饒席兵　錢禛鋒　曾丹　張蓉瓊　呂紹芝　沈慶慶　吳華英　何麗蓮　李富生

關(guān)鍵詞：甘蔗；耐寒性；生理響應(yīng)；主成分分析；聚類分析；綜合評價

中圖分類號：S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

甘蔗（Saccharum officinarum L.）原產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)，種植面積近2700 萬hm2，分布在全球120 多個國家，貢獻(xiàn)了全球糖總產(chǎn)量的80%以上[1]。除了傳統(tǒng)的糖生產(chǎn)，甘蔗因其巨大的生物產(chǎn)量和大規(guī)模的糖蜜乙醇生產(chǎn)而被公認(rèn)為重要的能源和生物燃料作物，它還是生產(chǎn)生物丁醇和柴油最有效的原料， 占世界生物燃料總產(chǎn)量的40%[2]。此外，在甘蔗生產(chǎn)過程中還能獲得其他有價值的副產(chǎn)品，包括紙、醋酸、膠合板和工業(yè)酶等[3]。甘蔗是一種喜溫作物，然而云南的氣候存在“兩頭低溫”的特點(diǎn)；在早春時節(jié)，西北地區(qū)吹來的冷空氣與南方暖濕空氣相持形成持續(xù)性低溫陰雨天氣——“倒春寒”，而這時甘蔗正處于幼苗期，嚴(yán)重阻礙了甘蔗幼苗的生長發(fā)育。并且，在甘蔗生長后期又容易面臨霜凍的侵襲，進(jìn)而影響甘蔗糖分的積累。因此，培育出抗逆性強(qiáng)的甘蔗品種成為現(xiàn)階段甘蔗育種的主要方向之一。

植物受到低溫脅迫后一方面可以根據(jù)植株的外部表型受害情況，另一方面能通過生理生化數(shù)據(jù)的改變所呈現(xiàn)，故均可用于植物的耐寒性評價。李楊瑞等[4]研究了寒害對甘蔗外部形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)低溫使得甘蔗蔗葉、蔗莖都有不同程度的損傷。周會等[5]發(fā)現(xiàn)甘蔗節(jié)間生長點(diǎn)比節(jié)間組織更容易受到低溫傷害。據(jù)報道，丙二醛（MDA）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、脯氨酸（Pro）含量以及抗氧化酶活性與植物的耐寒能力密切相關(guān)。包昌艷等[6]研究表明，強(qiáng)耐寒性西藏箭竹和錯那箭竹能保持較高水平的SP、Pro 含量和較低水平的MDA 含量。丘立杭[7]研究表明，低溫脅迫后強(qiáng)耐寒性的甘蔗品種SS 含量最高且增幅最大。陸思思等[8]發(fā)現(xiàn)低溫處理后，強(qiáng)耐寒性甘蔗品種的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性均高于不耐寒品種。植物耐寒分子機(jī)制研究表明，植物體內(nèi)碳水化合物代謝及其相關(guān)基因的表達(dá)與植物的耐寒能力有關(guān)[9]。?？∑娴萚10]發(fā)現(xiàn)蔗糖代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)可以平衡蔗糖代謝過程，從而使植物更好適應(yīng)低溫環(huán)境。CHEN 等[11]發(fā)現(xiàn)耐寒相關(guān)響應(yīng)基因DREB、COR413、CSD 參與菊花的低溫應(yīng)答反應(yīng)。

