劉珊珊 陸忠華

摘要： 目的 分析ALT水平正常的慢性乙型肝炎 （CHB） 患者的肝組織病理學特點及與血清學指標間的關系。方法 收集2018年4月—2021年6月無錫市第五人民醫(yī)院137例ALT水平正常CHB患者的臨床資料， 分析肝組織病理與血清學指標間的差異及相關性。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用Speraman秩相關進行相關性分析。采用Logistic回歸進行多因素分析。結果 ALT水平<20 U/L、 20～29 U/L、 30～40 U/L患者中分別有57. 4%、 53. 4%、 75%具有顯著炎癥壞死（≥G2）， 63. 8%、62. 1%、 75%具有顯著纖維化 （≥S2）。HBeAg陽性/陰性、 不同水平的血清HBV DNA、 不同水平的血清HBV RNA在炎癥活動程度分級上差異均有統(tǒng)計學意義 （χ2值分別為10. 008、 6. 911、 7. 946， P值均<0. 05）； HBeAg陽性/陰性、 不同水平的血清HBV RNA在纖維化分期上差異均有統(tǒng)計學意義 （χ2值分別為7. 996、 10. 874， P值均<0. 05）。肝臟炎癥程度及纖維化分期與血清HBV DNA無明顯相關性（rs=0. 024， P=0. 785； rs=0. 039， P=0. 652）， 與血清HBV RNA存在顯著相關性（rs=0. 222， P=0. 009； rs=0. 187， P=0. 029）。多因素分析提示HBeAg陽性是CHB患者肝臟發(fā)生炎癥壞死（OR=?0. 302， 95%CI： ?1. 160～0. 386， P=0. 002） 及纖維化 （OR=?0. 387， 95%CI： ?1. 160～0. 386， P=0. 011） 的獨立危險因素。結論 ALT水平正常的CHB患者的肝臟組織存在不同程度的顯著炎癥壞死及纖維化， HBeAg陽性是這類患者肝臟組織出現(xiàn)顯著炎癥壞死及纖維化的獨立危險因素。

關鍵詞： ?乙型肝炎病毒； ?丙氨酸轉氨酶； ?HBV DNA； ?HBV RNA； ?病理學

基金項目： ?無錫市醫(yī)學重點學科建設項目-創(chuàng)新團隊 （CXTD2021009）； ?太湖人才計劃 （20200803）

Serological features and liver histopathology of chronic hepatitis B patients with normal alanine aminotransferase

LIU Shanshan1， ?LU Zhonghua1， 2. ?（1. ?Wuxi Clinical Medical College Affiliated to Nanjing Medical University， ?Wuxi， ?Jiangsu

214000， ?China； ?2. Department of Hepatology， ?Wuxi Fifth People s Hospital， ?Wuxi， ?Jiangsu 214000， ?China）

Corresponding author： ?LU Zhonghua， ?lu_z_h@126.com ?（ORCID： ?0000-0002-5388-8301）

Abstract： Objective To investigate the liver histopathological features of chronic hepatitis B （CHB） patients with normal alanine aminotransferase （ALT） and their correlation with serological markers. Methods Clinical data were collected from 137 patients with normal ALT who were treated in Wuxi Fifth People s Hospital from April 2018 to June 2021， and the differences in liver histopathology and serological markers were analyzed， as well as the correlation between liver histopathology and serological markers. The chi-square test was used for comparison of categorical data between groups， and the Kruskal-Wallis H test was used for comparison of data between multiple groups. A Spearman rank correlation test was performed， and logistic regression was used to perform the multivariate analysis. Results In the ALT ≤20 U/L， 20 — 29 U/L， and 30 — 40 U/L groups， the patients with significant inflammatory necrosis （≥G2） accounted for 57.4%， 53.4%， and 75%， respectively， and the patients with significant fibrosis （≥S2） accounted for 63.8%，62.1%， and 75%， respectively. There was a significant difference in the degree of inflammatory necrosis between the patients with positive or negative HBeAg， the patients with different levels of serum HBV DNA， and the patients with different levels of serum HBV RNA （χ2=10.008， 6.911， and 7.946， all P<0.05）， and there was a significant difference in fibrosis stage between the patients with positive or negative HBeAg and the patients with different levels of serum HBV RNA （χ2=7.996 and 10.874， both P<0.05） . The degree of liver inflammation and fibrosis stage were not significantly correlated with serum HBV DNA （rs=0.024， P=0.785； rs=0.039， P=0.652）， while they were significantly correlated with serum HBV RNA （rs=0.222， P=0.009； rs=0.187，P=0.029） . The multivariate analysis showed that in CHB patients， positive HBeAg was an independent risk factor for inflammatory necrosis （odds ratio ［OR］ =?0.302， 95% confidence interval ［CI］： ?1.160 to 0.386， P=0.002） and fibrosis （OR=?0.387， 95%CI： ?1.160 to 0.386， P=0.011） . Conclusion There are varying degrees of inflammatory necrosis and fibrosis in the liver of CHB patients with normal ALT， and positive HBeAg is independent risk factor for significant inflammatory necrosis and fibrosis in liver tissue of these patients.

