陳瑩 張春渝 許小瓊 林玉玲 賴鐘雄

收稿日期：2024-01-05

基金項目：國家自然科學基金項目（31572088）；福建省高原學科建設經(jīng)費（102/71201801101）；福建農(nóng)林大學科技創(chuàng)新專項基金

項目（KFA19037A）

作者簡介：*為通訊作者，賴鐘雄（1966-），男，研究員，博士，博士生導師，主要從事園藝植物的生物技術與遺傳資源研究，E-mail：

Laizx01@163.com。陳瑩（2003-），女，從事果樹生物技術研究，E-mail：863445312@qq.com

4種無患子科植物的SMXL家族全基因組鑒定、進化

及DlSMXLs在龍眼體胚發(fā)生過程中的表達分析

陳? ? 瑩，張春渝，許小瓊，林玉玲，賴鐘雄*

（福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州? ?350002）

摘要：【目的】為研究無患子科SMXL家族的生物學特性提供理論參考，深入探究該基因家族在無患子科植物非生物脅迫響應中的調(diào)控機制?！痉椒ā炕谀Ｊ街参飻M南芥SMXL家族的氨基酸序列，利用TBtools對龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝的SMXL家族成員進行全基因組鑒定，Expasy、MEGA11等軟件用于4種無患子科植物的進化和功能分析，同時利用龍眼轉錄組數(shù)據(jù)進行體胚發(fā)生早期階段的表達分析。【結果】4種無患子科植物共鑒定出48個SMXL家族成員，其中龍眼11個、紅毛丹11個、無患子9個以及荔枝17個。依據(jù)擬南芥SMXL家族成員的分類，將4種無患子科SMXL家族成員分為5個亞族且亞細胞定位于葉綠體、細胞核、細胞質或線粒體。蛋白互作分析表明，無患子科SMXL家族成員可能與多種蛋白存在互作關系，主要分為兩類：一種是與受到非生物脅迫時大量表達的熱休克蛋白（HSPs）或CLPs互作；另一種是與獨角金內(nèi)酯受體蛋白D14、karrikins受體蛋白KAI2和調(diào)控SL信號傳導途徑的蛋白MAX2進行互作。啟動子順式作用元件分析表明，4種無患子科植物SMXL家族成員存在較多的光響應元件、抗氧化反應元件（ARE）和脫落酸響應元件（ABRE）等，推測該基因家族廣泛參與非生物脅迫響應。此外，DlSMXL家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期存在5種不同的表達模式，其中DlSMXL4基因家族成員在胚性愈傷組織（EC）、不完全胚性緊實結構（ICpEC）和球形胚（GE）階段相較其他成員呈現(xiàn)較高表達。基于5-氮胞苷、PEG、SL、光、溫度和各種激素處理龍眼EC時期轉錄組數(shù)據(jù)分析可知，龍眼DlSMXL5在干旱、GR24、黑暗和高溫處理下表達量均明顯增加，推測該成員能夠通過響應植物激素和應激脅迫維持胚性愈傷組織形態(tài)。其次DlSMXL8在5-氮胞苷處理時表達上調(diào)，推測其可能參與DNA甲基化在龍眼體胚發(fā)生過程中發(fā)揮作用?！窘Y論】4種無患子科植物SUPPRESSOR OF MAX2-LIKE（SMXL）家族除了在植物生長發(fā)育過程種發(fā)揮重要的作用，同時還廣泛參與植物非生物脅迫調(diào)控過程。本研究結果為無患子科植物中SMXL的分類和生物學功能提供了理論依據(jù)，并為SMXL在龍眼早期體細胞胚胎發(fā)生中的功能驗證提供了更好的認識。

關鍵詞：無患子科；SMXL基因家族；全基因組鑒定；進化分析；龍眼早期表達分析

中圖分類號：S667? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2095-5774（2024）01-0017-13

Genome-wide Identification and Evolutionary Analysis of the SMXL Gene Family

in Four Sapindaceae Species and Expression Analysis of DlSMXLs during Somatic

Embryogenesis in Longan

Chen Ying，Zhang Chunyu，Xu Xiaoqiong，Lin Yuling，Lai Zhongxiong*

（Institute of Horticultural Bioengineering，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China）