研究表明，甘蔗耐寒性屬中偏低遺傳力性狀[12]，雜交后代的耐寒性與其親本的耐寒能力密切相關(guān)[13-14]。因此，合理評價甘蔗耐寒種質(zhì)資源，對種質(zhì)創(chuàng)新和改良甘蔗耐寒性有重大意義。主成分分析能夠確定合理概括整體的主要因子，被研究人員廣泛用于植物的抗旱、耐寒性評價[15]。隸屬函數(shù)法彌補(bǔ)單一指標(biāo)帶來的偏差，使評定的結(jié)果與實(shí)際結(jié)果較為接近，是近年來植物抗逆性評價方法中最常用的方法，已在含笑[16]、野生苔草[17]、蘋果[18]、水稻[19]等作物耐寒性評價中應(yīng)用，聚類分析可以對不同的材料直觀地分類[20-21]。本研究以8 份不同品種甘蔗及1 份甘蔗近緣野生種蔗茅無性系為試驗(yàn)材料，研究其低溫脅迫下的生理響應(yīng)特點(diǎn)，并通過主成分分析、模糊隸屬函數(shù)法以及聚類分析進(jìn)行耐寒性綜合評價，為研究甘蔗低溫脅迫應(yīng)答調(diào)控機(jī)理，選育強(qiáng)耐寒性甘蔗新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究涉及的甘蔗材料包括新臺糖22 號（ROC22）、新臺糖20 號（ROC20）、新臺糖10號（ROC10）、新臺糖16 號（ROC16）、滇蔗01-58、崖城89-9、黃加利、粵糖93-159，為進(jìn)一步清晰地評價各甘蔗品種的耐寒特性，故加入一個具有較強(qiáng)耐寒能力的甘蔗近緣野生種（蔗茅99-1）。所有供試材料均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所資源圃種植保存。

首先將供試材料盆栽于溫室大棚內(nèi)，待生長至3～4 葉期，將處理組（3 ℃，3 d）置于光量子通量密度為300 μmol/（m²s），光周期為13 h/d，相對濕度為60%～70%的低溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行脅迫處理；對照組（30 ℃，3 d）置于溫室大棚中正常生長。到達(dá)脅迫處理時間點(diǎn)后分別將樣品（+1葉）取回，用液氮保存，進(jìn)行耐寒相關(guān)生理指標(biāo)測定。

1.2 方法

1.2.1 指標(biāo)測定 利用格銳思生物公司的試劑盒，采用硫代巴比妥酸法進(jìn)行MDA 含量測定，采用可見分光光度法進(jìn)行Chl 含量測定，采用蒽酮比色法進(jìn)行SS 含量測定， 采用BCA 法進(jìn)行SP 含量測定，采用酸性茚三酮法進(jìn)行Pro 含量測定，采用WST-8 法進(jìn)行SOD 活性測定，采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行POD 活性測定，采用顯色法法進(jìn)行CAT 指標(biāo)測定。

1.2.2 耐寒性綜合評價 通過主成分分析法轉(zhuǎn)化待評價指標(biāo)，用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法計算對應(yīng)的隸屬函數(shù)值，最后以D 值綜合評價各材料的耐寒性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別使用Excel 2009、DPS（7.05）軟件進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)差異顯著性分析，使用SPSS 26 軟件進(jìn)行主成分分析及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對甘蔗葉片生理指標(biāo)的影響

2.1.1 低溫脅迫對甘蔗葉片MDA、Chl 含量的影響 低溫脅迫處理3 d 后，除了崖城89-9 以外，其余供試材料的MDA含量均升高。其中，ROC16、ROC22 和滇蔗01-58 的MDA 含量較CK 差異達(dá)極顯著（圖1A）；以滇蔗01-58 的相對值最大，為190%，崖城89-9 的相對值最小，為87%（表1）。Chl 含量方面，低溫脅迫3 d 后，ROC22、滇蔗01-58 及粵糖93-159 三份材料的Chl 含量降低，其余6 份材料的Chl 含量均升高；其中，ROC20、ROC10、崖城89-9、黃加利及蔗茅99-1 較CK差異顯著（圖1B）；以蔗茅99-1 的相對值最大，為172%，粵糖93-159 的相對值最小，為64%（表1）。

