吳清鏵　賈瑞宗　郭靜遠(yuǎn)　楊牧之　胡玉娟　郝志剛　趙輝　郭安平

關(guān)鍵詞：番木瓜；番木瓜環(huán)斑病毒；Nib 基因；RNA 介導(dǎo)的病毒抗性

中圖分類號(hào)：S436.67 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

番木瓜（Carica papaya L.）是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)水果之一，其富含豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與潛在的醫(yī)療價(jià)值，深受大眾喜愛(ài)。番木瓜最主要的病害是番木瓜環(huán)斑病毒?。≒apaya ringspotvirus， PRSV）[1-2]，對(duì)番木瓜產(chǎn)業(yè)造成重大打擊。傳統(tǒng)的病毒防治措施如交叉保護(hù)[3-4]，田間綜合管理[5]，傳播媒介防治[6-7]，以及抗病育種[8-9]在一定程度上阻止了病毒的傳播，但這并不足以避免農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的損失[10]。通過(guò)基因工程提高番木瓜的抗病能力，使得轉(zhuǎn)基因番木瓜成為早期商業(yè)化種植的成功案例之一。

根據(jù)“致病菌衍生的抗病性（pathogen-derivedresistance， PDR）”原理，第一例夏威夷抗病毒的轉(zhuǎn)基因番木瓜問(wèn)世，PDR 的抗病育種策略是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[11-12]。RNA 干擾（RNAi）是表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默[13]，已被證明在病毒防御反應(yīng)中發(fā)揮作用，并已成功地作為生物技術(shù)工具用于轉(zhuǎn)基因植物的病毒抗性。RNAi 是一種由小RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。RNAi 過(guò)程涉及3 個(gè)基本特征：雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)，dsRNA被切割成21～25 個(gè)核苷酸大小的小干擾RNA（siRNA）[14-15]，以及siRNA 被整合到RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中進(jìn)行序列特異性降解[16]。通過(guò)使用RNAi技術(shù)，針對(duì)目標(biāo)mRNA 的外源性雙鏈RNA，抑制了靶基因的表達(dá)水平。由于外源序列并未表達(dá)產(chǎn)物，RNA 介導(dǎo)的病毒抗性具有生物安全優(yōu)勢(shì)，且降低了引入外源基因植株帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)[17]。

通過(guò)轉(zhuǎn)病毒外殼蛋白（coat protein， CP）基因在植物中表達(dá)而產(chǎn)生抗病性[18-20]。然而，外殼蛋白基因可能與自然界中的其他病毒或致病因子重組成新的致病因子產(chǎn)生可傳播和流行的危險(xiǎn)病毒[21-22]。復(fù)制酶（nuclear inclusion b， Nib）基因是一種依賴于病毒RNA 的RNA 聚合酶（RNAdependentRNA polymerase， RdRp）[23]，用病毒復(fù)制酶轉(zhuǎn)化植物已被證明可以產(chǎn)生穩(wěn)定高效的抗性，通過(guò)與復(fù)制酶mRNA 結(jié)合[24]，阻斷病毒mRNA 的復(fù)制或使病毒mRNA 通過(guò)RNAi 衰減直接影響病毒RNA 的復(fù)制[25]，是獲得病毒抗性植物有效的方法。目前通過(guò)轉(zhuǎn)病毒Nib 基因使作物獲取抗性的方法被廣泛運(yùn)用于大豆[26]、小麥[27-28]、豌豆[29]、煙草[24， 30]、芥菜[25]、大白菜[31]等作物。

前期工作發(fā)現(xiàn)，海南番木瓜環(huán)斑病毒遺傳多樣性差異較大[32]，大規(guī)模種植單一抗性的轉(zhuǎn)基因番木瓜很容易促進(jìn)靶標(biāo)病毒的突變，導(dǎo)致抗性喪失。本團(tuán)隊(duì)前期已經(jīng)獲得1 個(gè)基于番木瓜外殼蛋白基因沉默番木瓜株系的培育并驗(yàn)證具有一定抗性[33-34]，建立基于多目標(biāo)基因的沉默（CP+Nib）來(lái)提高番木瓜的廣譜抗性，以期應(yīng)對(duì)靶標(biāo)病毒的突變以及遺傳多樣性。因此本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，采取了對(duì)Nib 基因沉默的策略創(chuàng)制番木瓜新品系，并驗(yàn)證其抗病性，積累抗病新資源。

