邵爽 郭紀(jì)偉 孟瑋

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，濱州 256600

RNA 甲基化修飾是一種廣泛存在于各類RNA 中的修飾作用，其主要作用是通過調(diào)節(jié)mRNA 的轉(zhuǎn)錄、出核、穩(wěn)定性和翻譯效率，從而控制靶蛋白的表達(dá)［1］，其中研究最熱門的是N6-甲基腺苷（m6A）及5-甲基胞嘧啶（m5C）的修飾作用，它們可以直接作用于信號通路中的關(guān)鍵分子導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，也可以通過作用和改變與該通路相關(guān)的其他蛋白的表達(dá)水平間接調(diào)控該信號通路的活性。已有研究表明，甲基化修飾與多種人類疾病有關(guān)，影響不同類型癌癥的生長和轉(zhuǎn)移［2］。信號通路之間存在多種相互作用，m6A和m5C 修飾通過調(diào)控單個(gè)因子的表達(dá)進(jìn)而在多種致癌通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本綜述著重探討RNA 甲基化修飾中比較熱門的m6A 及最近興起的m5C 修飾對信號通路中關(guān)鍵分子的調(diào)控從而影響癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

RNA甲基化修飾

RNA甲基化修飾是將甲基從一個(gè)活性甲基化合物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)化合物，根據(jù)甲基化的不同部位，RNA甲基化包括m6A、m5C、N7-甲基鳥嘌呤核苷酸（m7G）、N1-甲基腺嘌呤（m1A）等［3-4］。RNA 甲基化修飾是一個(gè)可逆的動態(tài)過程，由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶及甲基化結(jié)合蛋白等多種酶參與并介導(dǎo)RNA 甲基化修飾［5］，下面著重介紹比較熱門的m6A 及最近興起的m5C修飾。

1.m6A甲基化修飾及其調(diào)節(jié)因子

m6A 是以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到腺嘌呤核苷酸的第六個(gè)N 原子上［6］。m6A 甲基化修飾是真核生物mRNA 中最豐富的甲基化修飾，富集在終止密碼子、RNA 外顯子區(qū)域和3′非翻譯區(qū)（3′UTR）中的RRACH（R=A 或G，H=A，C 或U）序列中［7-8］。m6A 有3 種類型的調(diào)節(jié)因子：其一是甲基轉(zhuǎn)移酶，研究較多的是甲基轉(zhuǎn)移酶3（METTL3），它含有SAM 結(jié)合位點(diǎn)，而METTL3 與METTL14 以1∶1 的含量形成異源二聚體，Wilms 瘤1-相關(guān)蛋白在甲基化酶復(fù)合物中充當(dāng)支架，共同形成甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體，將甲基從SAM 轉(zhuǎn)移到受體腺嘌呤上［9］；其二是去甲基化酶，它使RNA 甲基化修飾動態(tài)可逆成為可能，是RNA去甲基化過程中的調(diào)節(jié)蛋白，其中研究較多的是肥胖相關(guān)蛋白（FTO）和alkB 同源蛋白5（ALKBH5），F(xiàn)TO C-端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)域和ALKBH5 N-端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域通過與甲基化的RNA 底物相互作用而行使去甲基化活性［10-11］，進(jìn)而影響mRNA 的核輸出和RNA 的代謝［12-13］；其三是甲基化結(jié)合蛋白，它與甲基化的RNA 結(jié)合并發(fā)揮相應(yīng)的功能。其中研究較多的是同源域（YTH）結(jié)構(gòu)域家族，即含有YTH 結(jié)構(gòu)域的蛋白YTHDF1/2/3和YTHDC1/2，其中YTHDC1分布在細(xì)胞核中，而YTHDF1/2/3 和YTHDC2 則主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。YTHDF1可識別終止密碼子周圍的m6A修飾，促進(jìn)mRNA翻譯，而YTHDF2識別不進(jìn)行翻譯的mRNA，加速其降解［14-15］。