2.1.2 低溫脅迫對甘蔗葉片SS、SP、Pro 含量的影響 結(jié)果表明，低溫處理3 d 后，不同材料間SS 含量變化存在差異，ROC20、滇蔗01-58、黃加利、粵糖93-159 的SS 含量較CK 極顯著降低，其余5 份材料的SS 含量較CK 極顯著升高（圖1C）；其中，崖城89-9 的相對值最大，為227%；黃加利的相對值最小，為33%（表1）。SP 含量方面，ROC20、滇蔗01-58、粵糖93-159 處理前后變化不明顯；ROC22、黃加利低溫脅迫后降低，ROC16、崖城89-9、蔗茅99-1 較CK 極顯著升高（圖1D）；以蔗茅99-1 的相對值最大，為164%；ROC22 的相對值最小，為58%（表1）。所有材料的Pro 含量經(jīng)低溫脅迫后均升高，其中，ROC22、ROC10、崖城89-9，粵糖93-159 及蔗茅99-1 較CK 差異極顯著（圖2A）；以蔗茅99-1 的相對值最大，為172%（表1）。

2.1.3 低溫脅迫對甘蔗葉片SOD、POD、CAT 活性的影響 低溫脅迫3 d 后，所有材料的SOD 活性均下降。其中，ROC20、ROC22、崖城89-9 的SOD 活性較CK 顯著降低，ROC10、黃加利、粵糖93-159 和蔗茅99-1 較CK 極顯著降低（圖2B）；以ROC20 相對值最大，為92%，崖城89-9 的相對值最小，為58%（表1）。ROC22、黃加利和滇蔗01-58 的POD 活性經(jīng)低溫處理后變化不明顯，其他材料的POD 活性均顯著高于CK（圖2C）；相對值最大的是崖城89-9，為162%。CAT 活性方面，低溫脅迫前后崖城89-9 變化不大，ROC22極顯著低于CK，其他材料均極顯著高于CK（圖2D）；相對值最高的是滇蔗01-58，達(dá)到331%，最低的是ROC22，僅有67%。

2.2 各生理指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SOD 與Pro 呈顯著負(fù)相關(guān)、與MDA 呈顯著正相關(guān)；POD 與SS、SP 呈顯著正相關(guān)，與MDA 呈極顯著負(fù)相關(guān)。SS 與SP 呈顯著正相關(guān)；其中，POD 與可溶性蛋白的相關(guān)系數(shù)最大，R²=0.799，其他指標(biāo)間相關(guān)性不顯著（表2）。

2.3 主成分分析

將8 個耐寒性指標(biāo)的相對值進(jìn)行主成分分析，由表3 可知，共得到3 個主因子，其中，主因子1 的特征值為3.940，具有49.247%的貢獻(xiàn)率；主因子2 的特征值為1.613，具有20.164%的貢獻(xiàn)率；主因子3 的特征值為1.005，具有12.559%的貢獻(xiàn)率。3 個主因子的特征值均大于1，累計貢獻(xiàn)率為81.970%（表2）。將8 個耐寒生理指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3 個獨(dú)立的綜合指標(biāo)，對甘蔗耐寒性指標(biāo)進(jìn)行評價。主因子1 中，系數(shù)較大的有POD（0.940）、MDA（-0.882）、SP（0.784）、SOD（-0.709），絕對值均大于0.700。主因子2 中，系數(shù)最大的是葉綠素（0.662），最小的是POD（0.143）。主因子3 中，系數(shù)最大的是CAT（0.698），最小的是POD（0.391）（表2）。

2.4 耐寒性綜合評價

結(jié)合生理指標(biāo)的相對值和主因子系數(shù)得到主因子得分PC 值，由表4 可知，崖城89-9 在主因子1 中的數(shù)值最大，粵糖93-159 在主因子2 中的數(shù)值最大，黃加利在主因子3 中的數(shù)值最大。通過模糊隸屬函數(shù)法計算出各主因子的隸屬函數(shù)值。在主因子1、主因子2、主因子3 中，隸屬函數(shù)值中的最大（1.00）的分別是蔗茅99-1、崖城89-9、滇蔗01-58，表明各自在不同主因子中耐寒性最強(qiáng)，隸屬函數(shù)值最?。?.00）的分別是滇蔗01-58、粵糖93-159、黃加利，表明各自在不同主因子中耐寒性最弱。根據(jù)主成分分析得到的主因子貢獻(xiàn)率計算出3 份主因子的權(quán)重。主因子1 的權(quán)重為0.60，主因子2 的權(quán)重為0.25，主因子3的權(quán)重為0.15。再根據(jù)隸屬函數(shù)值和權(quán)重計算得到綜合評價值（D），D 值越大則耐寒性越強(qiáng)。其中，D 值較大的是蔗茅99-1（0.84）、崖城89-9（0.83）、ROC10（0.74），D 值較小的是ROC22（0.23）、滇蔗01-58（0.24）、黃加利（0.41）；9份材料的耐寒性排序?yàn)椋?蔗茅99-1> 崖城89-9>ROC10> ROC16>粵糖93-159>ROC20>黃加利>滇蔗01-58>ROC22。

