劉艮森 聶曉 王奧霖 賈鎮(zhèn)宇 危學(xué)華 徐飛 范潔茹 馬東方 劉偉 周益林

摘要

為探究利用電子鼻技術(shù)對(duì)小麥籽粒中DON含量定量檢測(cè)的可行性，本研究在25℃和40℃平衡溫度下對(duì)DON含量不同的80個(gè)小麥籽粒樣品的頂空氣體進(jìn)行電子鼻檢測(cè)，并結(jié)合由UPLCMS/MS測(cè)得的各樣品DON含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除4號(hào)和5號(hào)傳感器外，其余8個(gè)傳感器的響應(yīng)值均與樣品DON含量具有顯著或極顯著的相關(guān)性，其中1號(hào)傳感器的響應(yīng)值及其參數(shù)與樣品DON含量的相關(guān)性最強(qiáng)，表明1號(hào)傳感器可以作為檢測(cè)小麥籽粒樣品DON含量的關(guān)鍵氣體傳感器。以1號(hào)傳感器的參數(shù)為主，分別建立了在兩平衡溫度下樣品DON含量的回歸模型。對(duì)各模型的擬合效果分析發(fā)現(xiàn)，在40℃平衡溫度下基于X17（1號(hào)傳感器21～60?s響應(yīng)值的和）所建一元回歸模型最好；在25℃平衡溫度下，基于X1（1號(hào)傳感器20～40?s響應(yīng)值的平均值）和X12（8號(hào)傳感器1～5?s響應(yīng)值的和）所建二元回歸模型擬合效果最好，其次為基于X1所建的一元回歸模型。該研究可為電子鼻技術(shù)在小麥籽粒中DON含量檢測(cè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞

電子鼻;?小麥籽粒;?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;?毒素檢測(cè);?回歸模型

中圖分類(lèi)號(hào)：

S?435.121.45

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023183

Detection?of?deoxynivalenol?（DON）?content?in?wheat?grain?using?electronic?nose?technology

LIU?Gensen1，2，?NIE?Xiao1，2，?WANG?Aolin2，?JIA?Zhenyu1，2，?WEI?Xuehua1，2，?XU?Fei2，3，

FAN?Jieru2，?MA?Dongfang1*，?LIU?Wei2*，?ZHOU?Yilin2

（1.?College?of?Agriculture，?Yangtze?University，?Jingzhou?434025，?China;?2.?State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases

and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，?Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China;?3.?Institute

of?Plant?Protection，?Henan?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Integrated?Pest?Management?on?Crops?in

Southern?Part?of?North?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Zhengzhou?450002，?China）

Abstract

To?explore?the?potential?of?electronic?nose?technology?for?quantifying?deoxynivalenol?（DON）?content?in?wheat?grains，?the?detection?on?the?headspace?gas?of?80?wheat?grain?samples?with?different?DON?contents?at?equilibrium?temperatures?of?25℃?and?40℃?were?conducted?using?electronic?nose，?and?alongside?the?DON?content?of?each?wheat?sample?was?measured?by?UPLCMS/MS.?The?statistic?analysis?results?showed?that，?except?for?sensors?no.4?and?no.5，?the?response?values?of?the?remaining?eight?sensors?significantly?correlated?or?extremely?significantly?correlated?with?the?sample?DON?content.?Notably，?sensor?no.1?exhibited?the?strongest?correlation，?indicating?its?potential?as?a?principal?gas?sensor?for?detecting?DON?content?in?wheat?grain?samples.?Regression?models?for?sample?DON?content?were?established?mainly?based?on?sensor?no.1?parameters?at?each?equilibrium?temperature.?The?analysis?of?the?fitting?effect?of?these?models?revealed?that?the?univariate?regression?model?based?on?X17?（the?sum?of?response?values?of?sensor?no.1?from?21?to?60?seconds）?yielded?the?best?fitting?effect?at?equilibrium?temperature?of?40℃.?The?bivariate?regression?model?based?on?X1?（the?average?response?value?of?sensor?no.1?from?20?to?40?seconds）?and?X12?（the?sum?of?response?values?of?sensor?no.8?from?1?to?5?seconds）?yielded?the?best?fitting?effect?at?25℃，?the?univariate?regression?model?based?on?X1?also?showed?promising?results.?This?study?provides?a?theoretical?basis?and?technical?support?for?detecting?DON?content?in?wheat?grains?using?electronic?nose?technology.