Abstract：【Objective】To provide a theoretical reference for the study of the biological characterization of the SMXL family of Sapindaceae，and to delve into the regulatory mechanism of this gene family in the abiotic stress response of Sapindaceae plants. 【Method】Based on the amino acid sequences of the SMXL family of the model plant Arabidopsis thaliana，TBtools was used for genome-wide identification of SMXL family members from longan，rambutan， sapindus，and litchi. MEGA11 was used to construct the phylogenetic tree，and online software such as Expasy，WoLF PSORT，MEME，STRING，PlantCARE，etc. were used to predict the protein physicochemical properties，subcellular structural localization，conserved motifs，protein interactions，cis-acting elements，etc. respectively. Longan transcriptome data were also utilized for expression analysis in the early stages of somatic embryogenesis. 【Result】Forty-eight SMXL family members were identified in four Sapindaceae species，including 11 in longan，11 in rambutan，9 in sapindus，and 17 in litchi. According to the classification of the SMXL family of Arabidopsis thaliana，the SMXL family members in four Sapindaceae species could be divided into 5 subfamilies，and the subcells were located in chloroplasts，nuclei，cytoplasm or mitochondria. Protein interaction analyses showed that SMXL family members in Sapindaceae could interact with a variety of proteins，which were mainly classified into two categories：one with the heat shock proteins （HSP） or CLP，which were abundantly expressed when subjected to abiotic stress; the other interacted with the strigolactone receptor protein D14，the karrikin receptor protein KAI2，and the MAX2 protein，which regulated the SL signaling pathway. The results of the cis-element analysis showed that among the SMXL family members of the four Sapindaceae species，there were more light-responsive elements，anaerobiosis-inducible elements （ARE），and abscisic acid-responsive elements （ABRE），etc. Therefore，it was hypothesized that the SMXL members were largely involved in the response to abiotic stress in Sapindaceae. Furthermore，there were five different expression profiles of the DlSMXL family during the early SE in longan，with the DlSMXL4 showing higher expression at embryogenic callus （EC），incomplete compact pro-embryogenic （ICpEC），and globular embryos （GE） stages compared with the other members. Based on analysis of transcriptomic data at longan EC treated with 5-azacytidine，PEG，SL，light，temperature，and various hormones，it could be seen that DlSMXL5 expression was significantly increased by drought，GR24，darkness，and high-temperature treatments. It is hypothesized that this member is capable of maintaining embryonic healing tissue morphology in response to phytohormones and stressful stresses. Secondly，DlSMXL8 was up-regulated after 5-azacytidine treatment，which might be involved in DNA methylation playing a role during somatic embryogenesis in longan. 【Conclusion】As well as playing a critical role in plant growth and development，the SMXL family of four Sapindaceae species is also widely implicated in the regulation of abiotic stress. Our results provide a theoretical basis for the classification and biological function of SMXLs in the Sapotaceae and give a better understanding of the functional validation of SMXLs in early somatic embryogenesis longan.

Key words：Sapindaceae；SMXL；Genome-wide identification；Evolutionary analysis；Early somatic embryogenesis in longan

無患子科植物全世界共有144屬，1680余種，廣泛分布于熱帶和亞熱帶，少數(shù)種類可分布到溫帶，為一典型的泛熱帶分布科［1］，主要包括龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝等，均屬于喬木，樹體高大，童期長，遺傳上高度雜合，常規(guī)育種難度大［2］。但其在材用、工業(yè)用、藥用、食用、生態(tài)環(huán)境保護和綠化觀賞等方面發(fā)揮重要的作用［3］，以其作為研究對象有較高的經(jīng)濟和生態(tài)價值。

獨腳金內(nèi)酯（Strigolactones，SLs）是一類萜類小分子化合物，廣泛存在于植物界中［4］，來源于類胡蘿卜素，涉及廣泛的生理功能，包括調(diào)節(jié)植物結構（抑制芽生長和芽分枝）、光形態(tài)發(fā)生、種子萌發(fā)、結瘤和對非生物因素的生理反應［5］。此外，獨腳金內(nèi)酯作為根際信號能促進寄主植物與叢枝菌根真菌的共生，有助于植物吸收水分和營養(yǎng)，但也會刺激寄生雜草種子的萌發(fā)，造成農(nóng)作物的嚴重減產(chǎn)［6］。負責獨腳金內(nèi)酯信號傳導的蛋白大體分為 3 類：α/β 折疊型水解酶 DWARF14（D14）/ DECREASED APICAL DOMINANCE2（DAD2）/ RAMOSUS3（RMS3），富亮氨酸重復序列 F- box 蛋白 DWARF3（D3）/MORE AXILLARY GROWTH2（MAX2） 以及 Clp 蛋白酶家族 DWARF53（D53）/SUPPRESSOR OF MORE AXILLARY GROWTH2 LIKE I（SMXLs）［7-10］。已有研究表明，在擬南芥和水稻中，SMXL6、SMXL7和SMXL8及其同源物、與蛋白D14和蛋白MAX2在獨腳金內(nèi)酯感知過程中形成一個復合物，并在獨腳金內(nèi)酯信號傳導中發(fā)揮核心作用［6，11-16］。玉米DWARF 53與SL受體DWARF 14A/B（ZmD14A/B）相互作用影響植株過多分蘗和減少雄穗分枝，是玉米SL信號途徑的抑制因子［17］。D53/SMXLs基因除了作為獨角金內(nèi)酯信號傳導的抑制因子，還可以通過此通路來控制其他激素，李家洋團隊發(fā)現(xiàn)，抑制SL信號通路可能導致水稻莖基部生長素含量升高［18］。