2.5 聚類分析

將綜合評價值（D）利用組間聯(lián)接法和平方歐氏距離進(jìn)行聚類分析，在歐氏距離5 處將9 份材料分為3 個類群，對應(yīng)耐寒性為強(qiáng)、中、弱3個等級。第Ⅰ類群包括蔗茅99-1、崖城89-9、ROC10，耐寒性強(qiáng)；第Ⅱ類群包括ROC20、粵糖93-159、黃加利、ROC16，耐寒性中；第Ⅲ類群包括滇蔗01-58、ROC22，耐寒性弱（圖3）。

3 討論

低溫是影響甘蔗生長發(fā)育、產(chǎn)量以及分布的主要環(huán)境因子之一。探究甘蔗在低溫逆境下的生理反應(yīng)特性，篩選強(qiáng)耐寒性甘蔗親本材料，對指導(dǎo)甘蔗育種及推動甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要的意義。研究表明，葉片在植物光合作用、生理生化反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用，對外界溫度的變化也較為敏感，可以作為植物耐寒性生理響應(yīng)研究的重要器官[22]。故本研究以9 份低溫脅迫的甘蔗葉片進(jìn)行耐寒生理響應(yīng)分析，從而綜合評價其耐寒性。

當(dāng)植物暴露于低溫逆境時，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的ROS，隨著脅迫程度的不斷加深，打破了自由基產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂發(fā)生過氧化作用，膜內(nèi)物質(zhì)外滲并產(chǎn)生大量MDA，從而影響一系列生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行，故可通過MDA 含量的變化，分析膜系統(tǒng)受損程度以及植物的耐寒能力。黃麗芳等[23]研究表明，經(jīng)低溫脅迫后不同咖啡品種的MDA 含量呈上升趨勢。彭云玲等[24]發(fā)現(xiàn)，玉米經(jīng)低溫脅迫后其MDA 含量均較CK 升高。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致；經(jīng)低溫脅迫后，耐寒性相對較弱的ROC22、滇蔗01-58 中積累了較多的MDA，而在耐寒性相對較強(qiáng)的蔗茅99-1、崖城89-9 以及ROC10 中，MDA 的累積量并不多，說明MDA 含量是衡量植物低溫耐受性的重要因素，可作為植物耐寒性評價的關(guān)鍵指標(biāo)之一。低溫脅迫下，葉綠體的超微結(jié)構(gòu)被破壞，Chl 合成酶的活性顯著降低，導(dǎo)致Chl 含量下降，進(jìn)一步影響植物的光合作用與代謝。張保青等[25]、王振波等[26]研究發(fā)現(xiàn)，耐寒性較強(qiáng)的材料經(jīng)低溫脅迫后，其體內(nèi)的Chl 含量仍能保持一個較高的水平；本研究結(jié)果與之一致。