Key?words

electronic?nose;?wheat?grain;?deoxynivalenol?（DON）;?toxin?detection;?regression?model

近些年以來(lái)，由禾谷鐮孢復(fù)合種（Fusarium?graminearum?species?complex，?FGSC）引起的小麥赤霉?。‵usarium?head?blight，F(xiàn)HB）在我國(guó)廣泛發(fā)生［1］，且呈加重發(fā)生趨勢(shì)。2010年－2018年間有5年發(fā)病面積超過(guò)550萬(wàn)hm2［2］。該病不僅導(dǎo)致小麥產(chǎn)量降低，還會(huì)在小麥籽粒中積累以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，?DON）為主的毒素，對(duì)人畜健康造成威脅［3］。我國(guó)規(guī)定，小麥籽粒中DON含量在1?000?μg/kg及以上時(shí)，禁止銷(xiāo)售與食用［4］。因此，加強(qiáng)對(duì)小麥籽粒中DON含量的檢測(cè)十分必要。

目前，小麥中DON含量主要采用高效液相色譜與質(zhì)譜儀聯(lián)用（HPLCMS/MS）檢測(cè)，該方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［56］;但該技術(shù)需要對(duì)小麥樣品進(jìn)行較為復(fù)雜的前處理，只能在室內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)樣品的數(shù)量有限，對(duì)操作人員有較高的專(zhuān)業(yè)技能要求，難以實(shí)現(xiàn)DON現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，電子鼻技術(shù)不需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用少等優(yōu)點(diǎn)，在DON檢測(cè)方面已有報(bào)道。Olsson等［7］利用VCM?422型電子鼻對(duì)糧倉(cāng)中受青霉Penicillium、曲霉Aspergillus和鐮孢菌Fusarium侵染后氣味正常和異常的大麥樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)氣味異常的樣品平均DON含量更高。偏最小二乘回歸模型（partial?least?squares?regression，?PLS）擬合結(jié)果顯示，電子鼻測(cè)定的數(shù)據(jù)與DON含量有相關(guān)性;Lippolis等［8］從意大利不同地區(qū)田間采集了105份自然發(fā)生赤霉病的硬粒小麥樣品，將DON含量分為3個(gè)類(lèi)別，使用ISE?Nose?2000電子鼻結(jié)合判別函數(shù)分析（discriminant?function?analysis，?DFA）建立樣品分類(lèi)模型，分類(lèi)準(zhǔn)確率最高達(dá)90.1%。這些研究表明，利用電子鼻技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DON含量不同的小麥樣品進(jìn)行一定程度的檢測(cè)區(qū)分。

基于此，本研究進(jìn)一步探究利用電子鼻技術(shù)定量檢測(cè)小麥籽粒DON含量的可行性。利用電子鼻技術(shù)，在2種平衡溫度下對(duì)不同DON含量梯度下的小麥樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較分析電子鼻數(shù)據(jù)與DON含量間的關(guān)系，建立樣品電子鼻數(shù)據(jù)與DON含量的關(guān)系模型，以期為利用電子鼻技術(shù)快速定量檢測(cè)小麥籽粒中DON含量提供技術(shù)支撐。

1?材料與方法

1.1?供試材料與儀器

小麥赤霉病病粒來(lái)源于我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古、河北、河南、山東、安徽、湖北等地田間自然發(fā)病較重的小麥穗，經(jīng)手工脫粒后，選取病癟粒，作為小麥赤霉病病籽粒樣品;以健康小麥籽?！╇p16為對(duì)照樣品。

超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀［UPLCMS/MS，XevoTM?TQS，沃特世科技（上海）有限公司］;樣品研磨儀（Tube?Mill?Control?S25，德國(guó)IKA公司）;PEN3電子鼻（德國(guó)AIRSENSE公司）：主要由1個(gè)傳感器室、2個(gè)氣泵、2個(gè)活性炭氣體過(guò)濾器以及采氣針和補(bǔ)氣針組成，該電子鼻通過(guò)10個(gè)金屬氧化物傳感器（編號(hào)為1～10）進(jìn)行樣品氣味的檢測(cè)，這些傳感器分別對(duì)不同的氣體物質(zhì)敏感。在電子鼻工作狀態(tài)下，隨著樣品氣體的進(jìn)入，每個(gè)傳感器的電阻值相對(duì)應(yīng)地升高或降低，與其在經(jīng)活性炭過(guò)濾后的潔凈空氣中的電阻值形成一個(gè)比值響應(yīng)值（以下簡(jiǎn)稱(chēng)響應(yīng)值），將樣品的氣味信息轉(zhuǎn)化為電信號(hào)以供進(jìn)一步分析，各傳感器的性能見(jiàn)表1。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?樣品制備和電子鼻數(shù)據(jù)采集