Key words： ?Hepatitis B virus； ?Alanine Transaminase； ?HBV DNA； ?HBV RNA； ?Pathology

Research funding： ?Wuxi Medical Key Discipline Construction Project-Innovation Team ?（CXTD2021009）； ?Taihu Talent Program?（20200803）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新全球調查研究［1］ ， 2020年全球5歲以下兒童HBsAg感染率為0. 94%， 每年新增HBV感染人口150萬， 每年死于乙型肝炎及其并發(fā)癥約82萬。2016年， 世界衛(wèi)生組織制定了全球性戰(zhàn)略目標， 旨在2030年之前消除病毒性肝炎這一全球性公共衛(wèi)生威脅，將新發(fā)感染人數(shù)降低90%， 死亡率降低65%［2］ 。中國感染HBV的患者高達7 000萬， 這給中國完成2030年消除乙型肝炎的任務帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。中國的HBV感染主要通過母嬰傳播途徑， 往往伴隨著一個持續(xù)時間較長的免疫耐受期， 表現(xiàn)以ALT水平持續(xù)正常為特征［3］ 。多項回顧性研究及薈萃分析［4］ 結果表明， ALT水平持續(xù)正常患者的肝組織并不總是完全 “正?！?的， 有40. 0%～70. 0%的肝組織已經出現(xiàn)顯著的炎癥壞死 （G≥2） 或纖維化 （S≥2）， 部分甚至隱匿發(fā)展為肝硬化、 肝細胞癌。

血清HBV DNA定量是評估HBV復制強度最主要的指標， 用于評估疾病病程、 確定抗病毒時機、 判斷療效及預后等多種用途。1996年德國科學家K?ck［5］ 在人體外周血清中發(fā)現(xiàn)HBV RNA。HBV RNA的本質是肝細胞核內閉合環(huán)狀DNA （cccDNA） 未經逆轉錄的前基因組RNA（pgRNA）， 未能有效地轉錄成松弛環(huán)狀DNA （rcDNA）， 而是以病毒樣顆粒的形式釋放進入血液循環(huán)， 最終形成“HBV RNA 病毒樣顆?！?［6-9］。不同于 HBsAg 水平受cccDNA的轉錄和翻譯及宿主基因的HBV DNA轉錄的影響［10］ ， HBV RNA是cccDNA模板的直接下游產物， 能更準確地反映核cccDNA庫， 尤其在已使用抗病毒治療的患者中。對已使用抗病毒治療的人群有研究［11］ 顯示血清HBV RNA與肝組織病變程度及疾病進展均有關，而與未經治療患者無關［12］ 。本研究旨在對不同正常水平ALT的CHB患者的肝組織病理與血清學指標相關性進行分析， 為指導抗病毒藥物使用的啟動時機提供進一步依據(jù)。

1 資料與方法

1. 1 研究對象 收集2018年4月—2021年6月就診于無錫市第五人民醫(yī)院ALT水平正常的CHB患者的臨床資料。所有血清學標本均收集于肝活檢前。篩選標準：HBsAg陽性、 HBV DNA陽性， 血清AST、 ALT水平持續(xù)正常 （1年內持續(xù)隨訪3次， 每次至少間隔3個月）。排除標準： 既往抗HBV治療史； 合并其他病毒性肝炎、 酒精性肝炎、 非酒精性脂肪性肝炎、 自身免疫性肝病、 結締組織病、 藥物性肝損傷、 遺傳代謝性疾病、 累及全身系統(tǒng)性疾病等； 明確肝硬化患者； 妊娠患者； 合并有血液系統(tǒng)疾病、 惡性腫瘤等； 合并HIV感染者。

1. 2 HBV RNA的檢測 由上海仁度生物科技股份有限公司提供血清HBV-pgRNA定量檢測。使用HBV RNA實時熒光核酸恒溫擴增法（simultaneous amplification and testing， SAT）試劑盒 HBV-SAT kit（Shanghai Rendu Biotechnology Co. ， Ltd， China） 在AutoSAT全自動核酸檢測分析系統(tǒng)上進行檢測。具體操作按照AutoSAT儀器和試劑說明書進行。檢測范圍102～108拷貝/mL， 檢測下限為50拷貝/mL。

