羅章斌，邱曉明，張亦智，康學(xué)文

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730030）

椎間盤由位于中央的髓核、四周包繞的纖維環(huán)以及頂部和底部的軟骨終板構(gòu)成［1］。髓核的營養(yǎng)供應(yīng)主要來自軟骨終板中的血管網(wǎng)，作為一個相對缺乏血供的組織，髓核內(nèi)部是一個相對缺氧、代謝產(chǎn)物堆積的酸性環(huán)境［2，3］。在人體內(nèi)部，存在著病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）和損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern,DAMP）這兩種免疫應(yīng)答方式，PAMP 主要與微生物的入侵相關(guān)，DAMP 主要識別機體的組織損傷［4］。這兩種模式可以觸發(fā)細胞信號通路，導(dǎo)致產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)會參與對外界環(huán)境的應(yīng)答。盡管一部分研究指出，椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IVDD）的發(fā)生可能與感染存在著部分關(guān)系［5，6］，但同時有研究指出，DAMP 也可能是IVDD 的重要原因之一［7～9］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）、熱休克蛋白（heat shock protein, HSP）、S100 蛋白家族、白細胞介素-1α（interleukin-1α, IL-1α）和白細胞介素-33 （interleukin-33, IL-33）等蛋白作為警報素，參與DAMP 所引起的IVDD 過程。

1 高遷移率族蛋白B1

HMGB1 是高度保守的非組蛋白家族的一員，因其特有的快速電泳遷移速度而得名。盡管HMGB1 具有高豐度和保守性，但其主要作為細胞外信號因子進行研究。HMGB1 可由活化的單核細胞和巨噬細胞等細胞主動分泌，或由壞死和受損細胞被動釋放，發(fā)揮報警蛋白的作用［10］。研究指出，HMGB1 在退變髓核組織中明顯高表達。當(dāng)過表達該蛋白時，髓核細胞活力降低，增殖變慢。此外，HMGB1 過表達可以促進髓核細胞凋亡、細胞外基質(zhì)降解以及細胞自噬［11］。有研究證實，HMGB1 的表達隨著患者髓核樣本中變性嚴重程度的增加而增加。HMGB1 的基礎(chǔ)表達定位于細胞核和細胞質(zhì)，當(dāng)脂多糖（lipopolysaccharide,LPS） 作用于髓核細胞后，細胞為了響應(yīng)應(yīng)激，HMGB1 從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，然后在細胞外釋放。當(dāng)用HMGB1 重組蛋白作用于髓核細胞后，可以劑量依賴性方式促進白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1,MMP-1）的基因和蛋白質(zhì)產(chǎn)生，其可能的原因是HMGB1 通過激活Toll 樣受體4（toll-like receptor 4, TLR4）來激活核因子κB（nuclear factor-κB, NFκB）信號通路，從而導(dǎo)致髓核細胞炎癥和髓核組織降解的發(fā)生［9］。除此之外，血清剝奪也可能是HMGB1 表達上調(diào)的原因之一。為了應(yīng)對血清剝奪應(yīng)激，HMGB1 從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，最終在細胞外釋放。研究進一步證實，血清剝奪會導(dǎo)致纖維環(huán)細胞發(fā)生自噬，細胞核和細胞質(zhì)中HMGB1 的獨立測量顯示細胞質(zhì)HMGB1 強度與微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3）斑點形成密切相關(guān)，這表明細胞質(zhì)中的HMGB1 可以作為椎間盤纖維環(huán)細胞中的自噬傳感器，并可作為一種有用的自噬標志物［12］。另外，HMGB1 在髓核作用于背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion, DRG）之后引起的疼痛相關(guān)行為的發(fā)展中起重要作用。大鼠髓核免疫組化顯示，髓核中含有HMGB1。將髓核組織置于DRG附近，可導(dǎo)致疼痛相關(guān)行為的發(fā)生。但是，術(shù)后腹腔注射抗HMGB1 中和抗體的大鼠，疼痛相關(guān)行為會得到改善，其DRG 中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）的表達也會顯著降低。HMGB1 的阻斷治療有望成為神經(jīng)性疼痛的一種新的治療方法［13］。

