀態(tài)，在出生后數(shù)小時(shí)到數(shù)月之間，細(xì)菌通過口腔和肛門侵入并迅速定植于腸道。腸道菌群的形成被視為物種之間對(duì)所需資源進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)和互利共生的結(jié)果。在人類生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，都有特定腸道微生物群的參與。這些微生物在維生素和氨基酸的合成、糖和蛋白質(zhì)的代謝及礦物質(zhì)的吸收方面發(fā)揮著重要的作用。其不僅參與體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持和功能的發(fā)揮，還影響著尸體的分解過程，在尸體的腐爛過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。

2 腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法

過去一般采用培養(yǎng)法來檢測(cè)腸道菌群，但由于腸道菌群大多為厭氧微生物，而能夠進(jìn)行培養(yǎng)的微生物種數(shù)僅占微生物總類的1%，隨著微生物測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，利用擴(kuò)增子技術(shù)和宏基因組測(cè)序技術(shù)獲得的微生物種群隨PMI 變化的演替模式等信息可進(jìn)行定量處理，通過將量化結(jié)果與人工智能算法結(jié)合，可以構(gòu)建更準(zhǔn)確的PMI 推斷模型[4]。此外，由于腸道菌群可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，主要包括短鏈脂肪酸、色氨酸及其衍生物、膽汁酸等物質(zhì)?？衫贸咝б合嗌V/四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測(cè)代謝產(chǎn)物，并根據(jù)其質(zhì)子化離子的色譜圖和特征，分析不同代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律[5]，可以分析出腸道菌群的變化特征。

3 死亡后腸道菌群的變化

有研究發(fā)現(xiàn)，闌尾和橫結(jié)腸的菌群種類存在差異，且闌尾的微生物種類比橫結(jié)腸多，菌群多樣性高，并且在尸體分解進(jìn)程中，闌尾中的微生物群落具有一定的可推斷的演替規(guī)律。隨著PMI 的推移，厚壁菌門（firmicutes）及其亞類的相對(duì)豐度逐漸提升，而擬桿菌門（Bacteroides）及其亞類的相對(duì)豐度逐漸降低[6]。同時(shí)，機(jī)體外部的微生物開始于體內(nèi)定植，不同尸體受年齡、種族、性別及飲食等因素影響，其腸道微生物的分布也會(huì)存在差異，有證據(jù)表明[7]，不同性別尸體的微生物群落組成存在一定的差異。Guo 等[8]發(fā)現(xiàn)，隨著尸體的降解，腸道的微生物群中擬桿菌門（Bacteroides）和厚壁菌門（firmicutes）的數(shù)量不斷下降，而變形菌門（proteobacteria）的數(shù)量則在不斷上升。DeBruyn 等[9]對(duì)尸體盲腸中的微生物群進(jìn)行連續(xù)采樣和測(cè)序，結(jié)果表明，隨著PMI 的推移，腸道菌群的豐富度顯著增加，多樣性顯著降低。Hauther 等[10]對(duì)6 具腐爛尸體近端結(jié)腸的微生物群樣本進(jìn)行了DNA 測(cè)序，并使用RT qPCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)近端結(jié)腸中擬桿菌門（Bacteroides）和乳酸菌門（Lactobacillus）的相對(duì)豐度隨PMI 的增加而呈指數(shù)式下降。

李歡等[11]對(duì)處死大鼠的直腸區(qū)進(jìn)行了一定時(shí)間梯度擦拭采樣，第1、5 天，腸球菌屬（Enterococcus sp.）是腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌群；第10、15、20 天，蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）為優(yōu)勢(shì)菌群，松鼠葡萄球菌（Staphylococcus squirrels）消失；糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是第25、30 天的優(yōu)勢(shì)菌群。采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)，發(fā)現(xiàn)樣品菌群的多樣性隨PMI 的增加呈下降趨勢(shì)，組內(nèi)相似度也呈下降趨勢(shì)。在尸體腐爛的活躍階段，受腐爛菌群影響，產(chǎn)生了大量甲烷、硫氫化物、尸胺等腐敗氣體。隨后，該團(tuán)隊(duì)研究人員[12]在類似研究中也發(fā)現(xiàn)，直腸樣本的微生物多樣性和豐富度隨PMI 的增加而呈下降趨勢(shì)。Jie Cao 等[13]采用16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)大鼠盲腸內(nèi)容物中的腸道菌群，結(jié)果顯示死后30 d 內(nèi)大鼠腸道的微生物菌群總數(shù)未發(fā)生顯著變化，但菌群多樣性呈上升趨勢(shì)，且其組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，通過建立的PLS 回歸（Partial least squares regression，偏最小二乘法回歸）模型，發(fā)現(xiàn)PMI 與腸道菌群高度相關(guān)，呈一定的時(shí)序性變化趨勢(shì)。以上結(jié)果均提示，腸道菌群的演替可以作為輔助PMI 推斷的一大潛在指標(biāo)。

4 溺亡后腸道菌群的研究進(jìn)展

與陸地等環(huán)境狀況相比，水中的環(huán)境更為復(fù)雜多樣，受水流、溫度、環(huán)境等諸多因素影響，極大地限制了法醫(yī)工作者根據(jù)尸體現(xiàn)象和法醫(yī)昆蟲學(xué)對(duì)PMI的推斷。在門水平上，變形菌門（proteobacteria）和厚壁菌門（firmicutes）在不同器官的微生物群落中占據(jù)主導(dǎo)地位[14-15]。與陸地尸體的研究結(jié)果相似，相關(guān)研究[15-16]表明，在尸體腐敗后期，水中尸體肺部和盲腸中的梭狀芽孢桿菌（clostridium）與淡水環(huán)境下的PMI 密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，尸體在水環(huán)境下，厚壁菌門（firmicutes）隨PMI 延長(zhǎng)而逐漸增加，變形菌門（proteobacteria）隨PMI 延長(zhǎng)而逐漸減少。在尸體的整個(gè)腐爛進(jìn)程中，擬桿菌門（Bacteroides）是主要微生物群。Zhang 等[18]基于水中小鼠的盲腸微生物群落構(gòu)建了PMI 推斷模型。死亡后14 d 內(nèi)的平均絕對(duì)誤差（mean absolute error，MAE）為0.818 d。但相關(guān)研究多集中于流速較慢的淡水中的尸體，復(fù)雜水環(huán)境中微生物群落的演替仍有待進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)與應(yīng)用前景

綜上所述，利用尸體腸道相關(guān)微生物群的演替模式進(jìn)行PMI 推斷具有一定的潛力，特別是采用基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)尸體腸道微生物群的組成和演替，該方法相較于傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢(shì)。與根據(jù)尸體現(xiàn)象推斷PMI 相比，法醫(yī)工作者的主觀因素對(duì)PMI 的影響較?。慌c昆蟲學(xué)等估計(jì)誤差較高的方法相比，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建的PMI 推理模型的準(zhǔn)確率已大幅提升。

目前仍然缺乏溺亡尸體中腸道菌群代謝產(chǎn)物隨PMI 變化規(guī)律的有力證據(jù)，由于水中環(huán)境對(duì)腸道微生物的影響因素眾多，關(guān)于其是否會(huì)影響PMI 的準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。未來有望發(fā)現(xiàn)和確立腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，建立尸體死亡時(shí)間腸道微生物信息數(shù)據(jù)庫，為法醫(yī)工作者提供更精確的判斷PMI 的方法。