2.m5C甲基化修飾及其調(diào)節(jié)因子

m5C 是另一種豐富的RNA 甲基化修飾類型，由m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶催化，將甲基從SAM 上轉(zhuǎn)移到RNA 序列中胞嘧啶堿基的第五個(gè)C 原子上。m5C 修飾廣泛分布于各種RNA中，包括mRNA、rRNA、tRNA、ncRNA、vault RNA 等，從而參與mRNA的核輸出、RNA的穩(wěn)定性和翻譯［16］。m5C也有3種類型的調(diào)節(jié)因子：m5C 甲基化酶包括NOL1/NOP2/SUN 結(jié)構(gòu)域（NSUNs）蛋白質(zhì)家族和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）家族成員，其中NSUN2 是一種核仁RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，且是催化m5C 形成最主要的RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶［17］。NSUN2 在細(xì)胞分化、增殖、遷移以及調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展等多種生物學(xué)功能中起著非常重要的作用［18］；m5C 去甲基化酶包括TET 家族（TET1-3）和ALKBH1，TET 家族催化去甲基化從而生成5-羥甲基胞嘧啶（hm5C），ALKBH1主要參與tRNA 的去甲基化修飾生成hm5C 后再進(jìn)一步氧化生成5-胞嘧啶甲酰（f5C）［19］；m5C 甲基化結(jié)合蛋白主要包括Aly/REF 輸出因子（ALYREF）和Y-盒結(jié)合蛋白-1（YBX1）。ALYREF 是TREX復(fù)合物的關(guān)鍵組分之一，它結(jié)合的mRNA 位點(diǎn)大多位于緊靠翻譯起始位點(diǎn)附近富含CG 堿基的結(jié)構(gòu)域，并通過K171位的賴氨酸識別mRNA上的m5C所修飾的位點(diǎn)并促進(jìn)其出核。YBX1 則通過其CDS 的W65 位吲哚環(huán)識別m5C 修飾的mRNA來維持其穩(wěn)定性，進(jìn)而影響靶基因的表達(dá)［20］。

與m6A、m5C相關(guān)的熱門致癌信號通路

1.哺乳動物不育系20 樣激酶（MST）-Yes 關(guān)聯(lián)蛋白（YAP）通路

哺乳動物中的MST-YAP信號通路最初是在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)的，該通路在進(jìn)化上高度保守，其核心反應(yīng)是一個(gè)激酶級聯(lián)反應(yīng)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，參與器官再生和組織修復(fù)等，因此其功能一旦失調(diào)將導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展［21］。其中Ste20-like 激酶1/2 與它們的輔助因子Salvador 同源物1結(jié)合，磷酸化并激活大腫瘤抑制激酶1/2（LATS1/2），LATS1/2 與其輔助因子MOB 激酶激活因子1A 和1B 使YAP/含PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）磷酸化并失活，使其駐留在細(xì)胞質(zhì)中并降解，可抑制其核轉(zhuǎn)位從而失去輔轉(zhuǎn)錄因子的活性［22］。當(dāng)YAP/TAZ 未被磷酸化，它們則會進(jìn)入細(xì)胞核并與TEA 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。因此，MST-YAP 信號通路通過調(diào)節(jié)YAP的磷酸化及核定位，進(jìn)而影響整個(gè)信號通路的活性，從而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。在過去的十年中，由于該通路在發(fā)育、再生和癌癥中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用，這一領(lǐng)域得到了廣泛的研究。在癌癥中，已經(jīng)表明YAP/TAZ 在腫瘤中的表達(dá)異常，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，被認(rèn)為是人類實(shí)體癌的癌基因，因此MST-YAP 信號通路途徑可能成為癌癥治療的新靶點(diǎn)［23］。