1. 3 肝穿刺活檢 所有患者進行肝穿刺活檢前完善血常規(guī)、 凝血功能、 腹部超聲等常規(guī)檢查， 排除穿刺禁忌證，簽署肝穿刺活檢知情同意書。患者去枕平臥位， 手上抬平放至頭部上方， B超引導下進行肝穿刺部位定位， 對穿刺部位進行消毒， 操作者戴無菌手套， 鋪巾， 局部浸潤麻醉， 囑患者配合呼吸， 在B超引導下使用一次性全自動肝活體組織檢查獲得肝組織2條， 置于4%甲醛溶液中進行組織固定， 后續(xù)進行脫水、 石蠟包埋、 切片。肝組織分別予以HE染色、 網(wǎng)狀纖維染色、 Masson染色、 免疫組化染色（HBsAg和HBcAg）。

1. 4 肝組織病理學診斷 采用我國新修訂的慢性肝炎的病理學診斷標準［13］ 。將肝臟炎癥活動程度≥G2定義為顯著性炎癥， 纖維化程度≥S2定義為顯著性纖維化。收集肝組織內HBsAg、 HBcAg的免疫組化結果、 肝臟炎癥活動程度、 肝纖維化分期及有無合并肝脂肪變性。

1. 5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26. 0軟件進行統(tǒng)計學分析， 計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用Speraman秩相關進行相關性分析。采用Logistic回歸進行多因素分析。P<0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 一般資料 本研究共納入137例CHB患者。其中男71例 （51. 8%）， 女66例 （48. 2%）。ALT≤20 U/L 47例，20～29 U/L 58例， 30～40 U/L 32例。處于免疫耐受期6例 （4. 4%）， 處于免疫清除期0例， 處于免疫控制期25例（18. 2%）， 處于再活動期2例 （1. 5%）， 處于不確定期104例（75. 9%）。

2. 2 肝組織病理檢查結果 CHB患者肝穿刺結果見表1。炎癥活動程度分級以G2級 （n=69， 50. 4%） 為主， ≥G2級 82 例（59. 9%）； 肝纖維化分期以 S0～1 期（n=47，34. 3%）、 S2期 （n=47， 34. 3%） 為主， ≥S2期90例 （65. 7%）。ALT≤20 U/L、 20～29 U/L、 30～40 U/L組分別有57. 4%、53. 4%、 75%的患者發(fā)生顯著炎癥壞死 （≥G2）， 63. 8%、62. 1%、 75%發(fā)生顯著纖維化 （≥S2）。

2. 3 臨床資料與炎癥活動程度分級和纖維化分期的關系 HBeAg陽性患者的炎癥活動程度分級、 肝纖維化分期與HBeAg陰性患者之間差異均有統(tǒng)計學意義 （P值均<0. 05）； 不同水平的血清HBV DNA組間炎癥活動程度分級差異有統(tǒng)計學意義 （P<0. 05）， 而纖維化程度差異無統(tǒng)計學意義 （P=0. 05）； 不同水平的血清HBV RNA組間炎癥活動程度分級、 纖維化分期差異均有統(tǒng)計學意義 （P值均<0. 05）。不同年齡、 不同ALT水平的炎癥活動程度分級及纖維化分期差異均無統(tǒng)計學意義 （P值均>0. 05）（表2） 。

2. 4 相關性分析結果 CHB患者的炎癥分級與肝纖維化分期之間存在相關性 （rs=0. 732， P<0. 05）。HBeAg陽性與血清HBV DNA、 血清HBV RNA均呈現(xiàn)出正相關性（rs=0. 513， P=0. 006； rs=0. 800， P<0. 001）。血清HBV DNA水平與炎癥活動程度分級、 纖維化分期之間無相關性 （rs=0. 024， P=0. 785； rs=0. 039， P=0. 652）。血清HBV RNA與炎癥活動程度分級、 纖維化分期之間存在顯著相關性 （rs=0. 222， P=0. 009； rs=0. 187， P=0. 029）。血清HBV DNA與血清HBV RNA間無相關性 （P=0. 050）。

2. 5 多因素 Logistic 回歸分析 將 ALT、 HBeAg、 HBV DNA、 HBV RNA血清學指標納入多因素Logistic回歸分析，結果提示HBeAg陽性是ALT水平正常的CHB患者肝臟發(fā)生炎癥壞死（OR= ? 0. 302， 95%CI： ? 1. 160～0. 386， P=0. 002） 及纖維化 （OR=?0. 387， 95%CI： ?1. 160～0. 386， P=0. 011） 的獨立危險因素。