白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）是引起髓核細胞退變的原因之一。當(dāng)IL-1β 作用于髓核細胞后，會導(dǎo)致髓核細胞發(fā)生細胞外基質(zhì)降解、炎癥反應(yīng)和凋亡的發(fā)生。甘草甜素（glycyrrhizin, GL）是HMGB1 的有效抑制劑，當(dāng)其作用于髓核細胞后，會逆轉(zhuǎn)IL-1β 的作用。GL 可以通過抑制p38/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun amino terminal kinase,JNK）信號通路來抑制HMGB1 的表達，抑制炎癥和細胞凋亡，同時抑制髓核細胞外基質(zhì)降解。GL 有可能成為治療IVDD 的新型細胞因子［14］。另有研究指出，IL-1β 處理同樣會引起HMGB1 的表達增加，而p38 抑制劑TAK-715 處理髓核細胞后則會逆轉(zhuǎn)IL-1β 的作用，HMGB1 的表達同樣會減少［15］。以上結(jié)果提示，靶向p38 和HMGB1 的藥物可能是一種針對IVDD 新穎的治療方法。

IVDD 的原因之一是髓核細胞基質(zhì)代謝失衡，與TNF-α 等炎癥因子有關(guān)。將髓核細胞用TNF-α 處理后，可導(dǎo)致髓核細胞發(fā)生衰老、焦亡，并促進細胞外基質(zhì)分解代謝，同時還會導(dǎo)致HMGB1 的表達升高［16，17］。但是，在用GL 抑制HMGB1 或用小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）敲減HMGB1 的表達后，由TNF-α 誘導(dǎo)的髓核細胞的退變過程會得到緩解。瑞舒伐他汀是一種在臨床上廣泛用于降低膽固醇水平、具有抗炎作用的藥物。瑞舒伐他汀可以通過下調(diào)HMGB1 表達的同時，抑制NF-κB 信號通路來減輕TNF-α 誘導(dǎo)的髓核細胞焦亡和衰老的發(fā)生，同時緩解細胞外基質(zhì)的降解［16］。有研究指出，高壓氧處理可能是治療IVDD 的手段之一。將髓核細胞置于高壓氧環(huán)境后，microRNA-107（miR-107）的表達顯著增加，由于HMGB1 是miR-107 的直接目標，下游的HMGB1 的表達會被抑制。高壓氧可以通過抑制HMGB1 的表達來進一步發(fā)揮抗炎的作用［18］。用LPS處理THP-1 細胞，可以誘導(dǎo)巨噬細胞M1 極化，同時促進HMGB1 的表達升高。但是木蘭花堿（magnoflorine,MAG）則可以有效抑制THP-1 細胞的M1 極化，同時抑制炎性因子和HMGB1 的表達。同樣地，IL-1β 可以促進髓核細胞HMGB1 的產(chǎn)生，而MAG則會抑制HMGB1 的升高。此外，當(dāng)用M1 極化的THP1 細胞條件培養(yǎng)基作用于髓核細胞后，HMGB1的表達也會增加，而加入了MAG 的條件培養(yǎng)基則會抑制HMGB1 的產(chǎn)生。MAG 通過下調(diào)HMGB1 來緩解M1 極化巨噬細胞介導(dǎo)的IVDD 的體外模型［19］?？傊珿L、瑞舒伐他汀、MAG 以及高壓氧均可以通過HMGB1 這一靶點緩解椎間盤的退變。

2 熱休克蛋白

HSP 也被稱為分子伴侶蛋白，是一類廣泛存在于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)家族。它因?qū)嵝菘舜嬖诜磻?yīng)而得名，其主要功能是應(yīng)對潛在的危險情況［20］，HSP 家族也在椎間盤的退變過程中扮演著重要的角色。機械負荷會影響椎間盤中細胞的行為和細胞外基質(zhì)的代謝平衡［21］。有研究指出，在機械負荷加載2 h 后，牛髓核中熱休克蛋白70（HSP70）顯著上調(diào)，而在去除機械負荷后恢復(fù)［22］。此外，有研究指出，線粒體裂變和融合的失調(diào)與多種疾病的發(fā)病機制有關(guān)，壓縮負荷會誘導(dǎo)髓核細胞發(fā)生線粒體裂變，還會引起髓核細胞外基質(zhì)分解代謝和線粒體凋亡途徑。但是，在促進HSP70 的表達后，被壓縮負荷誘導(dǎo)的線粒體裂變、細胞外基質(zhì)分解代謝以及線粒體途徑凋亡均會得到緩解，這一過程部分是通過HSP70 上調(diào)蛋白質(zhì)賴氨酸脫?；?（sirtuin3, SIRT3）的表達來實現(xiàn)的［23］。HSP70 對髓核細胞有著一定的保護作用。用叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide,TBHP）處理髓核細胞，可引起細胞活力喪失，線粒體凋亡和衰老的發(fā)生，還可以增加活性氧（reactive oxygen species,ROS），造成線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）的崩潰，以及促進三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）的消耗。但是，用HSP70誘導(dǎo)劑TRC051384 可以下調(diào)JNK/c-Jun 通路，減輕TBHP 誘導(dǎo)的髓核細胞的凋亡和衰老，以及氧化應(yīng)激的發(fā)生［24］。在缺氧條件下，HSP70 的表達也會發(fā)生變化。用HSP70 轉(zhuǎn)錄抑制劑KNK437 處理髓核細胞后，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性均有所增加。同樣，當(dāng)HSP70 過表達時，HIF-1α 的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性下降。HSP70 在缺氧條件下與HIF-1α 相互作用，HSP70 可能通過蛋白酶體途徑促進髓核細胞HIF-1α的降解［25］?？傊琀SP70 在髓核應(yīng)對各種環(huán)境時發(fā)揮著重要的作用。