2.磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-PKB/蛋白激酶B（Akt）通路

PI3K-Akt 通路在細(xì)胞代謝、生長、增殖、凋亡和血管生成等基本細(xì)胞活動和癌癥的發(fā)生及發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［24］。PI3K具有磷脂酰肌醇激酶活性和絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，其根據(jù)不同結(jié)構(gòu)和底物可以分為三類，即Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類。其中研究最廣泛的是Ⅰ類，是由催化亞基P110 和調(diào)節(jié)亞基P85 共同組成的異源二聚體，在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［25］。Akt具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其作為PI3K-Akt 通路的核心分子可以通過抑制叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O 及糖原合成酶激酶3（GSK3）-谷氨酰胺合成酶活性分別調(diào)控細(xì)胞的凋亡及影響糖原的合成，還可通過激活A(yù)TP檸檬酸裂解酶及內(nèi)皮型一氧化氮合酶分別促進(jìn)脂肪酸的合成及維持血管的功能。但Akt 的過度激活導(dǎo)致癌癥的產(chǎn)生，如逃避凋亡、過度生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［26］。當(dāng)細(xì)胞中的配體和受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K，接下來PI3K 促使磷脂酰肌醇4，5二磷酸磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)?、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3 進(jìn)入細(xì)胞后增強(qiáng)Akt 的磷酸化，使Akt 部分或完全激活，從而進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。作為PIP3 活性的抑制基因（同源性磷酸酶-張力蛋白、蛋白磷酸酶2A、亮氨酸豐富重復(fù)蛋白質(zhì)磷酸酶蛋白），當(dāng)其表達(dá)水平升高時(shí)，PI3P 去磷酸化通過抑制PI3K/Akt 信號通路傳導(dǎo)進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡［27］。

3.Wnt/β-catenin信號通路

經(jīng)典的Wnt 信號通路是一個(gè)復(fù)雜的信號通路，其決定生物體內(nèi)多種細(xì)胞命運(yùn)并調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化等重要生物學(xué)過程。此途徑主要包括四個(gè)片段：胞外信號、膜段、胞質(zhì)段和核段。胞外信號指Wnt 配體蛋白，細(xì)胞膜段主要包含Wnt 受體卷曲蛋白（FZD）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6），細(xì)胞質(zhì)部分主要包括β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、蓬亂蛋白和破壞復(fù)合物（DC），該DC 由軸蛋白（Axin）、酪蛋白激酶1α、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白和GSK-3β組成，核段主要包括轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核的β-catenin、T 細(xì)胞特異性因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族成員以及β-catenin下游靶基因等［28］。在Wnt 配體缺失的情況下，β-catenin 與DC 結(jié)合，結(jié)合后的β-catenin 被磷酸化進(jìn)而被降解［29］。經(jīng)典的Wnt 信號通路核心作用方式與β-catenin 的穩(wěn)定性密切相關(guān)，當(dāng)β-catenin 水平低下時(shí)，Wnt 信號通路被抑制；β-catenin 水平較高時(shí)，Wnt 信號通路被激活。Wnt 信號通路激活時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞的異常增生分化，從而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展［30］。當(dāng)Wnt 配體與膜上的FZD 及LRP5/6 受體結(jié)合時(shí)，Axin-GSK3β 蛋白復(fù)合物也被募集到細(xì)胞膜，Axin不再發(fā)揮作用，β-catenin在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)逐漸累積從而進(jìn)入細(xì)胞核，將Groucho 蛋白替換，并與TCF 結(jié)合調(diào)控下游靶基因的表達(dá)［31］。

