李果 葉海軍 徐至開 李文濤 徐承雷 李江

摘要： 原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石 （PIS） 是我國西南地區(qū)高發(fā)和難治性疾病， 對患者的生活造成極大的影響。膽道系統(tǒng)慢性感染產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶等代謝產(chǎn)物， 在色素性結(jié)石的形成中起著重要作用， 除細(xì)菌產(chǎn)生的外源性β-葡萄糖醛酸酶， 肝內(nèi)膽管細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性β-葡萄糖醛酸酶在結(jié)石的形成中亦扮演重要角色。本文就PIS發(fā)病機(jī)制中β-葡萄糖醛酸酶的作用研究進(jìn)展予以分析， 以期為PIS的防治提供可能的方式。

關(guān)鍵詞： ?膽石； ?葡萄糖醛酸酶； ?病理過程

基金項(xiàng)目： ?云南省科技廳-高校聯(lián)合基金項(xiàng)目 （202101AY070001-129）

Role of β-glucuronidase in the formation of primary intrahepatic stones

LI Guo， ?YE Haijun， ?XU Zhikai， ?LI Wentao， ?XU Chenglei， ?LI Jiang. ?（Department of Hepatobiliary Surgery， ?The First Affiliated

Hospital of Kunming Medical University， ?Kunming 650032， ?China）

Corresponding author： ?LI Jiang， ?13888836057@163.com ?（ORCID： ?0000-0002-6872-9434）

Abstract： Primary intrahepatic stones （PIS） is a refractory disease with a high incidence rate in Southwest China， which greatly affects the life of patients. Metabolites， such as β-glucuronidase produced by chronic biliary tract infection， play an important role in the formation of pigmented stones. In addition to exogenous β-glucuronidase produced by bacteria， endogenous β-glucuronidase produced by intrahepatic bile duct cells also plays an important role in the formation of stones. This article analyzes the research advances in the role of β-glucuronidase in the pathogenesis of PIS， in order to provide a possible method for the prevention and treatment of PIS.

Key words： Gallstones； Glucuronidase； Pathologic Processes

Research funding： Yunnan Province Department of Science and Technology-University Joint Fund Project （202101AY070001-129）

原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石（primary intrahepatic stones，PIS）， 區(qū)別于膽總管結(jié)石和膽囊結(jié)石， 特指原發(fā)于膽總管分叉以上， 肝內(nèi)膽管近端的結(jié)石， 占膽石癥患者的10%～20%［1］ 。該病在歐美地區(qū)較少見， 在我國長江流域西南地區(qū)較為高發(fā)。該病本身為良性疾病， 但其發(fā)病極其隱匿、 遷延， 能對肝內(nèi)膽管及肝組織造成嚴(yán)重破壞， 當(dāng)出現(xiàn)癥狀就醫(yī)時(shí)大多已經(jīng)伴隨多次膽道感染、 肝細(xì)胞損傷、肝纖維化、 增殖性膽管炎甚至癌變。對患者的生活質(zhì)量和醫(yī)療資源的利用效率造成極大的負(fù)面影響。該病發(fā)病機(jī)制的研究目前國內(nèi)外僅見零星報(bào)道， 其中膽道感染后產(chǎn)生的內(nèi)、 外源性β-葡萄糖醛酸酶 （β-glucuronidase，GUS） 在結(jié)石的形成中具有重要作用。本文就GUS在PIS形成中的作用進(jìn)行綜述， 以期為GUS在PIS發(fā)病機(jī)制方面的研究探索方向。

1 PIS發(fā)病機(jī)制及膽道感染與PIS的關(guān)系

根據(jù)結(jié)石成分的不同， PIS可以分為膽色素性、 膽固醇性以及混合性結(jié)石， 比例上， PIS絕大多數(shù)為膽色素性結(jié)石［2］ ， 而形成機(jī)制較為明確的膽囊結(jié)石則主要為膽固醇結(jié)石［3］ ， 提示PIS與膽囊結(jié)石形成機(jī)制存在差異。一般認(rèn)為， 感染、 膽汁淤積、 膽管解剖以及膽汁代謝異常是該病發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素［4-5］ ， 此外， 膽道及胃腸道寄生蟲感染、 腸道菌群失調(diào)、 飲食習(xí)慣、 飲水條件等也被認(rèn)為和該病相關(guān)［6］ 。在病理學(xué)上， PIS主要的表現(xiàn)為病變肝內(nèi)膽管上皮慢性炎癥， 膽管上皮腺體增生， 膽管壁纖維化［7］。近來研究［8］發(fā)現(xiàn)， 健康膽道系統(tǒng)內(nèi)并非無菌環(huán)境， 可能存在常規(guī)菌群定植， 通常認(rèn)為膽道微環(huán)境對大多數(shù)細(xì)菌都是不利的， 感染治療中不可避免的抗生素應(yīng)用可能會對正常生理的膽道微生物群檢測產(chǎn)生偏差。但PIS患者膽道內(nèi)菌群和健康人膽道菌群種類和構(gòu)成比例存在差異［9］ ， 因而， 很可能存在致石菌群， 其導(dǎo)致結(jié)石形成的機(jī)制亦將是研究的重點(diǎn)。