前期利用UPLCMS/MS對(duì)田間采集的小麥赤霉病病麥粒樣品進(jìn)行抽樣檢測(cè)，其平均DON含量約為15?000?μg/kg。已有研究發(fā)現(xiàn)，在小麥樣品中，赤霉病病麥粒的占比與DON的濃度呈顯著正相關(guān)［910］。因此，為使本研究中小麥樣品DON含量具有一定梯度，分別取0.2、0.4、0.6?g病粒于20?mL透明玻璃瓶中，對(duì)應(yīng)加入5.8、5.6、5.4?g健康小麥籽粒，以只加入6.0?g健康麥粒的樣品為空白對(duì)照樣品，共4組處理，每組重復(fù)20個(gè)，共80個(gè)樣品。樣品裝瓶后旋緊帶橡膠密封墊的蓋子，分別在25℃和40℃下平衡3?h和30?min，使揮發(fā)性氣體在玻璃瓶中的濃度充分平衡。采用曹學(xué)仁等［11］改進(jìn)的頂空吸氣法采集電子鼻數(shù)據(jù)。將帶有活性炭過(guò)濾器的補(bǔ)氣針和連接傳感器室的采氣針同時(shí)刺入樣品瓶蓋內(nèi)，進(jìn)行電子鼻檢測(cè)，在程序提示采樣結(jié)束時(shí)同時(shí)拔出。電子鼻測(cè)量參數(shù)如下：傳感器室氣流量400?mL/min，注射氣流量400?mL/min，傳感器自清洗時(shí)間40?s，自動(dòng)歸零時(shí)間5?s，采樣準(zhǔn)備時(shí)間5?s，采樣時(shí)間60?s，采樣頻率為每秒1次。每個(gè)樣品測(cè)得的響應(yīng)值為600個(gè)（10個(gè)傳感器×60?s），電子鼻數(shù)據(jù)自動(dòng)保存為.nos格式。

1.2.2?UPLCMS/MS測(cè)定樣品DON含量

電子鼻檢測(cè)完成后的小麥樣品用IKA樣品研磨儀粉碎成粉末狀，研磨每個(gè)樣品之前將研磨儀清掃干凈，以避免殘存樣品交叉影響。每個(gè)磨好的小麥樣品粉末過(guò)20目篩后稱(chēng)取5?g到50?mL離心管中，加入20?mL?80%乙腈水溶液，旋緊蓋子搖勻，置于搖床上260?r/min浸提10?min。4?000?r/min離心10?min，取2?mL上清液，用0.22?μm尼龍濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液放入進(jìn)樣瓶以備檢測(cè)。液相色譜采用ACQUITY?UPLC?HSS?T3色譜柱（2.1?mm×100?mm，?1.8?μm），流動(dòng)相A為純乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，進(jìn)樣量1?μL，柱溫40℃，梯度洗脫程序見(jiàn)表2;質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+），噴霧電壓3?000?V，脫溶劑氣流量800?L/h，脫溶劑氣溫度500℃，其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表3。將DON標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液（10、20、50、100、200、500、1?000?μg/kg）隨樣品上機(jī)一同測(cè)定，通過(guò)其DON響應(yīng)峰面積計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，再將樣品測(cè)得的DON響應(yīng)峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，計(jì)算得到各樣品的DON含量。

1.3?數(shù)據(jù)分析

采用Waters公司的Masslynx?V?4.1軟件對(duì)樣品的UPLCMS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到樣品的DON含量;采用R?4.1.2中的corrr包對(duì)樣品的DON含量與電子鼻響應(yīng)值參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，利用stats包對(duì)樣品的DON含量與電子鼻響應(yīng)值參數(shù)進(jìn)行一元線(xiàn)性回歸分析，利用全子集回歸法建立電子鼻響應(yīng)值參數(shù)與DON含量的二元回歸模型（leaps包）。

通過(guò)計(jì)算各模型的均方根誤差（root?mean?square?error，RMSE）、平均絕對(duì)誤差（mean?absolute?error，MAE）和卡方值（χ2）等指標(biāo)來(lái)評(píng)估各模型的擬合效果，RMSE、MAE和χ2值越小，模型的效果越好。

