劉 瑩,李 峰,殷宗俊,王敬茹,李書光*,鄭先瑞*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;2.安徽農業(yè)大學動物科技學院,安徽合肥 230036;3.濱州市濱城區(qū)畜牧獸醫(yī)服務中心,山東濱州 256600)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)是導致豬呼吸道疾病綜合征的主要病原體之一,這是一種慢性豬呼吸系統(tǒng)疾病[1],其主要癥狀為氣喘并伴隨著咳嗽,該病會導致豬生產性能降低、飼料轉化率下降,同時較易受到感染和誘導引發(fā)其他疾病,這就增加了對該病進行防治的困難,對我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和經濟效益造成嚴重影響[2-3]。豬肺炎支原體感染在幾乎所有的生豬產區(qū)都非常普遍,隨著藥物使用的增加和豬生產性能的下降,給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經濟損失[4]。該病菌會附著在氣管、支氣管和細支氣管的纖毛上皮細胞上,影響了黏膜清除系統(tǒng),并調節(jié)免疫系統(tǒng),使動物更容易受到其他呼吸道病原的感染[5]。豬肺炎支原體不僅能通過空氣傳播,還能進行垂直傳播,仔豬染病后,臨床癥狀表現(xiàn)較晚。一旦豬場感染該病,病原很難在短時間內清除,且容易出現(xiàn)繼發(fā)感染[6]。因此,必須對豬群進行監(jiān)測,以便能早發(fā)現(xiàn)并早治療,避免造成更大的經濟損失。

豬肺炎支原體的診斷主要有4種方法,包括臨床診斷、病理組織學診斷、病原檢測和抗體檢測等[7],感染豬肺炎支原體的臨床癥狀為間歇性且強度可變的干咳[8],在肺臟呈現(xiàn)“肉樣” 或“蝦肉樣”實變[9],剖檢變化呈現(xiàn)的特征是融合性支氣管肺炎,病理組織學診斷時需要在排除其他病原的情況下,檢測到特異性抗原或抗體,才能最終確診為豬肺炎支原體感染[10],目前,ELISA是臨床應用最廣泛的Mhp的抗體檢測方法[11],經典的病原檢測方法還有常規(guī)PCR,具有簡單、方便、快速及節(jié)約成本等優(yōu)點,但是其發(fā)展受到限制[12],其中重要的原因是靈敏度低,不能精確定量。本研究基于豬肺炎支原體編碼乳酸脫氫酶的P36因基因序列保守區(qū),設計引物和探針,建立一種Mhp實時熒光定量PCR檢測方法,具有敏感性高、特異性強、重復性好、耗時短等優(yōu)點。該方法可為Mhp的監(jiān)測和檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及樣品 豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae) 疫苗株RM48株、雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum)R株、豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis)WH-C株、綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae)HS2017株、牛支原體(Mycoplasmabovis)PG45株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus virus type 2,PCV2)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)等病原均由山東綠都生物科技有限公司保存。

1.1.2 主要試劑 Simply P病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒,BioEasy多重熒光qPCR預混液(含UDG)試劑盒,杭州博日生物科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 微量分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop 2000),美國Thermo Fisher Scientific公司產品;鯤鵬基因熒光定量PCR儀(Archimed X4),鯤鵬基因(北京)科技有限公司產品;電熱恒溫培養(yǎng)箱(DRP-9272),上海森信實驗儀器有限公司產品;生物安全(BSC-130ⅡA2),蘇州安泰空氣技術有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針設計 根據(jù)豬肺炎支原體編碼乳酸脫氫酶的P36基因序列,在NCBI上選擇其保守區(qū)域,利用Prime premier 5.0軟件設計其引物探針MhpF、MhpR和MhpP(表1)。擴增的目的片段大小為111 bp。引物和探針由通用生物公司合成。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.2.2 豬肺炎支原體DNA模板的制備 根據(jù)病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒的說明書,提取Mhp的基因組DNA,并使用微量分光度計測定其濃度和純度,稀釋后作為標準品,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 豬肺炎支原體熒光PCR反應體系的優(yōu)化 在模板濃度相同的情況下,以Mycoplasma基因組DNA為模板,通過矩陣法對引物濃度(2.5～10 μmol/L)和探針濃度(1.25～5 μmol/L)進行優(yōu)化,建立最佳的反應體系后,設置的退火溫度為(50～60 ℃)進行優(yōu)化,確定最佳的退火溫度。