3 討論

HBV感染約95%發(fā)生在嬰兒期和幼兒期， 相比之下僅有不到5%在成年后感染［14］ 。國內外指南將CHB感染過程分為4個階段： HBeAg陽性慢性HBV感染 （又稱免疫耐受期、 慢性HBV攜帶狀態(tài)）、 HBeAg陽性CHB （又稱免疫清除期、 免疫活動期）、 HBeAg陰性慢性HBV感染 （又稱非活動期、 免疫控制期、 非活動性HBsAg攜帶狀態(tài)） 和HBeAg陰性CHB （又稱再活動期）。然而臨床上存在ALT水平正常、 HBV DNA高水平、 HBeAg陽性， 看似屬于HBeAg陽性的慢性HBV攜帶狀態(tài)， 即免疫耐受期， 但其肝組織已出現(xiàn)明顯炎癥壞死或纖維化， 根據(jù)血清HBV DNA及ALT水平難以明確感染分期， 2016年和2018年美國肝病學會 （AASLD） CHB指南［15-16］ 將這一情況稱為不確定的“灰色地區(qū)”。2021年新加坡的一項大隊列研究［17］ 對處于不確定期未經治療的非肝硬化的CHB患者進行了平均約12. 5年的長期隨訪， 結果顯示約有40%患者處于不確定期， 持續(xù)處于不確定期CHB患者的肝細胞癌風險比不活躍期的CHB患者高14倍， 表明不確定期的患者疾病進展風險極大， 需要進一步評估抗病毒治療的時機。中國 《慢性乙型肝炎防治指南 （2022年版）》 ［18］ 新增“不確定期”， 這部分患者占CHB患者的28%～55%。而本研究納入的137例ALT水平正常的CHB患者中， 75%處于不確定期， 65. 7%已達到抗病毒指證， 比既往研究結果高， 因本研究納入人群為ALT水平正常的CHB患者， 其血清HBV DNA、 肝臟病理并不完全一致， 致使難以明確分期的患者比例較高。

ALT作為肝細胞受損時最靈敏的肝酶指標， 其升高通常被作為抗病毒治療的指征之一。本研究顯示ALT水平正常的CHB患者的肝組織約59. 9%顯著炎癥壞死，65. 7%顯著纖維化。進一步將ALT分為不同正常水平研究， 結果顯示不同正常水平ALT組間炎癥活動程度和纖維化程度無明顯差異。紀林秀等［19］ 對ALT水平正常及輕度升高的CHB患者的肝組織活檢研究顯示， 隨著ALT水平升高， 肝組織的炎癥壞死及纖維化程度均加重， 這與本研究結果不同， 可能因為隨著HBV感染的進展， ALT水平逐漸升高， 病毒復制引起的免疫反應對肝細胞的損害及炎癥壞死逐漸加重， 而炎癥壞死持續(xù)存在或反復出現(xiàn)是慢性HBV感染者病情進展為肝硬化甚至肝癌的重要因素。但若病毒的免疫反應僅引起炎癥和纖維化， 而未損傷肝細胞， 此時位于肝細胞質內的酶未釋放入血， 血清ALT可處于正常水平。因此， 血清ALT水平不能完全準確反映HBV感染者肝臟的病理改變， 且其水平受到多種因素的影響。

本研究顯示ALT水平正常的CHB患者的肝臟炎癥活動程度分級與纖維化分期之間存在正相關性， 隨著炎癥程度的升高， 纖維化程度越嚴重。ALT水平完全正常時， HBV長期感染使得肝臟反復出現(xiàn)炎癥活動， 持續(xù)不斷的炎癥活動持續(xù)刺激肝星狀細胞活化、 增殖， 使得細胞外基質增生、 沉積， 導致肝組織內纖維化的程度逐漸升高。

HBV復制周期中， 閉合環(huán)狀DNA （cccDNA） 作為乙型肝炎周期的中心， 血清HBV DNA定量直接反映cccDNA的水平， 即HBV的復制水平［20］ 。本研究顯示不同血清HBV DNA定量與炎癥分級、 纖維化分期之間均無相關性， 這與周旋等［21］ 的研究結果一致。周保倉等［22］ 研究顯示血清HBV DNA與肝臟炎癥等級呈正相關， 與纖維化分期無相關性。上述結果存在一定差異的原因可能是慢性HBV感染是動態(tài)活動過程， 是病毒和宿主免疫系統(tǒng)相互作用的結果， 隨著感染時間的增加， 病毒在體內的拷貝數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)級增長， 且HBV cccDNA在肝細胞核中復制轉錄后， 病毒基因組包裹在細胞質的衣殼中， 逃避宿主的免疫監(jiān)視［23］ ， 機體的免疫應答未能應對或出現(xiàn)免疫耐受， 致血清HBV DNA與肝組織改變間無相關性。