經(jīng)過漫長的選擇與進(jìn)化，植物形成了其特有的調(diào)控機(jī)制來適應(yīng)逆境帶來的不利影響，滲透調(diào)節(jié)便是其中的一種。SS、SP 和Pro 是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其積累能增加細(xì)胞內(nèi)束縛水與自由水的比值、原生質(zhì)的保水能力和細(xì)胞液濃度等，從而平衡在低溫條件下的細(xì)胞代謝，對生物膜系統(tǒng)起到很好的保護(hù)作用，以抵御環(huán)境脅迫帶來的不利影響[27]。何子華等[28]進(jìn)行不同禾本科牧草的耐寒性評價，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低溫脅迫后不同禾本科牧草的SS 含量和Pro 含量均呈不同程度的增加趨勢。陳明輝等[29]發(fā)現(xiàn)6 個不同品種果蔗的SS、SP 和Pro含量隨著低溫脅迫時間的延長而持續(xù)升高。本研究中，經(jīng)低溫脅迫后，強(qiáng)耐寒性材料蔗茅99-1、崖城89-9 的SS、SP 以及Pro 含量較CK 極顯著升高，說明滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加，是植物對低溫脅迫的一種應(yīng)對策略；而在弱耐寒性材料中，SS 及SP 的含量反而低于CK，可能是由于超出其低溫耐受范圍，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透失衡。

SOD、POD、CAT、APX、GR 等是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，在植物逆境應(yīng)答，活性氧清除過程中發(fā)揮著重要的作用。SOD 是植物抗氧化酶系統(tǒng)的第一道防線，它能特異性地將超氧陰離子（O₂^?）歧化為對植物毒害較小的H₂O₂；POD 可以催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應(yīng)：RH₂+H₂O₂→2H₂O+R， 清除由逆境產(chǎn)生的H₂O₂；CAT 在清除植物體內(nèi)的氧自由基時也起著重要作用[30]。全怡吉等[31]研究了不同甘蔗品種對低溫的生理響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫后，蔗莖CAT 活性上升，而SOD、POD 活性下降。曹哲群等[32]研究結(jié)果表明，經(jīng)低溫（3 ℃）處理3 d 后，各甘蔗材料葉片的SOD 活性均有不同程度的下降。孫波等[33]發(fā)現(xiàn)低溫持續(xù)脅迫下，甘蔗根系的POD、SOD 活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但耐寒性強(qiáng)的品種在處理后期也能保持一定的活性。本研究中，經(jīng)低溫脅迫后，所有材料葉片的SOD 活性均較CK 降低，多數(shù)材料的POD、CAT 活性較CK升高。該結(jié)果與前人研究結(jié)果有差異，可能是由于甘蔗基因型、測定時期、測定部位等不同所導(dǎo)致。在各指標(biāo)相關(guān)性分析中，發(fā)現(xiàn)POD 與SS、SP 呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步說明POD 在植物甘蔗抵御低溫脅迫中發(fā)揮著重要的作用。

研究表明，植物耐寒性屬于多因素調(diào)控的數(shù)量性狀，用單一指標(biāo)、單一的分析方法作為植物耐寒性評價較為片面，采用多種指標(biāo)增大數(shù)據(jù)處理量的同時，各指標(biāo)信息也存在交叉與重疊現(xiàn)象。主成分分析法可將多個單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為互相獨(dú)立的綜合指標(biāo)，不僅可以降低變量個數(shù)，同時又能保證不會對最終評價造成偏差。本研究利用主成分分析，共提取出3 個主因子，累計貢獻(xiàn)率為81.970%；相關(guān)研究表明，主子因累計貢獻(xiàn)率達(dá)80%以上得到的結(jié)果相對可靠。楊小英等[34]通過聚類分析，將不同品種玉米分為高度抗旱、中度抗旱、抗旱、敏感、高度敏感5 個亞群。金明等[35]將不同水稻種質(zhì)材料分為耐寒性極強(qiáng)、耐寒性強(qiáng)、耐寒性中等、耐寒性弱和耐寒性極弱5 個等級。本研究通過聚類分析，將9 份甘蔗材料劃分為強(qiáng)耐寒類型、中度耐寒類型和弱耐寒類型。

本研究通過分析不同甘蔗品種苗期葉片的生理響應(yīng)，利用主成分分析、隸屬函數(shù)等方法對其耐寒性進(jìn)行綜合評價。結(jié)果表明，耐寒能力最強(qiáng)的甘蔗品種為崖城89-9，最弱的為ROC22，強(qiáng)耐寒性甘蔗品種能夠更好地提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性，進(jìn)一步清除ROS，平衡細(xì)胞代謝過程，從而更好地適應(yīng)低溫環(huán)境。