SMXL基因對植物的生長和發(fā)育起重要的調(diào)控作用，目前已從擬南芥［19］、大豆［20］、蘋果［21］、油菜籽［22］和龍眼［23］等植物中鑒定出SMXL家族成員，但在荔枝、無患子和紅毛丹等無患子科植物中尚未見到詳細報道。本研究對4種無患子科植物SMXL基因的結構、其編碼蛋白的亞細胞定位及其互作蛋白等進行研究，為揭示無患子科植物SMXL家族成員的潛在功能提供理論依據(jù)。

1 試驗材料及方法

1.1試驗材料

利用第三代龍眼基因組數(shù)據(jù)（NCBI登錄號：PRJNA792504）和轉錄組數(shù)據(jù)及從SapBase（http：//www.sapindaceae.com/about.html）獲取紅毛丹、無患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)和轉錄組數(shù)據(jù)進行分析。從TAIR網(wǎng)站獲取擬南芥SMXL家族成員并下載其氨基酸序列，從NCBI網(wǎng)站上獲取甘蔗SMXL家族成員及其氨基酸序列，甜橙的基因組數(shù)據(jù)下載于CPBD網(wǎng)站。

1.2試驗方法

1.2.1? 4種無患子科植物SMXL家族成員的鑒定、蛋白基本理化性質分析和亞細胞結構定位

通過TAIR獲取擬南芥的SMXL基因家族的氨基酸序列，利用TBtools［24］以E-value參數(shù)為10-5為限制與龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)進行單向blastp的同源比對。使用NCBI獲取保守結構域文件，再刪除重復序列，最終確定龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝SMXL家族成員。

利用Expasy進行蛋白質理化性質預測；通過WoLF PSORT網(wǎng)站預測亞細胞結構定位；在線軟件SignalP 6.0用于進行蛋白信號肽的預測。

1.2.2? 4種無患子科植物SMXL家族成員系統(tǒng)進化樹的構建和進化分析

利用MEGA11軟件對龍眼、紅毛丹、無患子、荔枝、擬南芥、甜橙和甘蔗SMXL家族成員的氨基酸序列進行進化分析，使用ClustalW進行蛋白序列比對，參數(shù)設置：鄰接法（NJ）、自展值（Bootstrap）為1000、Passion Model并刪除數(shù)值小于70的枝干，構建進化樹，最后利用在線軟件iTOL （version 6.9）進行美化。

1.2.3? 4種無患子科植物SMXL基因家族成員的染色體定位

基于龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)，利用TBtools進行染色體位置定位分析。

1.2.4? 4種無患子科植物SMXL家族成員基因結構、保守基序、蛋白保守結構域和蛋白互作分析

利用MEME進行保守基序預測與分析，保守基序數(shù)設定為9，其他默認參數(shù)；利用NCBI進行蛋白保守結構域的預測，默認參數(shù)值；最后，基于龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)，利用TBtools對各個物種的基因結構、保守基序和蛋白保守結構域進行可視化。利用STRING （https：//string-db.org/）在線軟件，以模式植物擬南芥為選擇標準，進行蛋白互作分析，選擇一致性百分比最高的蛋白，置信水平設置為0.4。

1.2.5? 4種無患子科植物SMXL家族啟動子順式元件分析和轉錄因子結合位點預測

基于龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)，利用TBtools 提取DlSMXL、NlSMXL、SsSMXL 和LcSMXL家族成員上游2 000 bp基因序列，并獲取目的基因的啟動子文件，再利用PlantCARE預測啟動子區(qū)域的順式作用元件，TBtools用于結果的可視化。