膽道感染主要由細(xì)菌和寄生蟲引起。其中， 寄生蟲導(dǎo)致肝內(nèi)膽管結(jié)石的病例相對較少， 華支睪吸蟲和棘口吸蟲可寄生在膽道內(nèi)， 引起持續(xù)性慢性炎癥， 導(dǎo)致膽管的機(jī)械性梗阻、 炎癥和膽管周圍纖維化， 而膽管內(nèi)蠕蟲及其蟲卵通常是炎癥形成的基礎(chǔ)病灶， 刺激上皮細(xì)胞增生引起機(jī)械性梗阻和杯狀細(xì)胞增生引起黏蛋白過表達(dá)，成為結(jié)石形成的理想條件［10］ 。在細(xì)菌檢測中， PIS患者膽道樣本主要檢出微生物主要為大腸桿菌、 糞腸球菌、肺炎克雷伯菌、 銅綠假單胞菌［11-12］。Clemente等［13］在73例復(fù)雜肝內(nèi)膽管結(jié)石患者的膽汁中分離出上百種微生物， 其中多重耐藥腸球菌、 假單胞菌和大腸桿菌的檢出率分別為43. 9%、 41. 2和20. 6%， 表明細(xì)菌感染與結(jié)石的形成密切相關(guān)， 且常合并多種微生物感染。腸道細(xì)菌可通過血行和淋巴管傳播， 也可通過Oddi括約肌進(jìn)入膽道并引起感染［4］ 。在上述3種途徑中， 通過Oddi括約肌上行感染最為重要， 一旦Oddi括約肌的 “門戶” 功能異?；蛳?， 帶菌小腸液逆流入膽道， 感染膽管黏膜引起膽管炎及一系列下游病理變化。早期的Maki學(xué)說［14］ 指出膽道感染后細(xì)菌分泌的GUS可將結(jié)合膽紅素水解成非結(jié)合膽紅素和葡萄糖醛酸， 非結(jié)合膽紅素再與鈣離子結(jié)合而形成膽紅素鈣， 從而在膽汁中析出成為肝內(nèi)膽管結(jié)石的成石核心。而此后的研究發(fā)現(xiàn)， 膽道系統(tǒng)內(nèi)的GUS可分為2類， 一類為腸道菌群微生物分泌， 主要為大腸桿菌， 其次包括脆弱類桿菌和梭形桿菌屬等， 也是肝內(nèi)致石菌群的主要構(gòu)成物種［8-9］ ， 此類菌群直接產(chǎn)生并釋放入膽道的GUS， 稱為外源性或細(xì)菌性GUS； 另一類則由機(jī)體自身組織細(xì)胞受內(nèi)毒素等刺激后產(chǎn)生釋放的GUS， 主要由肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞合成分泌， 稱為內(nèi)源性或組織學(xué)GUS［15］ 。外源性和內(nèi)源性GUS在肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成中扮演重要角色， 尤其是內(nèi)源性GUS存在時(shí)間長， 與結(jié)石的復(fù)發(fā)關(guān)系更為密切， 但其具體調(diào)控機(jī)制尚待研究。

2 GUS的功能及作用

2. 1 維持內(nèi)源性成分的代謝穩(wěn)態(tài) GUS屬于兩個(gè)糖基水解酶家族2和家族79， 廣泛分布于人和多種腸道細(xì)菌中 （人GUS∶hGUS； 腸道細(xì)菌GUS∶BGUS）。hGUS主要存在于肝臟、 脾臟、 腸黏膜及胃黏膜上， BGUS主要存在于厚壁菌門、 變形菌門、 疣微菌門和擬桿菌門中［16］ 。作為水解酶， GUS可以特異性催化O-或S-糖苷基部分水解，并從糖苷中分離出糖苷元。葡萄糖醛酸化是消除機(jī)體內(nèi)、 外源性生物活性分子的最重要途徑之一， 例如， 甾體激素 （雌、 雄激素）、 神經(jīng)遞質(zhì) （血清素、 兒茶酚胺等）、 膽紅素、 炎性介質(zhì)等生物活性分子， 通過結(jié)合內(nèi)源性葡萄糖醛酸分子， 生成極性更強(qiáng)、 水溶性更高的代謝物， 促進(jìn)其從尿液或膽汁中排泄［17］ 。