近期研究指出，巨噬細胞的極化對髓核細胞有一定的影響。巨噬細胞M1 極化的條件培養(yǎng)基可以導(dǎo)致髓核細胞發(fā)生炎癥和細胞外基質(zhì)分解代謝，但是HSP90 抑制劑（17-AAG）通過抑制絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB 途徑來阻礙巨噬細胞的M1 極化來減弱條件培養(yǎng)基的促炎活性，還可以通過上調(diào)HSP70和抑制Janus 激酶2-信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）通路，最終減輕了M1 極化巨噬細胞誘導(dǎo)的髓核細胞炎癥和分解代謝［26］。研究指出，血管長入會造成髓核內(nèi)部的物質(zhì)代謝、微環(huán)境等的改變［27］。IVDD 常伴有髓核纖維化和病理性血管生成，可能與巨噬細胞浸潤有關(guān)。免疫染色顯示嚴重退行性人椎間盤組織中血管長入與巨噬細胞浸潤之間存在空間關(guān)聯(lián)，并且在嚴重退行性人椎間盤組織中細胞遷移誘導(dǎo)蛋白（cell migration inducing protein, CEMIP）和血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）水平升高，CEMIP 參與多種組織的纖維化表型，VEGFA 和成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2,FGF2）與血管的長入相關(guān)。M1 和M2極化的巨噬細胞條件培養(yǎng)基可以提高髓核細胞中CEMIP 的表達，導(dǎo)致髓核細胞纖維化的發(fā)生，還可以提高髓核細胞中VEGFA 和FGF2 的表達，但是17-AAG 可以通過抑制CEMIP 來改善巨噬細胞誘導(dǎo)的髓核細胞纖維化表型以及病理性血管生成過程［28］。類似的研究指出，抑制HSP90 在一定程度上可以保護髓核細胞。研究指出，壓縮可以觸發(fā)受體相互作用蛋白激酶 1 （receptor interacting protein kinase 1,RIPK1）/受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3, RIPK3）/混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白 （mixed lineage kinase domain like protein,MLKL）導(dǎo)致的髓核細胞壞死性凋亡，引起線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激的發(fā)生。但是，抑制HSP90 可以調(diào)節(jié)RIPK1/ RIPK3/ MLKL 的表達和活性進而顯著減輕壞死性凋亡，并減輕線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激的發(fā)生［29］。在一項對人退行性髓核組織的免疫組化結(jié)果中指出，HSPA8 在腰椎間盤髓核組織中穩(wěn)定表達，但是其表達隨著IVDD 的嚴重程度而逐漸降低［30］。總之，HSP 家族在IVDD 中發(fā)揮著重要的作用，更詳細的作用機制仍需要進一步探索。