熒光定量PCR反應體系(20 μL)組成如下:PCR反應液10 μL,Mycoplasma引物終濃度為10 μmol/L、探針終濃度為5 μmol/L,模板2 μL,ddH2O補足至20 μL。反應條件:50 ℃ 5 min;95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30s,40個循環(huán),根據(jù)Ct值和熒光強度來確定最佳的反應條件。

1.2.4 建立豬肺炎支原體PCR標準曲線 以106～102copies/μL Mhp基因組DNA為模板,經過Archimed Analyzer1.0 PCR儀進行擴增,每個稀釋度重復3次,并用Archimed Analyzer 1.0 PCR儀繪制標準曲線。

1.2.5 特異性試驗 以豬肺炎支原體、豬鼻支原體、牛支原體、綿羊肺炎支原體、雞毒支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒等核酸為模板,在最佳的反應體系和退火溫度下進行特異性試驗。

1.2.6 敏感性試驗 以106～100copies/μL Mhp基因組DNA為模板,經Archimed Analyzer 1.0 PCR儀檢測其敏感性。

進行常規(guī)PCR擴增,反應體系(20 μL)為:2×EasyTaqSuper Mix 10 μL,F(10 μmol/L)1 μL,R(10 μmol/L)1 μL,模板DNA 2 μL,dd H2O 6 μL。

PCR擴增過程中,按照以下程序進行:預變性95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán);終延伸72 ℃ 10 min。擴增結束后,取5 μL擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,在220 V電壓下,電泳30 min后觀察結果,比較熒光定量PCR和常規(guī)PCR的靈敏度。

1.2.7 重復性試驗 使用豬肺炎支原體標準模板,選取A:1×106、B:1×105、C:1×104、D:1×103、E:1×102copies/μL等5個稀釋度作為熒光定量PCR的陽性模板,進行重復性檢驗,并分析其變異率。

1.2.8 熒光定量PCR的臨床應用 對采集的30份臨床病料(來源于豬場的鼻拭子)提取基因組DNA,用本試驗建立的TaqMan實時熒光定量PCR和常規(guī)PCR對其進行檢測,通過統(tǒng)計豬肺炎支原體陽性率來比較兩種方法的檢出率。

2 結果

2.1 反應體系的優(yōu)化

以1×105copies/μLMycoplasma基因組DNA為模板進行熒光定量PCR擴增。通過對引物濃度和探針濃度進行優(yōu)化,確定最佳體系為:F(10 μmol/L)1 μL,R(10 μmol/L)1 μL,P(5 μmol/L)0.5 μL,模板2 μL,dd H2O補足至20 μL。優(yōu)化的反應條件:50 ℃ 5 min;95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。

2.2 標準曲線的建立

將1×106copies/μL的Mycoplasma基因組以10倍倍比系列稀釋(1×102～1×106),將等體積稀釋后的樣品作為模板進行熒光定量PCR擴增,獲得擴增曲線(圖1)以及標準曲線(圖2),得到基因組拷貝數(shù)(x)和Ct值(y)的線性方程為y=-3.419x+39.886,線性相關系數(shù)R2為0.998,擴增效率為96.10%,擴增產物的Ct值與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關系。

1～5.基因組DNA濃度分別為1.0×106 ～1.0×102 copies/μL

圖2 豬肺炎支原體熒光定量PCR標準曲線

2.3 特異性試驗結果

采用建立的熒光定量PCR對豬肺炎支原體、豬鼻支原體、牛支原體、綿羊肺炎支原體、雞毒支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒的核酸樣品進行檢測,結果顯示(圖3),僅豬肺炎支原體出現(xiàn)熒光信號,檢測結果為陽性,其他8種病原核酸的檢測均未達到閾值,檢測結果為陰性,這表明所建立的熒光定量PCR檢測方法具有較強的特異性。