1 材料與方法

1.1 材料

受體材料選擇番木瓜品種穗中紅48，由廣州市果樹(shù)研究所惠贈(zèng)。遺傳轉(zhuǎn)化方法及再生苗由本實(shí)驗(yàn)室提供[32-34]。大腸桿菌DH5α 購(gòu)自Sangon 公司（B528413），農(nóng)桿菌GV3101 由本實(shí)驗(yàn)室保存。載體采用新霉素磷酸轉(zhuǎn)移Ⅱ 基因（ NeomycinphosphotransferaseⅡ，NPTⅡ）作為標(biāo)記基因，抗生素為卡那霉素（50 mg/L）。載體構(gòu)建如圖1。

試劑與儀器：植物總RNA 抽提純化試劑盒（TIANGEN，DP441-H）、多糖多酚植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，DP360）、FastKingRT Kit（TIANGEN，KR116）用于核酸提取試驗(yàn)；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（Sangon，B511139）、質(zhì)粒小提試劑盒（Omega，D6943-100T）、pUCm-Tvector（Sangon，B620435）、IPTG 溶液（Sangon，B541007）、X-Gal 溶液（Sangon，B541006）用于hiTAIL-PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)化插入的位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。超微紫外分光光度計(jì)（倍輝，DS-11）、冷凍型離心機(jī)（Therom Fisher，Micro21R）用于核酸提取、質(zhì)粒提??；PCR 儀（AnalytikJena AG，TAdvanced 96SG）用于陽(yáng)性株系的篩選；電泳儀（ 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY600E）用于PCR 檢驗(yàn)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)用于凝膠回收（Azure，C300）；控溫?fù)u床用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化（IKA，4000i）；電熱恒溫水浴箱用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化（上海一恒，DK-8D）。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 引物設(shè)計(jì)使用NCBI 在線引物設(shè)計(jì)工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）在插入位點(diǎn)上游286 bp 處設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物NibB5-2-533F，在插入位置的下游451 bp 處設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物Nibb5-2-1269R；在插入位點(diǎn)上游和載體上設(shè)計(jì)2 對(duì)嵌合引物NibB5-2-100F/NibB5-2-557R和NibB5-2-121F/NibB5-2-515R，用于插入位點(diǎn)的驗(yàn)證。引物及探針序列見(jiàn)表1，引物合成以及DNA測(cè)序均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2.2 核酸提取方法（DNA/RNA） 將0.2 g 新鮮番木瓜葉片在液氮中充分研磨后，使用植物基因組提取試劑盒提取植物總DNA，用于轉(zhuǎn)化特異性PCR 進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株的篩選，通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性，并利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度和純度，–20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 mg 的番木瓜葉片在液氮充分研磨后使用植物總RNA抽提純化試劑盒提取植物總RNA，通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度和純度，–80 ℃保存，用于后續(xù)研究葉片中PRSV 的病毒積累量。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)化事件特異性PCR 篩選陽(yáng)性株系 用轉(zhuǎn)化事件特異PCR 進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的篩選。引物分別是目標(biāo)基因Nib 引物（PRSV-Nib3/PRSV-Nib4）、轉(zhuǎn)化事件特異性引物（CaMV35S F/Nib4）和內(nèi)參引物（Papain F/PapainR）（表1），以陽(yáng)性質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照（CK+），水為陰性對(duì)照（CK–）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：12.5 μL2×Taq master Mix、1.0 μL 上游引物（100 μmoL/L）、1.0 μL 下游引物（100 μmoL/L）、1.0 μL 番木瓜基因組DNA 模板、9.5 μL Nuclease-free water。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)完畢后，通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后EB 染色，拍照記錄。

1.2.4 hiTAIL-PCR 方法確定轉(zhuǎn)化株系的插入位點(diǎn)位置 采用高效熱不對(duì)稱交互式PCR（ highefficiencyTAIL-PCR， hiTAIL-PCR）[35]方法檢測(cè)陽(yáng)性品系插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。根據(jù)已有報(bào)道的研究方法[36]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后將PCR 產(chǎn)物切膠回收，將回收的目標(biāo)條帶DNA 與pUCm-Tvector 連接進(jìn)行克隆載體的轉(zhuǎn)化，最后通過(guò)菌液PCR 挑選每個(gè)轉(zhuǎn)化的3 個(gè)重復(fù)陽(yáng)性菌送往北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將獲得的DNA 序列在Phytozome v13.0（https：//phytozome.jgi.doe.gov）在線軟件與番木瓜基因組（C. papaya， ASGPBv0.4）進(jìn)行Blast 比對(duì)，以獲得側(cè)翼序列確定插入的位點(diǎn)信息。