1.2.6? 龍眼SMXL家族在體胚發(fā)生早期階段的表達分析

利用龍眼轉錄組數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)獲取龍眼SMXL基因家族成員在體胚發(fā)生早期不同階段中特異表達的FPKM值，利用TBtools繪制熱圖，分析各成員在體胚發(fā)生早期不同階段的表達模式。

利用龍眼5-氮胞苷［25］、PEG（PEG 5%和PEG 7.5%）［26］、SL［23］、溫度（15℃、25℃和35℃）［27］、光照［28］和各種激素處理（2，4-D、2，4-D+KT、KT和MS）轉錄組數(shù)據(jù)，提取DlSMXL家族成員在EC階段不同處理狀態(tài)下的FPKM值，借助TBtools繪制熱圖，分析各成員在不同處理下的表達模式。

2 結果與分析

2.1? 4種無患子科植物SMXL家族成員的鑒定

通過鑒定，從龍眼基因組中初步獲取14個DlSMXL家族成員，利用NCBI和TBtools分析DlSMXL的保守結構域，刪除了2個不含基本保守結構域的DlSMXL成員：Dlo016182和Dlo016183，繼續(xù)將剩下成員的氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)龍眼Dlo011406和Dlo010410為冗余序列，刪除Dlo011406成員，最終確定DlSMXL家族有11個成員。結合各成員在龍眼基因組中的相對位置，按照順序依次命名為DlSMXL1-DlSMXL11。按照同樣的方法獲取紅毛丹11個SMXL家族成員并將其命名為NlSMXL1-NlSMXL11；無患子SMXL家族9個成員命名為SsSMXL1-SsSMXL9；荔枝SMXL家族17個成員命名為LcSMXL1-LcSMXL17。

2.2? 系統(tǒng)進化樹的構建和進化分析

為進一步了解4種無患子科植物SMXL家族成員的生理功能和進化關系，利用MEGA11對龍眼、紅毛丹、無患子、荔枝、擬南芥、甜橙和甘蔗共75條SMXL蛋白序列，進行系統(tǒng)進化分析表明（圖1），依據(jù)擬南芥SMXL家族成員的分類，可將本研究SMXL家族的75個成員分為5個亞族。亞族Ⅰ有6個成員，亞族Ⅱ有15個成員，亞族Ⅲ共11個成員，亞族Ⅳ共7個成員及亞族Ⅴ共36個成員。亞族Ⅰ中成員數(shù)最少且不包括無患子成員。亞族Ⅴ中成員數(shù)量最多，包含甘蔗成員，但不具有擬南芥成員，推測亞族Ⅴ中的成員在進化過程中出現(xiàn)了功能的特異性分化。本文亞族分類均由此得出。

2.3? 4種無患子科植物SMXL蛋白質理化性質分析和亞細胞結構定位預測

4種無患子科植物的蛋白氨基酸數(shù)介于306 aa～1149 aa，分子量介于34.34 kDa～125.72 kDa，同亞族成員之間大小差異較?。坏入婞c介于4.95～8.51，大量成員呈酸性，僅亞族Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ中存在成員表現(xiàn)為堿性；不穩(wěn)定系數(shù)介于34.95～60.56，除了亞族Ⅴ，其余亞族成員均為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)介于74.84～103.14，均為親水蛋白，且均無信號肽。根據(jù)亞細胞結構定位分析可知，亞族Ⅰ和亞族Ⅱ成員主要在細胞核上行使功能，亞族Ⅲ和亞族Ⅳ成員主要在葉綠體上發(fā)揮作用，亞族Ⅴ成員主要定位在葉綠體或細胞質上。

2.4? 4種無患子科植物SMXL家族成員的染色體定位分析

為進一步了解各個家族成員之間的關系，通過TBtools對家族成員進行染色體的定位分析，根據(jù)結果可知：龍眼DlSMXL家族的11個成員分布在6條染色體上：chr1（DlSMXL1、DlSMXL8、DlSMXL9）、chr5（DlSMXL10、DlSMXL11）、chr12（DlSMXL6）、chr13（DlSMXL3、DlSMXL4）、chr14（DlSMXL2、DlSMXL7）和chr15（DlSMXL5）。紅毛丹NlSMXL家族的11個成員分布也在6條染色體上，分別是chr8（NlSMXL3、NlSMXL5、NlSMXL10）、chr11（NlSMXL6、NlSMXL9）、chr2（NlSMXL1、NlSMXL11）、chr7（NlSMXL4、NlSMXL7）、chr15（NlSMXL8）和chr9（NlSMXL2）。無患子SsSMXL家族的9個成員分布在5條染色體上，分別是chr02（SsSMXL1、SsSMXL5）、chr05（SsSMXL4）、chr06（SsSMXL3、SsSMXL9）、chr13（SsSMXL2、SslSMXL8）和chr14（SsSMXL6、SsSMXL7）。荔枝LcSMXL家族的17個成員分布在7條染色體上，染色體由長到短分別是Chr1，其包括LcSMXL1、LcSMXL7、LcSMXL8、LcSMXL11四個成員；Chr3包括LcSMXL14、LcSMXL17兩個成員；Chr7包括LcSMXL2、LcSMXL9、LcSMXL16三個成員；Chr10包括LcSMXL5一個成員；Chr12包括LcSMXL4、LcSMXL12、LcSMXL13、LcSMXL15四個成員；Chr13包括LcSMXL6一個成員和Chr15包括LcSMXL3、LcSMXL10兩個成員。