1、2、3、4、5、6、7、8、9分別為豬肺炎支原體、豬鼻支原體、牛支原體、綿羊肺炎支原體 、雞毒支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒

2.4 敏感性試驗結果

將1×106copies/μL的Mycoplasma基因組以10倍倍比系列稀釋(1×100～1×106),等體積混勻后作為模板,進行熒光定量PCR擴增。結果表明(圖4),熒光定量PCR對Mycoplasma基因組的檢測下限為10 copies/μL,而常規(guī)PCR對的檢測下限為100 copies/μL,通過比較兩種方法可檢測的最低濃度,發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR比常規(guī)PCR的靈敏度提高了10倍,說明熒光定量PCR的敏感性較高。

M.DNA標準DL 2 000; 1～7.基因組DNA濃度分別為1.0×106～1.0×100 copies/μL

2.5 重復性試驗結果

使用已建立的TaqMan實時熒光定量PCR,對5個不同濃度的豬肺炎支原體核酸標準品進行3次批內和3次批間的重復試。結果顯示(表2),TaqMan實時熒光定量PCR的組內和組間變異系數(shù)(CV)值均小于2%,表明該方法具有良好的重復性。

表2 熒光定量PCR重復性試驗

2.6 臨床病料的檢測

對采集的30份臨床樣品利用本研究建立的TaqMan實時熒光定量PCR進行檢測,并與常規(guī)PCR的結果進行比較,TaqMan實時熒光定量PCR檢測Mhp的陽性率為63%(19/30),而常規(guī)PCR檢測Mhp的陽性率為30%(9/30),表明本試驗建立的TaqMan實時熒光定量PCR比常規(guī)PCR更敏感。

3 討論

豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)是豬呼吸道疾病綜合征的主要病原體之一,也是世界范圍內最重要的豬病病原[5]。疫苗接種是預防和控制該疾病的最具有成本效益的策略,但仍然無法完全控制豬肺炎支原體感染,造成了顯著的經濟損失[13]。支原體作為基因組規(guī)模和代謝途徑有限的最小微生物之一,Mhp可以利用多種機制實現(xiàn)免疫逃避效應,并從其宿主中獲取足夠的營養(yǎng)物質,表明Mhp與豬機體之間存在較強的相互作用[14]。在南美洲,根據(jù)分子診斷[15],阿根廷門多薩省豬的豬肺炎支原體患病率估計為48%,巴西東南部和南部的患病率從52%～90%以上[16-17]。說明豬肺炎支原體已經成為嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)經濟發(fā)展的重要疫病之一,因此對豬群進行定期監(jiān)測并采取及時的防控是非常必要的。

為此,養(yǎng)豬業(yè)需要可對豬肺炎支原體快速定量檢測的方法,本試驗建立了豬肺炎支原體TaqMan 實時熒光定量PCR檢測方法,該方法比常規(guī)PCR更靈敏,最低檢出濃度可達10 copies/μL,比肖婷等[18]建立的豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2型和3型多重熒光定量PCR檢測方法的靈敏度高,與武昱孜[19]建立的豬肺炎支原體和豬鼻支原體雙重熒光定量PCR檢測方法靈敏度相當。此外,該方法具有較好的的特異性,對豬肺炎支原體、豬鼻支原體、羊支原體、牛支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒等均無交叉反應,說明具有良好的特異性;在進行3次重復性試驗檢測不同濃度的核酸標準品,變異系數(shù)均小于2%,表明具有良好的重復性。使用該方法對選取的30份臨床病料(來源于豬場的鼻拭子組織樣品)進行檢測,結果表明,相較于常規(guī)PCR,實時熒光定量PCR具有更高的敏感性,可用于豬肺炎支原體感染的檢測。總的來說,實時熒光定量PCR不僅靈敏性高,特異性和重復性也較好,可以用于臨床樣品檢測和流行病學調查,為及時對感染后的豬場采取措施提供技術支持。