膽紅素作為葡萄糖醛酸化程度最高的內(nèi)源性分子之一， 分別以單 （約16%）、 雙葡萄糖醛酸結(jié)合物 （約80%） 形式存在于健康人膽汁中［18］ 。膽紅素葡萄糖醛酸酯被腸道菌群大量代謝為膽色素和尿膽原， 通過腸道上皮細(xì)胞重新吸收并進(jìn)入腸肝循環(huán)［19］ 。在某些新生兒中， GUS表達(dá)增加， 膽紅素被顯著地循環(huán)利用， 從而導(dǎo)致高膽紅素血癥［20］ 。膽紅素也可以調(diào)節(jié)腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和代謝， 例如， 膽紅素對革蘭陽性菌具有潛在毒性， 可能是對膽紅素的敏感性破壞了細(xì)菌膜的完整性、 呼吸代謝和碳水化合物代謝。與革蘭陽性菌相比， 革蘭陰性菌外膜的結(jié)構(gòu)或組成 （內(nèi)膜和外膜） 可能賦予其抵抗膽紅素嵌入作用的能力， 從而抵抗膽紅素的毒性作用［21］ 。另外， BGUS的糖化過程不僅是生物轉(zhuǎn)化的重要途經(jīng)， 其產(chǎn)生的葡萄糖醛酸 （glucuronic acid， GlcA） 是維持腸道微生物群生長的碳源。多種腸道細(xì)菌已被證實(shí)可代謝GlcA， 但利用能力有所差別， 提示GlcA可影響腸道菌群及微環(huán)境［17］ 。

2. 2 介導(dǎo)外源性成分的體內(nèi)處置 人類接觸的許多藥物和外源性物質(zhì) （如膳食、 環(huán)境和工業(yè)化學(xué)品） 是非極性的親脂化合物。雖然這些化合物的親脂性促進(jìn)了生物膜的擴(kuò)散并隨后進(jìn)入其作用部位， 但同樣的特性阻礙了它們通過腎臟、 腸道從體內(nèi)消除， 因此利用高極性的GlcA形成親水的葡萄糖醛酸鹽， 轉(zhuǎn)化為更極性的親水化合物是一種消除途徑和清除機(jī)制［17］ 。而腸道BGUS的水解可能會增加外源性成分在腸道的重新釋放， 增加胃腸炎癥或癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。比如晚期結(jié)直腸癌患者接受伊立替康治療后發(fā)生遲發(fā)性腹瀉［22］ ， 這種毒性是由于其代謝物SN-38葡萄糖醛酸綴合物被BGUS分解而被重新激活而導(dǎo)致， 使其臨床療效受到嚴(yán)重限制。與單獨(dú)接受伊立替康治療的小鼠相比， BGUS抑制劑具有顯著的抗腹瀉保護(hù)作用而不影響療效， 還可以增加腸道微生物的豐富度， 減少變形桿菌水平［23］ 。非甾體抗炎藥酮洛芬和吲哚美辛的胃腸道損傷也可以通過選擇性抑制細(xì)菌GUS來改善［24］ 。目前確定了超過100種藥物經(jīng)BGUS參與循環(huán)。這些藥物包括嗎啡、 雌激素、 布洛芬、 咪達(dá)唑侖及其結(jié)構(gòu)類似物［25］ 。因此開發(fā)有效的、 特異性的、 無細(xì)胞毒性的GUS抑制劑對于提高治療藥物的臨床療效和有效的疾病管理是必不可少的。

