梁志坤 王琳 吳軼蘭 王明義

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球感染性疾病導(dǎo)致的患者死亡占全部死因的25%以上，每年約1 300 萬兒童死于感染性疾病。在中國(guó)，感染性疾病占所有疾病的50%以上［1?4］。根本原因是病原診斷技術(shù)無法滿足臨床要求，如傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)，受培養(yǎng)條件和抗生素使用等影響，培養(yǎng)陽(yáng)性率較低；傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)通常只能使用特異性的引物或探針檢測(cè)非常有限的數(shù)個(gè)靶標(biāo)，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。而病原宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)（Metagenom?ic next?generation sequencing，mNGS）依靠其無偏倚、隨機(jī)的特性不僅可以檢測(cè)一致病原體的基因組，也可以對(duì)新發(fā)病原體感染鑒定發(fā)揮重要作用［5］。

臨床樣本類型多種多樣，按采集部位，可分為無菌部位（血、無菌體液、組織等）樣本和正常有菌部位（呼吸道、尿液、開放性傷口等）樣本［5?6］。雖然《宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》中指出無菌部位標(biāo)本的診斷價(jià)值優(yōu)于正常有菌部位，但是很多研究和報(bào)道也證實(shí)各部位感染均具有一定的臨床價(jià)值［7?8］。因此，正常有菌部位（如呼吸道、尿液、開放性傷口等）樣本病原的檢測(cè)在感染性疾病診斷中也是必不可少的。為方便醫(yī)療工作者及科研人員了解具體的處理辦法，本文對(duì)有菌部位樣本處理方法進(jìn)行綜述。

1 病原宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)原理

mNGS 檢測(cè)需經(jīng)過樣本前處理、核酸提取、文庫(kù)制備、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比、報(bào)告生成及結(jié)果解讀等一系列過程［7］，見圖1。mNGS 檢測(cè)技術(shù)直接從樣本中獲得病原體的核酸信息，再通過生物信息學(xué)的方法對(duì)得到的序列進(jìn)行比對(duì)分析［8］，可以同時(shí)檢測(cè)較大范圍的病原體，病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等［5］。

圖1 mNGS 技術(shù)原理［5］Figure 1 mNGS technology principle［5］

目前，傳統(tǒng)的病原診斷技術(shù)有微生物的培養(yǎng)和分離、特異性病原抗體的檢測(cè)和微生物核酸（DNA或RNA）檢測(cè)（PCR）等［9］（圖2），且只能檢測(cè)一種或多種病原體。對(duì)于不同的病原體，不同技術(shù)的檢測(cè)方法有著不同的靈敏度，所以mNGS 技術(shù)不能完全替代傳統(tǒng)病原診斷技術(shù)。因此，需要根據(jù)診斷需求選擇合適的檢測(cè)方法。

圖2 傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)流程［9］Figure 2 Traditional microbial detection technology process［9］

2 不同類型標(biāo)本處理方法

要實(shí)現(xiàn)mNGS 技術(shù)對(duì)所有潛在病原微生物無偏倚地檢測(cè)［5，10］，樣本前處理和核酸提取方法就需要兼容不同微生物的特征，例如增加玻璃珠研磨樣本，對(duì)樣本進(jìn)行離心或過濾以對(duì)某種病原體進(jìn)行富集。需要針對(duì)樣本的類型做一定前處理，如痰液和肺泡灌洗液樣本，黏性較高，需要進(jìn)行液化處理［8］，液化方法見表1。

表1 液化方法匯總Table 1 Summary of liquefaction methods

上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。其次，需要根據(jù)痰液、肺泡灌洗液樣本的粘稠程度，加入一定比例DTT或者NaOH，較難做成標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)處理流程。而且，NaOH 的強(qiáng)堿性，一定程度上影響提取試劑的提取效果。

以下總結(jié)了不同實(shí)驗(yàn)室針對(duì)感染性疾病主要代表類型的正常有菌部位樣本處理方法及核酸提取方法。

2.1 呼吸道樣本

呼吸道分為上、下兩部分。鼻、咽、喉合稱上呼吸道。氣管、支氣管和肺部器官，合稱下呼吸道。呼吸道樣本樣本處理方法如下：

2.1.1 上呼吸道樣本

鼻咽拭子和口咽拭子，先使用70～200 μL PBS或者樣本保存液，將微生物沖洗下來。按照QIAamp Viral RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行提取，分為裂解、結(jié)合、漂洗、洗脫四個(gè)步驟，使用快速離心柱或真空操作簡(jiǎn)化從無細(xì)胞體液中純化病毒RNA的流程。病毒RNA 特異性結(jié)合到QIAamp 硅膜上，然后用水或試劑盒提供的緩沖液洗脫高純度病毒RNA，該試劑盒可在QIAcube 全自動(dòng)化核酸純化提取儀上自動(dòng)純化。

2.1.2 下呼吸道樣本

胸腔積液樣本處理方法如下：可使用MagNA?Lyzer?儀（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany）加上SeptiFast Lysis kit（Roche，Mannheim，Germany）對(duì)細(xì)菌進(jìn)行機(jī)械破壁來獲得DNA，然后在MagNA Pure 緊湊型自動(dòng)化儀器上進(jìn)行DNA 提取和純化（Roche，Mannheim，Germany）［11］。

MagNALyzer?儀可以對(duì)較厚細(xì)胞壁、難裂解的革蘭式陽(yáng)性菌和真菌進(jìn)行預(yù)處理，加上SeptiFast Lysis kit 使其核酸能更好的釋放出來。