血清HBV RNA作為慢性HBV感染的新型標志物，目前研究主要集中于抗病毒治療后的變化。本研究對未經治療且ALT水平正常的CHB患者研究顯示， 血清HBV RNA與肝臟炎癥程度及纖維化分期之間存在正相關性（P值均<0. 05）， 這與Liu等［24］ 的研究一致。Bai等［25］ 研究顯示pgRNA病毒粒子的包膜蛋白結構與HBV DNA病毒粒子相似， 且細胞外HBV RNA具有作為合成病毒DNA模板的能力， 細胞外HBV pgRNA病毒粒子可能具有感染性， 使得肝組織內持續(xù)的病毒感染、 復制， 持續(xù)的炎癥反應導致肝組織發(fā)生病變， 炎癥壞死及纖維化程度逐漸升高。

本研究還發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA與血清HBV DNA無相關性。這可能與HBV在肝細胞內的復制過程有關。cccDNA下游的pgRNA有兩種去路， 其一是被衣殼內的聚合酶通過逆轉錄將pgRNA轉化為rcDNA， 再被病毒蛋白 （HBsAg脂蛋白外膜） 包裹成一個新的完整的HBV釋放到細胞外或進入細胞核內補充cccDNA池； 其二是由HBcAg組成的核衣殼包裹， 形成HBV RNA病毒顆粒并通過多種途徑出胞， 最終進入外周血中。同時， 病毒粒子出胞途徑有多種， 血清HBV DNA病毒粒子是通過天然內體分選復合體 （endosomal sorting complex required fortransport， ESCRT） 依賴性多泡體途徑輸出［26］， 研究報道裸衣殼的輸出是由ESCRT-0成分 （肝細胞生長因子調節(jié)的酪氨酸激酶底物） 和ESCRT-Ⅲ結合蛋白Alix輔助的，是完整的獨立于ESCRT通路。肝細胞中是否存在裸衣殼分泌途徑仍有待確定。另一方面， CHB患者血液中的一些裸衣殼可能直接來源于肝臟炎癥過程中凋亡的HBV陽性細胞， 而不依賴于上述途徑。也有可能一些循環(huán)衣殼直接從受損的 （破碎的） 病毒粒子中釋放［27］ 。這些不同的釋放路徑都會影響血清HBV RNA在外周血中的定量。

本研究多因素Logistic回歸分析顯示， HBeAg陽性是CHB患者肝組織發(fā)生炎癥壞死及纖維化的獨立危險因素， 與Bai等［28］ 研究結果一致， 且隨著HBeAg的升高， 血清HBV DNA、 HBV RNA逐漸升高。HBeAg陽性提示HBV復制活躍， 傳染性強， 復制過程產物均升高， 肝組織出現(xiàn)炎癥及纖維化。

總之， ALT水平正常的HBV感染者存在不同程度的顯著炎癥壞死及纖維化， 且不同正常水平ALT的CHB患者間無明顯差異， HBeAg陽性是這類患者肝組織出現(xiàn)顯著炎癥壞死及纖維化的獨立危險因素。同時血清HBV RNA與肝臟炎癥壞死及纖維化程度呈正相關， 這使其可以作為ALT水平正常的CHB人群一個潛在的血清學指標， 其臨床適用性待進一步驗證。對于此類患者的抗病毒治療需結合年齡、 家族史、 血清HBV DNA等綜合評估的基礎上， 提高肝穿刺活檢的普及性及必要性， 更及時明確抗病毒治療的啟動時機， 以免延誤最佳治療時機， 及時抑制病毒復制， 延緩疾病發(fā)展。但本研究樣本量較小，且來源于單中心， 需大規(guī)模和多中心隊列進一步研究未經治療的CHB患者的血清HBV RNA， 提供更多的循證醫(yī)學證據(jù)。

倫理學聲明： 本研究方案于2023年7月18日經由無錫第五人民醫(yī)院倫理委員會審批， 批號： 2023-008-1。利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。作者貢獻聲明： 劉珊珊負責數(shù)據(jù)收集， 統(tǒng)計數(shù)據(jù)， 撰寫論文； 陸忠華負責設計論文框架， 修改文章并最后定稿。

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收稿日期：2023-08-04； 錄用日期：2023-10-07

本文編輯：王瑩