1.2.5 插入位點(diǎn)驗(yàn)證 利用引物NibB5-2-533F/Nibb5-2-1269R 驗(yàn)證插入位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。使用2 對(duì)嵌合引物NibB5-2-100F/NibB5-2-557R 和NibB5-2-121F/NibB5-2-515R 進(jìn)一步驗(yàn)證插入位點(diǎn)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×Taq masterMix，1.0 μL 上游引物（100 μmoL/L），1.0 μL 下游引物（100 μmoL/L），1.0 μL DNA 模板，9.5 μLNuclease-free water。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后EB 染色，拍照記錄。

1.2.6 不同轉(zhuǎn)化品系T0 代田間自然抗病評(píng)估將轉(zhuǎn)Nib 基因的T0 代幼苗以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ找圃缘教镩g中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院文昌試驗(yàn)基地（19°32?14.521?N，110°44?51.652?E，具有隔離條件），進(jìn)行抗病性篩選。分別在移栽3 個(gè)月后第90、100、110、120、130、140、150、180、210、240 天觀測(cè)和采樣。

1.2.7 T₁代植株病毒接種試驗(yàn) 海南PRSV 病毒活體植株保存于本實(shí)驗(yàn)室。參照黃靜等[33] 的PRSV 制備病毒接種液和接種方法，具體如下：

（1）取含有PRSV 病毒的番木瓜葉樣適量，將感染病毒的葉片和磷酸緩沖液（1×PBS）按照1∶10 的比例（即1 g 葉片，10 mL PBS）混勻后充分研磨至勻漿狀，5000 r/min 離心10 min 后，吸取上清液作為接種液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）在莖尖向下數(shù)第三葉，人工接種PRSV。首先在葉片表面上灑上少許石英砂，用碾磨棒或者指腹由葉脈向葉尖輕輕摩擦，而后滴加10 μL接種液并將其在葉片表面涂抹均勻。

（3）轉(zhuǎn)基因株系（NibB5-2 T₁ 代）為實(shí)驗(yàn)組，非轉(zhuǎn)基因株系（NibB5-5 T₁代）為對(duì)照組。分別進(jìn)行病毒接種試驗(yàn)，只接種緩沖液（不含病毒）的對(duì)照試驗(yàn)，和不接種對(duì)照試驗(yàn)。每種處理設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。接種病毒后第0、4、8、12、16、20、24、28、32 天觀測(cè)發(fā)病情況，并取相鄰葉片（莖尖向下數(shù)第二葉片）檢測(cè)PRSV 病毒積累量。

1.2.8 PRSV 病毒積累量檢測(cè) 番木瓜總RNA的提取參見(jiàn)1.2.2，利用FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒以番木瓜總RNA 為模板合成cDNA 第一鏈。反應(yīng)體系和程序?yàn)椋? μL 5×g DNA Buffer、2μL Total RNA、6 μL Nuclease-free water，PCR 儀中42 ℃ 3 min 后，置于冰水混合物中放置3 min。然后加入2 μL 10×King RT Buffer、1 μL FastKingRT Enzyme Mix、2 μL FQ-RT Primer Mix、5 μLNuclease-free water，于42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min，于–20 ℃保存。

使用PRSV-CP 特異性引物進(jìn)行PCR 檢驗(yàn)，以病毒接種液作為陽(yáng)性對(duì)照（CK+），無(wú)核酸酶水作為陰性對(duì)照（CK–）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：12.5 μL2×Taq master Mix、1.0 μL CP（9268）、1.0 μL CP（9979）、1.0 μL cDNA 模板、9.5 μL Nuclease-freewater。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后，通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后EB 染色，拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株系

本研究共計(jì)獲得52 株已經(jīng)過(guò)抗性篩選的再生苗，用轉(zhuǎn)化事件特異PCR 對(duì)再生苗進(jìn)行篩選，一共篩選出24 株陽(yáng)性株系，圖2 為部分篩選結(jié)果，選取在田間表現(xiàn)良好、栽培后能正常開(kāi)花結(jié)果、抗性表現(xiàn)較好的T0 代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株系代表Nib5-2進(jìn)行分子特征檢測(cè)。

2.2 hiTAIL-PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)化體在番木瓜基因組上的插入位點(diǎn)