3 GUS在PIS形成中作用

3. 1 外源性GUS在PIS形成中作用 膽道菌群失調(diào)是結(jié)石形成的關(guān)鍵因素， Chen等［26］ 分析了16例復(fù)發(fā)性膽總管結(jié)石患者和44例原發(fā)性膽總管結(jié)石患者的膽道微生物群， 16S rRNA測序顯示， 在原發(fā)性膽總管結(jié)石組中普遍存在變形菌門、 厚壁菌門、 擬桿菌門和放線菌門 （均為腸道細(xì)菌）。這些數(shù)據(jù)表明， 膽道微生物群可能起源于腸道微生物群， 并通過十二指腸乳頭進(jìn)入膽道。總體上， PIS的致石菌群以革蘭陰性桿菌為主， 和腸道菌群有大量重合。感染膽汁中產(chǎn)生大量的BGUS， 促使葡萄糖醛酸綴合物釋放游離膽紅素， 并與鈣進(jìn)一步沉淀， 形成色素性結(jié)石。而結(jié)石的形成又使得膽道中大腸桿菌、 克雷伯菌、 屎腸球菌、 擬桿菌等細(xì)菌容易聚集繁殖， 導(dǎo)致膽汁中BGUS活性升高［27］ ， 形成惡性循環(huán)。此外， 當(dāng)某些外源性代謝生物增加 （如伊利替康）， 會使腸道內(nèi)產(chǎn)生更多腸桿菌科細(xì)菌， 導(dǎo)致腸道外源性GUS的表達(dá)增加［28］ ，是否參與色素性結(jié)石的形成， 仍需進(jìn)一步研究。GUS抑制劑能減少膽紅素的腸肝循環(huán)［29］ ， 通過口服GUS抑制劑D-葡萄糖二酸-1， 4-內(nèi)酯， 檢測發(fā)現(xiàn)膽汁中GUS的活性顯著降低。在體外實(shí)驗(yàn)中， 膽紅素鈣在人感染膽汁中孵育的蛔蟲卵表面顯著沉淀， 而加入D-葡萄糖二酸-1， 4-內(nèi)酯后， 通過抑制BGUS的活性來控制膽汁中膽紅素鈣的分離， 從而明顯減少膽紅素在人膽汁中培養(yǎng)的蛔蟲卵表面的沉淀［14］ 。

另外， 腸道細(xì)菌產(chǎn)生的脂多糖（LPS）通過 TACE/TGF-α/EGFR和EP4/p38MAPK途徑， 上調(diào)黏蛋白 （Mucin，MUC） 基因， 誘導(dǎo)的MUC過表達(dá)使膽汁中黏液蛋白的分泌增加， 可能協(xié)同GUS的成石作用［30］ 。Li等［31］ 發(fā)現(xiàn)增殖細(xì)胞核抗原 （PCNA shRNA） 處理動物膽管炎模型能有效抑制增殖相關(guān)基因： PCNA、 Ki-67的mRNA和蛋白表達(dá)， 抑制病變膽管壁膽道上皮、 黏膜下腺和膠原纖維的增生行為， 同時(shí)酸性黏液腺、 MUC3 RNA的表達(dá)和內(nèi)源性GUS的分泌也被有效抑制。黏蛋白加重膽道梗阻促進(jìn)結(jié)石， 是否需要GUS誘導(dǎo)膽色素鈣形成為結(jié)石提供材料； 而GUS致石作用提供的材料， 是否也需要黏蛋白加重膽道梗阻從而才能聚集成石？MUC與GUS是否存相同或相關(guān)的調(diào)節(jié)通路有待進(jìn)一步研究。