2.5? 4種無患子科植物SMXL家族成員蛋白保守結構域、基因結構和保守基序種類預測分析

為更深入了解DlSMXL、NlSMXL、SsSMXL和LcSMXL基因結構多樣性，將龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝的SMXL家族5個亞族成員的保守基序、蛋白保守結構域和基因結構進行可視化分析。結果（圖2）表明：4種無患子科植物SMXL家族成員的外顯子數(shù)量為1～13，LcSMXL15和LcSMXL16的基因長度較短，DlSMXL4、SsSMXL3和LcSMXL12的基因長度較長。Motif 3是所有成員均具備的保守基序，保守性較強。保守結構域共有6種，分別是RecA-like_ClpB_Hsp104-like、ClpA superfamily、P-loop_NTPase superfamily、chaperone_ClpB superfamily、clpC和clpC superfamily。同一亞族成員的基因結構、保守基序的種類和保守結構域極為相似，故推測處于同一亞族的成員在結構和功能上具有相似性。

2.6? 4種無患子科植物SMXL家族成員蛋白互作分析

為了解無患子科SMXL家族成員表達的蛋白與其他蛋白的互作關系，進一步挖掘核心的調(diào)控基因，探究基因的潛在功能，采用STRING在線軟件，得到蛋白互作預測結果表明：亞族Ⅰ成員與SMAX1為同源蛋白，并與蛋白SMXL7、D14、MAX2、DAD2、SKIP25、KAI2、RL2、CYP711A1、CCD7和CCD8互作；亞族Ⅱ成員與SMXL6為同源蛋白，與蛋白KAI2、D14、MAX2、CCD7、SMXL7、DAD2、OST1A、STT3A、RPN2、OST48和STT3B發(fā)生互作；亞族Ⅲ成員與SMXL3為同源蛋白，與蛋白MAX2、KAI2、D14、CPLS1、F5H14.16、CCD7、CCD8、SMAXI、CLPT2和CLPT1互作；亞族Ⅳ成員與SMXL5為同源蛋白，與蛋白TDR、KAI2、D14、MAX2、CCD8、SMAX1、SMXL4、CLE41、CLE44、Q9LW52_ARATH和F17I23.200進行互作；亞族Ⅴ成員與CLPB3為同源蛋白，與蛋白CLPD、CLPR1、CLPB1、CLPP4、CLPP5、clpP1、HSP70-4、TIC40、CLPB4、CLPC1、CLPP3、TIC110、TOC159和TOC75-3互作。

2.7? 4種無患子科植物啟動子順式作用元件分析

為了解龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝SMXL家族成員潛在的生物學功能，利用PlantCARE對龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝該家族成員的啟動子順式作用元件進行預測（圖3）。SMXL家族5個亞族成員的啟動子上均具有大量控制轉錄起始的TATA-box元件和控制轉錄效率的CAAAT-box元件，說明該基因家族成員均具有必須的轉錄元件。此外，還具有光響應元件、植物激素響應元件（脫落酸、MeJA、赤霉素、生長素、水楊酸響應元件等）、應激響應元件（厭氧誘導、干旱誘導、低溫誘導、防御和應激響應元件等）和與生長發(fā)育相關的元件（參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)、分生組織表達、胚乳表達、種子特異性調(diào)控等響應元件），其中Box 4光響應元件、與脫落酸響應相關的ABRE植物激素響應元件和抗氧化反應元件ARE數(shù)量最多，同時亞族Ⅱ成員還具有較多的G-box光響應元件，亞族Ⅲ成員具有較多的MeJA響應元件，亞族Ⅳ參與赤霉素響應的P-box元件最多。進一步分析可知，DlSMXL2、NlSMXL8、SsSMXL2和LcSMXL3具有較多的啟動子順式作用元件，預測其可能行使較多的功能。