4.絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路

MAPK 信號通路是一系列高度保守的酶促級聯(lián)反應(yīng)，參與細(xì)胞的生存、增殖、凋亡、分化和癌癥在內(nèi)的多種生物學(xué)活動。信號通路包括3種主要的激酶，即MAPK激酶的激酶、MAPK 激酶和MAPK，它們依次被磷酸化后激活并調(diào)控下游靶分子的磷酸化［32］。MAPK通路有4條經(jīng)典的分支，分別是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2、c-Jun 氨基末端激酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5 和p38 MAPK。其中ERK/MAPK 信號通路是研究最詳盡的MAPK 信號通路，與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)并在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用［33］。當(dāng)細(xì)胞外配體與質(zhì)膜上的特定細(xì)胞表面受體結(jié)合時(shí)，該信號通路被激活，產(chǎn)生生長因子受體結(jié)合蛋白2（GRB2）的結(jié)合位點(diǎn)，招募SOS 蛋白到膜上并與之結(jié)合，SOS 將GDP 結(jié)合的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Ras）活化為Ras 相關(guān)GTP 酶（Ras-GTP）。Ras-GTP能將蘇氨酸蛋白激酶（Raf）蛋白招募到細(xì)胞膜上并在一系列復(fù)雜的過程中被活化，活化的Raf激酶接著與下游的絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK）1/2 結(jié)合并使其磷酸化，導(dǎo)致下游信號傳導(dǎo)的ERK1/2 被磷酸化，活化的ERK1/2將繼續(xù)磷酸化髓細(xì)胞組織增生原癌基因、特異性蛋白 1、轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1和E26轉(zhuǎn)錄因子等，進(jìn)而調(diào)控與細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期有關(guān)的基因表達(dá)［34］。在MAPK信號通路中，Ras、Raf、MEK1/2和ERK1/2中的任何一個(gè)因子功能異常都會導(dǎo)致嚴(yán)重的腫瘤疾病。

m6A及m5C修飾通過影響與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)的信號通路調(diào)控癌癥發(fā)生和發(fā)展

根據(jù)國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示，中國當(dāng)前主要惡性腫瘤中死亡率前5 包括肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、食管癌［35］。以下著重介紹m6A 及m5C 修飾通過影響與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)的信號通路調(diào)控上述癌癥發(fā)生和發(fā)展。

1.肺癌

在Hippo-YAP 信號通路中，去甲基化酶ALKBH5 通過減少YAP m6A 甲基化修飾來抑制非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，通過YTHDF2識別并促進(jìn)YAP mRNA 降解及抑制微小RNA-107/大腫瘤抑制激酶2 介導(dǎo)的YAP 活性來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［36］。m6A 甲基化酶METTL3 通過與真核生物翻譯起始因子3H相互作用促進(jìn)Hippo通路效應(yīng)因子TAZ 的翻譯，從而增加肺腺癌（LUAD）細(xì)胞的生長、生存和侵襲能力［37］。在m5C 甲基化酶NSUN2和m5C 甲基化結(jié)合蛋白ALYREF 的促進(jìn)下，YAP 3′UTR 被m5C 修飾，這種修飾增加了YAP mRNA 的穩(wěn)定性，并抑制了附近的m6A 修飾和miR-582-3p結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)LUAD的發(fā)生發(fā)展［38］。

2.肝癌

在肝母細(xì)胞瘤（HB）中，微小RNA-186（miR-186）可直接結(jié)合m6A甲基化酶METTL3 mRNA的3′UTR降低其表達(dá)，miR-186/METTL3 軸可以調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路，miR-186 的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致METTL3 過表達(dá)促進(jìn)HB 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在HB細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)METTL3和編碼β-連環(huán)蛋白的鈣黏蛋白相關(guān)蛋白（CTNNB1）基因存在顯著正相關(guān)，METTL3 可以通過增加Wnt/β-catenin 通路中CTNNB1 基因的m6A 水平，YTHDF2 識別CTNNB1 中5′UTR m6A 修飾，從而促進(jìn)HB 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及術(shù)后復(fù)發(fā)［39-40］。在肝細(xì)胞癌（HCC）中，含有RAD52基序的蛋白 1（RDM1）具有腫瘤抑制因子的功能，RDM1 在p53 存在下抑制Ras/Raf/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。m6A 甲基化酶METTL3 使RDM1 mRNA 的m6A 甲基化修飾增加并抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)HCC 的發(fā)展［41］。 m6A 甲基化結(jié)合蛋白YTHDF1 可通過影響AKT2 和AKT3 的翻譯進(jìn)而影響PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，促進(jìn)HCC 細(xì)胞的遷移，也可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲［42］。