痰液樣本處理方法如下：不同呼吸道標(biāo)本的病原類型不一樣。一般上呼吸道樣本中含有的病原主要是病毒，可采用病毒提取試劑盒來提取核酸。下呼吸道樣本中含有大量的細(xì)菌、真菌，需要研磨破壁處理，提高核酸提取效率，從而提高mNGS 對(duì)真菌檢測(cè)的靈敏度。不同的呼吸道標(biāo)本的病原豐度也不一樣，其人源核酸占比不同，往往會(huì)導(dǎo)致mNGS 檢測(cè)性能的差異。例如，肺泡灌洗液中含有大量的宿主細(xì)胞，可能導(dǎo)致人源核酸擠占大量的數(shù)據(jù)量，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。所以需要對(duì)樣本適當(dāng)去除人源核酸，反向富集病原體，從而提升陽(yáng)性檢出率。見表2～3。

表2 肺泡灌洗液處理方法Table 2 Approach of bronchoalveolar lavage fluid

表3 痰液處理方法Table 3 Approach of sputum

2.2 糞便

糞便是主要的腸道樣本。腸道傳染病包括細(xì)菌引起的細(xì)菌性痢疾、傷寒、副傷寒、霍亂、副霍亂以及食物中毒等；阿米巴原蟲引起的阿米巴痢疾；相關(guān)病毒引起的病毒性肝炎、脊髓灰質(zhì)炎（小兒麻痹）等。

糞便樣本處理方法如下：腸道樣本中病原體核酸占比遠(yuǎn)大于其他樣本類型，可以采用自動(dòng)化提取系統(tǒng)，在一個(gè)相對(duì)封閉的提取環(huán)境，減少對(duì)環(huán)境和其他樣本的污染。糞便樣本含有復(fù)雜的微生物組，正常菌群的信息背景高，這會(huì)降低mNGS 的靈敏度。可以使用專門針對(duì)糞便樣本的富集方法（如：珠磨處理）減少信息背景，提高mNGS 檢測(cè)病原的靈敏度。見表4。

表4 糞便處理方法Table 4 Approach of stool

2.3 尿液

尿路感染是最普遍的社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性感染，存在于腎臟，輸尿管，膀胱和尿道等泌尿系統(tǒng)的各個(gè)部位。研究表明尿路感染是由多種病原微生物引起的，其中大多數(shù)是大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌，奇異變形桿菌，糞腸球菌和腐生葡萄球菌。尿路感染主要發(fā)生在育齡婦女，老年人和免疫力低下和尿路異常的人中［20］。

尿液樣本處理方法如下：尿液樣本的提取也可以使用相對(duì)封閉的自動(dòng)化提取儀，減少環(huán)境的污染，減少假陽(yáng)性的檢出率。cfDNA也廣泛存在尿液當(dāng)中，可以選擇cfDNA 提取試劑盒進(jìn)行cfDNA 的提取。此外，尿液樣本在采集的時(shí)候容易受環(huán)境的污染，應(yīng)注意人為污染，這樣有利于病原的檢出。見表5。

表5 尿液處理方法匯總Table 5 Approach of urine

2.4 牙菌斑

口腔是一個(gè)充滿各種微生物的環(huán)境，而牙菌斑就像是由不同細(xì)菌組成的“細(xì)菌社區(qū)”，這些“社區(qū)”定居于牙面、牙與牙之間或者在假牙（義齒、修復(fù)體）表面。牙菌斑是基質(zhì)包裹的互相黏附或黏附于牙面、牙間或修復(fù)體表面的軟而未礦化的細(xì)菌性群體，為不能被水沖去或漱掉的一種細(xì)菌性生物膜。牙菌斑樣本處理方法如下：牙菌斑又分平畫面牙菌斑和窩溝牙菌斑，前者早期以球菌和桿菌為主，大多為革蘭陽(yáng)性菌，鏈球菌為主要菌群，后者以革蘭陽(yáng)性菌和段桿菌為主，偶見酵母菌。根據(jù)牙菌斑的病原豐度來看，在提取核酸前可以使用溶菌酶來提高核酸提取效率。見表6。

表6 牙菌斑處理方法Table 6 Approach of dental black plaque

3 小結(jié)

近年來世界衛(wèi)生組織和國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)多次強(qiáng)調(diào)控制抗生素濫用的重要性，對(duì)臨床病原診斷提出了更高的要求。在mNGS 檢測(cè)技術(shù)的濕實(shí)驗(yàn)部分，仍面臨的四大技術(shù)挑戰(zhàn)是：①如何克服樣本中宿主核酸和樣本病理的特性；②如何真正實(shí)現(xiàn)對(duì)病原微生物無偏倚地檢測(cè)；③如何針對(duì)不同種類的臨床樣本，選擇合適的前處理程序；④如何克服檢測(cè)背景的干擾。各專家共識(shí)中也都指出樣本前處理和核酸提取為mNGS技術(shù)流程的質(zhì)量控制的重要節(jié)點(diǎn)［24］。

本文闡述了主要正常有菌部位樣本的特性及處理方法，并舉例、對(duì)比了不同樣本的國(guó)內(nèi)外提取試劑盒廠家的優(yōu)缺點(diǎn)。綜上，在研究中需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募把芯恐攸c(diǎn)來選擇樣本前處理方法和核酸提取方法。