NibB5-2 樣品的hiTAIL-PCR 電泳結(jié)果如圖3，將測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)Blast 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)位于2號(hào)染色體的supercontig_30.113 的1976766 處，比對(duì)的詳細(xì)結(jié)果為Score=675 bits（748），Expect=0.0Identities=376/377（99%）（圖3）。插入位點(diǎn)上、下游最近的基因距離為3.6 kb，插入位點(diǎn)上游10 kb內(nèi)有2 個(gè)Ankyrin Repeat 家族蛋白（evm.TU.supercontig_30.153、evm.TU.supercontig_30.149），下游10 kb 內(nèi)有2 個(gè)Ankyrin Repeat 家族蛋白（evm.TU.supercontig_30.154、evm.TU.supercontig_30.155）、1 個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子閉合蛋白（PF03732，evm.TU.supercontig_30.156）和1 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶（evm.TU.supercontig_30.157）。

插入位點(diǎn)的上游引物NibB5-2-533F 與下游引物Nibb5-2-1269R 在非轉(zhuǎn)基因番木瓜DNA 中擴(kuò)增得到預(yù)期約737 bp 的產(chǎn)物；而在轉(zhuǎn)基因株系中，由于外源載體的插入，PCR 產(chǎn)物預(yù)計(jì)大小為4.2 kb+737 bp（圖4）。將插入位點(diǎn)上游引物NibB5-2-100F/NibB5-2-121F 和載體上的引物NibB5-2-557R/NibB5-2-515R 匹配，擴(kuò)增番木瓜基因組和載體序列的嵌合產(chǎn)物，在轉(zhuǎn)基因番木瓜中擴(kuò)增得到預(yù)期大小條帶（480 bp 和415 bp），而在非轉(zhuǎn)基因番木瓜中未得到擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4）。

2.3 不同轉(zhuǎn)化株系T₀代田間自然發(fā)病評(píng)估

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因株系的田間發(fā)病觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Nib 番木瓜株系和非轉(zhuǎn)基因株系在田間的抗病性差異明顯。非轉(zhuǎn)基因株系均感病，具體表現(xiàn)為在移苗后第5 個(gè)月時(shí)表現(xiàn)出病癥，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病癥日益明顯，在第6 個(gè)月時(shí)出現(xiàn)典型病癥如果實(shí)上出現(xiàn)環(huán)斑（圖5C）；轉(zhuǎn)Nib 番木瓜株系移苗后，植株整體表現(xiàn)健康，一直至第12 個(gè)月無(wú)明顯癥狀。通過(guò)對(duì)3～6 個(gè)月番木瓜樣品進(jìn)行病毒積累量的PCR 檢測(cè)，NibB5-1 在第151 天開(kāi)始出現(xiàn)病毒積累，NibB5-2 在第151 天開(kāi)始出現(xiàn)病毒積累，NibB5～9 在第112 天出現(xiàn)病毒積累，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誑ibB5-5 在第112 天出現(xiàn)病毒積累（圖5A）。

2.4 轉(zhuǎn)基因番木瓜T₁代抗性評(píng)價(jià)

轉(zhuǎn)基因番木瓜NibB5-2 T₁代株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ赵诮臃N病毒后32 d 內(nèi)抗病性差異明顯。3 株接種病毒的對(duì)照植株表現(xiàn)一致，在第8 天時(shí)表現(xiàn)出病癥，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病癥日益明顯，在第24 天時(shí)出現(xiàn)病癥典型；同時(shí)接種病毒的3 株NibB5-2 T₁植株在32 d 內(nèi)，部分有病毒積累，但表型都正常。9 個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)的植物樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)病毒積累量的檢測(cè)結(jié)果如圖6A。在相同模板量下，對(duì)照植株的凝膠檢測(cè)灰度呈指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，即隨著時(shí)間的延長(zhǎng)感染病毒量逐漸遞增，NibB5-2T₁代植株基本無(wú)變化（圖6B）。

3 討論

PRSV 是海南番木瓜生產(chǎn)的主要制約因素。雖然基于siRNA 和植物人工微RNA（amiRNA）的短發(fā)夾RNA（shRNA）可以有效地減少病毒復(fù)制，但廣泛的病毒遺傳變異可能會(huì)使病毒逃逸[37]，PRSV 存在地理分化，各地的病毒株系差異大，在海南不同地區(qū)分布的PRSV 病毒株系差異大[32， 38]，所以抗PRSV 轉(zhuǎn)基因番木瓜品種的種植僅限于某些地理區(qū)域[39]。RNA 介導(dǎo)的病毒抗性受到入侵病毒與目標(biāo)轉(zhuǎn)基因之間序列同源性的影響[40]，若siRNA 與其靶標(biāo)之間存在不匹配，會(huì)影響靶標(biāo)RNA 的識(shí)別切割，干擾效應(yīng)降低，甚至使siRNA失活[41-42]。此外，有研究表明，抗病毒效果可能在于小靶區(qū)的同源性而并非全序列的同源性[43-44]。課題組前期通過(guò)海南全境內(nèi)PRSV 遺傳多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同群體（HainanⅠ，Ⅱ，Ⅲ）[32]還根據(jù)RNAi 原理利用海南PRSV-CP 基因保守序列將抗海南番木瓜環(huán)斑病毒植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS 轉(zhuǎn)入番木瓜中，對(duì)轉(zhuǎn)CP 基因番木瓜進(jìn)行分子特征及抗病毒試驗(yàn)分析，獲得了具有較好的PRSV 抗性的轉(zhuǎn)基因株系[33-34]。