3 S100 蛋白家族

S100 蛋白家族由結(jié)構(gòu)高度相似、但具有不同功能的成員組成，該蛋白家族在細胞內(nèi)充當(dāng)鈣離子傳感器并通過調(diào)節(jié)細胞外因子來調(diào)控細胞反應(yīng)，參與炎癥反應(yīng)、細胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫逃逸等過程［31］。研究指出，警報素成員中的S100A8、S100A9 蛋白參與椎間盤的退變過程。研究指出，S100A8 和S100A9 在嚴重退化的人髓核組織中顯著升高。當(dāng)S100A8 和S100A9 重組蛋白作用于髓核細胞后，可以促進基質(zhì)分解酶MMP-3、MMP-13，以及具有血小板反應(yīng)蛋白基序以及去整合素和金屬蛋白酶活性的蛋白-4（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4, ADAMTS-4）的表達顯著上調(diào)，抑制細胞外基質(zhì)聚集蛋白聚糖（aggrecan）和Ⅱ型膠原（collagen Ⅱ） 的表達；S100A8 和S100A9 還會引起炎癥因子IL-1、IL-6、IL-8 和TNF-α 的基因表達增加［32，8］。此外，S100A9 還會導(dǎo)致髓核細胞發(fā)生凋亡，促凋亡蛋白BCL2 相關(guān)X 蛋白、細胞色素C 及切割的胱天蛋白酶3 的表達量顯著升高［32］。具體的作用通路可能是S100A8 和S100A9 會與TLR4 結(jié)合，進一步誘導(dǎo)p65 核轉(zhuǎn)位，從而激活NF-κB 信號通路，導(dǎo)致促凋亡、促降解和促炎作用的發(fā)生，該過程可以被NF-κB 特異性抑制劑所逆轉(zhuǎn)［32，8］。此外，S100A12 作為S100 家族的重要成員之一，在牙周炎、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)展中有著重要的意義［33～35］。盡管S100A12在IVDD 過程中的作用尚未報道，但是相信在不久的將來，S100A12 將會是治療IVDD 的重要靶點之一。

4 IL-1α 和IL-33

IL-1α 和IL-1β 均是來自IL-1 家族的成員，IL-1β 在椎間盤的退變過程中發(fā)揮著重要的作用［36］。與IL-1β 不同，IL-1α 是一種雙重功能的細胞因子，通過原位IL-1α 的核易位或裂解的N-末端前肽來發(fā)揮生物學(xué)功能［37］。在先前的一項流行病學(xué)研究中，觀察到具有2 個IL-1α（+889C/T）等位基因（TT 基因型）的個體與沒有該等位基因（CC 基因型）的個體相比，IVDD 的風(fēng)險增加了3 倍以上［38］。另有薈萃分析指出，IL-1α（+889C/T）的基因多態(tài)性可增加純合、隱性和等位基因模型下IVDD 的風(fēng)險，尤其是在高加索人中。相比之下，IL-1β（+3954C/T）多態(tài)性可能與白種人患IVDD 的風(fēng)險存在明顯的關(guān)聯(lián)趨勢［39～41］。

IL-33 是一種組織來源的細胞因子，屬于IL-1家族。它在內(nèi)皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞樣細胞中廣泛表達，在正常條件和炎癥過程中都有表達，它的功能是在細胞或組織損傷時釋放警報信號，以激活表達致癌抑制因子2（suppression of tumorigenicity 2, ST2，也稱為IL-33R）受體的免疫細胞［42］。有基礎(chǔ)研究指出，在人體退變髓核組織中，IL-33 的表達顯著降低。此外，在人的原代髓核細胞中，過表達IL-33 可以增加細胞外基質(zhì)aggrecan 和collagenⅡ的表達，抑制基質(zhì)降解酶和凋亡相關(guān)基因的表達，還可以通過增加HIF-1α 的表達來增強aggrecan 和collagenⅡ的表達；但是，在抑制了IL-33的表達之后，HIF-1α 的表達被抑制，aggrecan 和collagenⅡ的表達也會降低?？傊?，IL-33 表達的改變可以通過調(diào)節(jié)HIF-1α 進而調(diào)節(jié)髓核細胞的基質(zhì)降解和凋亡［43］。

5 小結(jié)與展望

目前，對于警報素的研究日益深入，警報素在IVDD 中扮演著重要角色。眾多研究指出，由于椎間盤獨特的結(jié)構(gòu)，髓核可能是一個免疫豁免組織。然而，近期許多研究表明，巨噬細胞浸潤和血管侵入可能是IVDD 的重要原因之一。警報素作為PAMP 和DAMP 的共同配體，更是在椎間盤的退變過程中發(fā)揮著重要的作用。相信在不久的將來，免疫因素是否在IVDD 過程中發(fā)揮著作用將會得到更好的回答。同時，針對警報素的進一步研究將會為IVDD 的治療提供更好的思路和方法。