3. 2 內(nèi)源性GUS在PIS形成中作用 隨著研究的深入，內(nèi)源性GUS在PIS形成中的作用正逐漸被認(rèn)識。1987年Oyabu等［32］ 發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性GUS在結(jié)合膽紅素的分解過程中有重要作用， 促進(jìn)色素性結(jié)石的產(chǎn)生， HO等［33］ 發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)色素性結(jié)石患者肝臟組織內(nèi)源性GUS水平較無結(jié)石者高約12倍， 同時(shí)， 當(dāng)pH為4. 6時(shí)， 檢測液中有活性的GUS為內(nèi)源性GUS， 這可能是膽汁感染， 肝細(xì)胞受損時(shí)，周圍組織pH降低， 激活了內(nèi)源性GUS的表達(dá)來加速生物活性物質(zhì)的清除。腸道存在大量產(chǎn)生LPS的細(xì)菌， 當(dāng)膽汁反流或細(xì)菌移位， 外源性GUS在早期迅速升高， 參與結(jié)石的形成。若膽道系統(tǒng)通暢性好， 其內(nèi)并無致石菌群長期定植， 在致石菌群感染中產(chǎn)生的GUS也可在細(xì)菌清除后12 h內(nèi)隨膽汁排泄清除［34］ 。張西波等［35］ 通過動物模型發(fā)現(xiàn)膽道感染后， 首先外源性GUS增高， 但隨著感染控制和膽汁排空， 外源性GUS活性逐漸下降， 而內(nèi)源性GUS活性持續(xù)增高并維持較長時(shí)間， 提示內(nèi)源性GUS可能在色素結(jié)石形成過程中發(fā)揮長期作用， 研究內(nèi)源性GUS的表達(dá)、 分泌和活性調(diào)控可能對揭示PIS的發(fā)生和復(fù)發(fā)機(jī)制更有意義。Yao等［36］ 通過免疫組化染色評估了PIS膽管黏膜標(biāo)本中內(nèi)源性GUS、 c-myc、 p-p65和p-PKC的表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)與正常肝標(biāo)本相比PIS區(qū)域的膽管黏膜上述分子表型顯著增加。同時(shí)， 姚晨輝［37］ 通過建立膽管上皮細(xì)胞損傷細(xì)胞模型研究， 發(fā)現(xiàn) LPS 可通過TLR4/NF-κB/c-myc信號級聯(lián)， 誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞表達(dá)及分泌內(nèi)源性GUS。NF-κB通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和淋巴器官的發(fā)育和存活， 從而控制免疫應(yīng)答、 惡性轉(zhuǎn)化、 細(xì)胞凋亡等多個(gè)過程， 在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮核心作用。當(dāng)膽道發(fā)生感染時(shí)， 可能存在多種炎癥因子參與， 多條以NF-κB為中心的信號通路串?dāng)_， 從而調(diào)控GUS的表達(dá)。此外， LPS激活肝竇內(nèi)的巨噬細(xì)胞 （Kupffer細(xì)胞）， 促進(jìn)循環(huán)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化， 參與并放大炎癥反應(yīng)［38-39］ 。在結(jié)石飲食喂養(yǎng)的小鼠試驗(yàn)中， 肝內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤明顯增加［40］ 。Yang等［41］ 發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管結(jié)石患者肝臟標(biāo)本中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68、 CD206以及TNF-α、 內(nèi)源性GUS的表達(dá)均較正常肝臟標(biāo)本明顯升高， 且呈正相關(guān)。在LPS的刺激下具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的M2型巨噬細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物TNF-α可能通過NF-κB/PCNA的信號級聯(lián)通路增加膽管上皮細(xì)胞內(nèi)源性GUS的表達(dá)。通過使用NF-κB抑制劑有效抑制炎癥介質(zhì)表達(dá)后， TNF-α和GUS的表達(dá)均下降， 表明巨噬細(xì)胞浸潤可能參與了肝內(nèi)膽管細(xì)胞分泌GUS。肝臟巨噬細(xì)胞對肝損傷和修復(fù)過程有重要調(diào)控作用， 可能是通過去除細(xì)菌病原體、 抑制肝臟炎癥反應(yīng)， 從而減少內(nèi)源性GUS的表達(dá)。以上內(nèi)源性GUS可能的信號通路見圖1。內(nèi)源性GUS參與結(jié)石形成的調(diào)控機(jī)制尚不明確， 可能涉及多條信號通路偶聯(lián)，對相關(guān)信號通路的研究， 可能為干預(yù)PIS的形成或復(fù)發(fā)提供新的潛在治療靶點(diǎn)。

4 小結(jié)

PIS成因復(fù)雜， 其完整、 確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。外源性GUS在肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成中作用已得到肯定，內(nèi)源性GUS在結(jié)石形成中的面紗在逐漸被揭開。近年來， 內(nèi)源性GUS在肝內(nèi)膽管結(jié)石形成中的作用逐漸得到重視， 但目前尚未有系統(tǒng)研究。對內(nèi)源性GUS抑制的相關(guān)研究雖然取得一定成果， 但大多在體外或動物模型中進(jìn)行， 缺乏臨床相關(guān)性。另外， GUS參與了人腦含葡萄糖醛酸的糖胺聚糖的降解， 若缺乏GUS可能引起Ⅶ型黏多糖病， 導(dǎo)致腦內(nèi)溶酶體儲存功能障礙。如果GUS被抑制， 是否會發(fā)生相關(guān)嚴(yán)重副作用尚不清楚。因此揭示內(nèi)源性GUS表達(dá)的調(diào)控機(jī)制， 研究其信號通路， 可能更有意義， 將為干預(yù)肝內(nèi)結(jié)石的形成提供新的治療思路。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明： 李果、 葉海軍、 李江負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)， 資料分析， 撰寫論文； 徐至開、 李文濤、 徐承雷、 李江參與收集數(shù)據(jù)， 修改論文； 李江負(fù)責(zé)擬定寫作思路， 指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2023-08-23； 錄用日期：2023-10-07

本文編輯：王亞南