2?結(jié)果與分析

2.1?UPLCMS/MS測(cè)定的樣品DON含量

60個(gè)混有病麥樣品的DON含量在155.76～4?656.02?μg/kg，經(jīng)ShapiroWilk正態(tài)性檢驗(yàn)（W=0.988?89，?P=0.861?6）符合正態(tài)分布規(guī)律。其中，DON含量小于1?000?μg/kg的樣品有8個(gè)，含量在1?000～2?000?μg/kg的樣品有20個(gè)，含量在2?000～3?000?μg/kg的樣品有19個(gè)，含量在3?000～4?000?μg/kg的樣品有11個(gè)，含量大于4?000?μg/kg的樣品有2個(gè);20個(gè)空白對(duì)照樣品的DON含量為0?μg/kg。

2.2?電子鼻傳感器響應(yīng)值隨時(shí)間的變化規(guī)律

在25℃和40℃平衡溫度下，電子鼻各傳感器響應(yīng)值隨測(cè)量時(shí)間變化規(guī)律分別如圖1和圖2所示。

在兩種平衡溫度下，1號(hào)和3號(hào)傳感器的響應(yīng)值在0～5?s左右快速減小到最小值，6～20?s快速回升，21～60?s緩慢上升至平穩(wěn)不變;且隨樣品DON含量升高，響應(yīng)值有逐漸降低趨勢(shì)。2號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)傳感器的響應(yīng)值隨測(cè)量時(shí)間的變化趨勢(shì)具體表現(xiàn)為：在0～5?s左右快速

升高到最大值，6～20?s快速回落，21～60?s緩慢下降至平穩(wěn)不變;隨樣品DON含量升高，各傳感器響應(yīng)值有逐漸升高趨勢(shì)。4號(hào)和5號(hào)傳感器的響應(yīng)值隨測(cè)量時(shí)間的變化沒(méi)有表現(xiàn)出一定的變化趨勢(shì)規(guī)律，因此，4號(hào)和5號(hào)傳感器未應(yīng)用于后續(xù)分析中。

2.3?電子鼻各傳感器響應(yīng)值與樣品DON含量之間的相關(guān)關(guān)系

在25℃和40℃平衡溫度下，各傳感器每秒測(cè)得的響應(yīng)值與樣品DON含量之間的Pearson相關(guān)系數(shù)散點(diǎn)圖分別如圖3和圖4所示。在25℃平衡溫度下，各傳感器與DON相關(guān)性較好的時(shí)間段分別為：1號(hào)、6號(hào)傳感器20～40?s;2號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)傳感器3～10?s;3號(hào)傳感器10～30?s;10號(hào)傳感器31～60?s。在40℃平衡溫度下，各傳感器與DON相關(guān)性較好的時(shí)間段分別為：1號(hào)和7號(hào)傳感器20～60?s;2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)傳感器均為10～60?s。

2.4?電子鼻響應(yīng)值參數(shù)的構(gòu)建和篩選結(jié)果

根據(jù)2.2電子鼻傳感器響應(yīng)值隨時(shí)間及與DON含量的相關(guān)性的變化規(guī)律，將0～60?s內(nèi)的電子鼻各傳感器的響

應(yīng)值劃分為3個(gè)時(shí)間段：0～5?s響應(yīng)值快速升高、6～20?s響應(yīng)值快速下降、21～60?s平緩趨穩(wěn)。對(duì)每個(gè)樣品每個(gè)電子鼻傳感器該3個(gè)時(shí)間段內(nèi)的響應(yīng)值分別求和，即每個(gè)樣品在每個(gè)傳感器上可得到3個(gè)電子鼻響應(yīng)值參數(shù)。

根據(jù)2.3電子鼻各傳感器響應(yīng)值與樣品DON含量之間的相關(guān)關(guān)系，將各傳感器相關(guān)性較好且平穩(wěn)的時(shí)間段內(nèi)的響應(yīng)值各自計(jì)算平均值，即每個(gè)樣品在每個(gè)傳感器上可得到1個(gè)電子鼻響應(yīng)值參數(shù)。

分別在兩不同平衡條件下，進(jìn)一步對(duì)各傳感器計(jì)算得到的所有響應(yīng)值參數(shù)與DON含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，每個(gè)傳感器按參數(shù)類(lèi)別分別挑選相關(guān)性最高的參數(shù)作為DON含量回歸模型的建模參數(shù)，每個(gè)平衡溫度下均篩選得到16個(gè)響應(yīng)值參數(shù)（表4）。整體上，各響應(yīng)值參數(shù)與DON含量相關(guān)系數(shù)在40℃平衡溫度下均較高（|r|>0.71），且均高于25℃（0.23<|r|<0.65）。