在番木瓜中引入1 個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)來(lái)靶向PRSVNib，理論上，病毒的RNA 與轉(zhuǎn)基因的RNA 的靶向方式相同，從而使植物能夠抵抗感染。在本研究中，描述了通過(guò)轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行陽(yáng)性株系篩選、hiTAIL-PCR 驗(yàn)證特異插入位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)基因株系抗性試驗(yàn)，鑒定了1 個(gè)抗病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜NibB5-2 的基因組插入和側(cè)翼區(qū)域，這在轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)估和追蹤單個(gè)轉(zhuǎn)基因事件中非常重要[45]。轉(zhuǎn)基因植株NibB5-2 外源基因未插入到番木瓜編碼基因中，hiTAIL-PCR 顯示插入位點(diǎn)在第2 號(hào)染色體的supercontig_30 的1976766 位置，設(shè)計(jì)特異引物驗(yàn)證插入位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株NibB5-2 為雜合子。轉(zhuǎn)基因植株NibB5-2 和非轉(zhuǎn)基因植株NibB5-5 通過(guò)田間自然發(fā)病試驗(yàn)，對(duì)癥狀進(jìn)行視覺(jué)評(píng)估，并使用PRSV（CP）外殼蛋白引物，通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)病毒的存在，結(jié)果表明植株NibB5-2 對(duì)由病蟲傳播的PRSV 產(chǎn)生了抗性。這是由于轉(zhuǎn)基因番木瓜植株NibB5-2 體內(nèi)含有Nib 發(fā)夾插入結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)入Nib 基因反向重復(fù)載體轉(zhuǎn)錄形成了dsRNA，含有dsRNA 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被dicer 酶識(shí)別，誘導(dǎo)RNAi 機(jī)制的啟動(dòng)[46]，從而有效抑制了在田間PRSV 對(duì)番木瓜的危害。在轉(zhuǎn)基因植株NibB5-2 T1 代和非轉(zhuǎn)基因植株NibB5-5 T1代植株中進(jìn)行摩擦接種實(shí)驗(yàn)，在接種后，NibB5-2T1 代植株表現(xiàn)出抗性，T1 代植株中含有Nib 發(fā)夾插入，并在大多數(shù)情況下表達(dá)了該基因，假設(shè)RNAi 可以誘導(dǎo)植物的病毒防御，轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平足夠強(qiáng)，足以引起影響。由雙鏈反向重復(fù)序列莖和單鏈內(nèi)含子環(huán)組成了發(fā)夾RNA（hpRNA），雙鏈莖決定了反應(yīng)的特異性是RNA 沉默的關(guān)鍵因素[47]，內(nèi)含子與RNA 沉默雖然沒(méi)有直接關(guān)系但內(nèi)含子有利于hpRNA 的形成，提高其穩(wěn)定性，誘導(dǎo)有效的基因沉默[48]。當(dāng)莖長(zhǎng)為200～800 bp 時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)明顯的沉默， 沉默效率高達(dá)60%～80%[49]。

采用RNAi 策略獲得PRSV 抗性，目標(biāo)基因的小片段可以最大限度地降低重組、轉(zhuǎn)化、協(xié)同作用和互補(bǔ)的風(fēng)險(xiǎn)，且還可避免田間釋放和商業(yè)化的潛在風(fēng)險(xiǎn)[50]。含PRSV-Nib 的轉(zhuǎn)基因番木瓜已遺傳到T1 代，對(duì)PRSV 仍具有抗性，可進(jìn)一步用于抗病育種。為獲得廣譜抗 PRSV 的轉(zhuǎn)基因植株，還需要通過(guò)多代選擇，以此產(chǎn)生更穩(wěn)定的品系，未來(lái)的工作還需要確定這些轉(zhuǎn)基因植株是否在田間條件和較高溫度下保持表達(dá)并提供抗性。