2.8? 龍眼DlSMXL家族在體胚發(fā)生早期階段的表達分析

為了解無患子科植物在體胚發(fā)生早期的表達模式，基于已知上傳的龍眼轉錄組數(shù)據(jù)，繪制熱圖進行結果分析，在龍眼體胚發(fā)生早期階段（EC、ICpEC和GE），DlSMXL家族成員出現(xiàn)了5種不同的表達模式（圖4-A）：在GE階段上調(diào)，EC、ICpEC階段下調(diào)（DlSMXL3、DlSMXL7、DlSMXL8、DlSMXL11）；在ICpEC、GE階段上調(diào)，EC階段下調(diào)（DlSMXL1、DlSMXL10）；在ICpEC階段上調(diào)，EC、GE階段下調(diào)（DlSMXL4）；在EC階段上調(diào)，ICpEC、GE階段下調(diào)（DlSMXL5）；在EC、ICpEC階段上調(diào)，GE階段下調(diào)（DlSMXL2、DlSMXL6、DlSMXL9）。此外，DlSMXL4在EC、ICpEC和GE 階段相較其他成員呈現(xiàn)較高表達，可能意味著該成員在體胚早期的形成中發(fā)揮著重要的作用。同時，DlSMXL5在EC階段有較高的表達，而在ICpEC和GE階段表達量相對較低。而其他成員均呈現(xiàn)出較低表達或者不表達。

通過龍眼5-氮胞苷處理表達分析可知（圖4-B），DlSMXL家族成員出現(xiàn)了兩種不同的表達模式：經(jīng)過5-氮胞苷處理后的家族成員基因表達下調(diào)（DlSMXL1、DlSMXL2、DlSMXL4、DlSMXL5、DlSMXL6、DlSMXL10、DlSMXL11），另外一種是經(jīng)過5-氮胞苷處理后的家族成員基因表達上調(diào)（DlSMXL3、DlSMXL7、DlSMXL8、DlSMXL9）。5-氮胞苷處理可以使龍眼球形胚提前發(fā)生［29］。根據(jù)分析結果可知，DlSMXL家族成員能夠響應5-氮胞苷的處理，但是不同成員的響應模式不一樣，其中DlSMXL8經(jīng)過處理后表達水平上調(diào)顯著，由此推測，DlSMXL8在5-氮胞苷影響龍眼球形胚的形成過程中發(fā)揮作用。

基于龍眼PEG處理（PEG 5%和PEG 7.5%）表達分析，根據(jù)熱圖結果可知（圖4-C），DlSMXL家族成員表現(xiàn)出5種不同的表達模式：在PEG 5%和PEG 7.5%處理下表達上調(diào)、未處理組表達下調(diào)（DlSMXL11）；在PEG 7.5%處理下表達上調(diào)，PEG 5%處理和未處理組的表達下調(diào)（DlSMXL2、DlSMXL5）；在未處理組表達上調(diào)，PEG 7.5%和PEG 5%處理下表達下調(diào)（DlSMXL3、DlSMXL4、DlSMXL6、DlSMXL7、DlSMXL9）；在PEG 5%處理下表達上調(diào)，PEG 7.5%處理和未處理組表達下調(diào)（DlSMXL10）；在PEG 5%處理和未處理組表達上調(diào)，PEG 7.5%處理下表達下調(diào)（DlSMXL1、DlSMXL8）。其中DlSMXL2和DlSMXL5在PEG處理時表達量明顯增加，說明這2個成員可能參與干旱脅迫過程。

根據(jù)龍眼SL處理的表達分析可知（圖4-D），共表現(xiàn)出5種表達模式：經(jīng)過外源GR24處理表達量增加，未經(jīng)處理和加入丙酮處理后表達量下降（DlSMXL2、DlSMXL3、DlSMXL4、DlSMXL9、DlSMXL11）；未經(jīng)過處理的表達量增加，經(jīng)外源GR24和丙酮處理表達量下降（DlSMXL6、DlSMXL8）；經(jīng)過外源GR24和丙酮處理表達量升高，未經(jīng)處理表達量降低（DlSMXL5）；未經(jīng)處理、加入外源GR24和丙酮均不表達（DlSMXL7）；在丙酮處理下表達量升高，未經(jīng)處理和加入外源GR24表達量下降（DlSMXL1、DlSMXL10）。通過分析可知，龍眼SMXL家族大部分成員都能夠在GR24處理后表達量上升，推測該基因家族在調(diào)控龍眼的生長發(fā)育以及對干旱、低磷、低氮等逆境的適應能力中發(fā)揮重要的作用，其中DlSMXL5經(jīng)GR24處理后表達量顯著增加，說明該成員在SLs通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