3.胃癌

m6A修飾在胃癌中起到抑制腫瘤的作用，即過表達(dá)m6A甲基化酶METTL14 或者敲低m6A 去甲基化酶FTO 會通過抑制Wnt 和PI3K-Akt 信號傳導(dǎo)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖及侵襲［43］。m6A 甲基化結(jié)合蛋白YTHDF1 可以通過增強(qiáng)FZD7 的翻譯，使Wnt/β-catenin 通路過度激活促進(jìn)胃癌發(fā)生，YTHDF1 與胃癌的發(fā)生和進(jìn)展呈正相關(guān)，m6A 依賴性YTHDF1-FZD1-β-catenin 軸在胃癌發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［44］。胃癌中同源盒蛋白B13（HOXB13）和FTO 的表達(dá)升高，F(xiàn)TO 可抑制下游靶基因HOXB13 的甲基化，通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［45］。m6A 甲基化酶METTL3 在胃癌中的過表達(dá)增加了腫瘤抑制基因素金屬蛋白酶9（ADAMTS9）的m6A 修飾，使ADAMTS9 的表達(dá)降低通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 通路促進(jìn)胃癌中的血管生成和癌變［46］。

4.結(jié)直腸癌

m6A 甲基化結(jié)合蛋白YTHDF1 通過增強(qiáng)FZD9 和Wnt6 翻譯效率，導(dǎo)致Wnt/β-catenin 信號通路過度激活，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生，YTHDF1 與結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展呈正相關(guān)［47］。m6A 甲基化酶METTL3 在結(jié)直腸癌調(diào)控中具有雙重作用，降低METTL3 通過調(diào)節(jié)p38/ERK 通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［48］。然而過表達(dá)METTL3 也可以促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，METTL3 介導(dǎo)miR-1246 甲基化修飾抑制抗癌基因SPRED2 的表達(dá)進(jìn)一步使Raf/MEK/ERK 通路失活，促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲，METTL3/miR-1246/SPRED2軸在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用［49］。

5.食管癌

有研究發(fā)現(xiàn)，m5C 甲基化酶NSUN2 介導(dǎo)的m5C 甲基化修飾通過調(diào)控PI3K/AKT 和ERK/MAPK 通路中的GRB2 從而促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）的發(fā)生和進(jìn)展；其作用機(jī)制為E2F1轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)NSUN2的表達(dá)進(jìn)而增加GRB2的m5C甲基化水平，m5C甲基化結(jié)合蛋白內(nèi)膜組織Lin-28同系物B與帶有m5C修飾的GRB2結(jié)合進(jìn)而增加GRB2的穩(wěn)定性，GRB2水平增加激活PI3K/AKT 和ERK/MAPK 信號通路，促進(jìn)ESCC進(jìn)程［50］。

展 望

綜上所述，本文闡述了部分m6A 甲基化修飾通過影響與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)的信號通路調(diào)控癌癥的發(fā)生發(fā)展。目前，在開發(fā)m6A 靶向治療方面的研究主要集中在m6A 修飾酶的靶向性，以m6A 為靶點(diǎn)的治療已逐漸被應(yīng)用于腫瘤等疾病的臨床治療中。最近，m5C 甲基化在腫瘤方面的研究引起了越來越多關(guān)注但相關(guān)通路與m5C 修飾之間的關(guān)系目前報(bào)道相對較少［51］。m5C 與m6A 修飾的研究思路基本相同，而相比m6A，m5C的一些甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶和甲基化結(jié)合蛋白等組分鑒定出的種類較少，因此RNA 甲基化修飾目前還具備非常大的潛在研究價(jià)值。

作者貢獻(xiàn)聲明邵爽：起草文章；郭紀(jì)偉：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；孟瑋：支持性貢獻(xiàn)