基于龍眼光處理的表達分析可知（圖4-E），共表現(xiàn)出5種表達模式：經(jīng)過黑暗和白光處理表達量增加，經(jīng)藍光處理表達量降低（DlSMXL4）；經(jīng)過白光處理表達量增加，黑暗和藍光處理表達量降低（DlSMXL6）；經(jīng)過藍光處理表達量增加，黑暗和白光處理表達量下降（DlSMXL3、DlSMXL9、DlSMXL10）；經(jīng)過黑暗和藍光處理的表達量增加，白光處理的表達量降低（DlSMXL1）；經(jīng)過黑暗處理表達量增加，藍光和白光處理表達量降低（DlSMXL2、DlSMXL5）。其中DlSMXL5在黑暗處理下表達量顯著上調(diào)，而藍光和白光處理下表達量顯著下降，推測該成員在光響應過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

通過龍眼溫度處理表達分析，繪制熱圖可知（圖4-F），共表現(xiàn)出6種表達模式：經(jīng)過15℃和25℃處理的表達量增加，35℃處理的表達量降低（DlSMXL9）；經(jīng)25℃處理的表達量增加，15℃和35℃處理的表達量降低（DlSMXL7、DlSMXL11）；經(jīng)過15℃處理的表達量增加，25℃和35℃處理的表達量降低（DlSMXL1、DlSMXL4）；經(jīng)過15℃和35℃處理的表達量增加，25℃處理的表達量降低（DlSMXL3）；經(jīng)過35℃處理的表達量增加，15℃和25℃處理的表達量降低（DlSMXL2、DlSMXL5、DlSMXL6、DlSMXL10）；經(jīng)過25℃和35℃處理的表達量增加，15℃處理的表達量降低（DlSMXL8）。DlSMXL4在低溫處理時，表達量顯著增加，推測其在應對低溫脅迫時發(fā)揮重要作用。DlSMXL5在高溫處理時表達量顯著增加，表明在高溫環(huán)境中該成員發(fā)揮至關重要的作用。

基于龍眼各種激素（2，4-D、2，4-D + KT、KT和MS）處理表達分析，繪制熱圖可知（圖4-G），共表現(xiàn)出5種表達模式：經(jīng)過MS處理過的表達上調(diào)，2，4-D、2，4-D + KT以及KT處理過的表達下調(diào)（DlSMXL6）；經(jīng)KT處理過的表達上調(diào)，MS、2，4-D以及2，4-D + KT處理過的表達下調(diào)（DlSMXL4和DlSMXL9）；經(jīng)2，4-D處理過的表達上調(diào)，MS、2，4-D + KT以及KT處理過的表達下調(diào)（DlSMXL1）；經(jīng)2，4-D以及2，4-D + KT處理過的表達上調(diào)，KT以及MS處理過的表達下調(diào)（DlSMXL3和DlSMXL10）；經(jīng)2，4-D + KT處理過的表達上調(diào)，2，4-D、KT以及MS處理過的表達下調(diào)（DlSMXL2、DlSMXL5和DlSMXL8）。DlSMXL大多成員在2，4-D和2，4-D + KT處理時表達量上升顯著，推測這些成員在響應生長素和細胞分裂素等激素中發(fā)揮重要的作用。

3 小結與討論

3.1 無患子科植物SMXL家族進化特性及功能多樣性

SMXL基因對獨角金內(nèi)酯信號通路起重要的調(diào)控作用，本研究基于無患子科基因組數(shù)據(jù)分別鑒定出11個龍眼、11個紅毛丹、9個無患子和17個荔枝SMXL家族成員，與大豆的SMXL家族成員數(shù)量比較，龍眼、紅毛丹、無患子和荔枝單個物種家族成員數(shù)量較少［20］。依據(jù)擬南芥SMXL家族成員分成的4個亞族構建系統(tǒng)進化樹［19］，4種無患子科植物SMXL家族成員在進化樹中被分為5個亞族。本研究結果與擬南芥SMXL家族分組相比多一個亞族Ⅴ，并且亞族Ⅴ中成員數(shù)量最多，且包括單子植物甘蔗SMXL家族1個成員但不包含有擬南芥成員，再根據(jù)該亞族成員的基序種類較其他亞族成員多，推測該亞族進化時間較早，發(fā)生了特異進化，且出現(xiàn)功能分化并在無患子科植物中行使特殊功能。對4種無患子科植物SMXL家族成員的基因結構及蛋白保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，位于相同亞族的SMXL家族成員具有相似的外顯子-內(nèi)含子結構及蛋白保守結構域，推測處于同一亞族的SMXL家族成員可能存在相似的生物學功能。

SMXL基因功能的多樣性已在擬南芥和豆科植物上被驗證。通過亞細胞結構定位，推測無患子科植物的SMXL家族成員主要在葉綠體（22個）cc上行使功能。已有研究表明，TOC和TIC是由多個蛋白亞基組成的膜蛋白復合體，可介導眾多不同葉綠體蛋白的跨膜轉運，其對于葉綠體的生成、光合作用復合體的組裝以及各種代謝途徑的運轉起著關鍵作用［30］。通過蛋白互作可知，亞族Ⅴ的成員與蛋白TIC110、TOC159和TOC75-3產(chǎn)生互作。推測無患子科植物SMXL基因能夠參與TOC和TIC蛋白復合體的調(diào)控過程，改變?nèi)~綠體的數(shù)量、形態(tài)或功能，進而影響植物的光合速率。

3.2 無患子科植物SMXL基因可能廣泛響應非生物脅迫過程

目前已知SMXL家族抑制基因是karrikin和strigolactone信號通路的下游元件，在非生物脅迫下的植物生長發(fā)育調(diào)控中起重要作用［31］。本實驗基于龍眼轉錄組數(shù)據(jù)得知DlSMXL成員在非生物脅迫下表現(xiàn)出不同程度的表達，且4種無患子科植物啟動子上游有大量與干旱及低溫等脅迫相關的元件，故推測SMXL家族可能廣泛參與無患子科植物非生物脅迫的調(diào)控。DlSMXL大部分成員在體胚發(fā)生早期經(jīng)PEG處理后，表達下調(diào)。已有研究表明，四季豆PvSMXL2在PEG誘導的干旱脅迫下表達下調(diào)，因其瞬時沉默增強了植物干旱脅迫的耐受性［32］；擬南芥smxl6/smxl7/smxl8突變體的耐旱性與野生型相比顯著增強，主要表現(xiàn)在在脫水過程中葉片氣孔指數(shù)、角質層滲透性和水分流失降低，花青素生物合成增加，而且對ABA誘導的氣孔關閉和ABA響應非常敏感，同時也證明了ABA和SLs信號通路在調(diào)節(jié)植物對干旱的反應中存在交互作用［33］。從無患子科4種植物的順式作用元件中預測出較多的響應ABA的元件（ABRE），推測SMXL基因在無患子科植物的ABA信號傳導中發(fā)揮重要并通過對SLs信號途徑的介導增強對干旱等脅迫環(huán)境的適應性。DlSMXL家族較多成員經(jīng)35℃高溫處理時，表達量明顯上調(diào)，相反DlSMXL4在15℃低溫處理時表達上調(diào)顯著，推測SMXL基因在植物高溫或低溫脅迫下發(fā)揮重要的作用。

3.3 SMXL基因在龍眼體胚發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用

已有研究表明，SMXL基因通過調(diào)節(jié)SLs、類胡蘿卜素和IAA的合成水平來抑制植物早期胚胎發(fā)育［23］。龍眼體胚發(fā)生早期和不同處理下龍眼EC的轉錄組數(shù)據(jù)顯示，DlSMXL在龍眼體胚發(fā)生早期呈現(xiàn)出不同的表達模式，推測SMXL基因在龍眼的體胚發(fā)生早期也扮演著重要的角色。另外，DlSMXL8經(jīng)過5-氮胞苷處理后，表達量顯著上調(diào)，而適宜濃度的5-氮胞苷能抑制2，4-D的甲基化作用，降低龍眼胚性愈傷組織的DNA甲基化水平，促使龍眼球形胚提前發(fā)生［29］，故推測DlSMXL8可能參與加快龍眼體細胞胚胎發(fā)生進程中的DNA甲基化調(diào)控網(wǎng)絡。植物的生長是光形態(tài)建成的過程，光質對植物組織培養(yǎng)的一些形態(tài)發(fā)生過程起重要的調(diào)節(jié)作用［34］。據(jù)報道，龍眼EC在黑暗、白光和綠光條件下，生長狀態(tài)最佳；在藍光條件下，生長狀態(tài)較好，但出現(xiàn)顏色輕微褐化［35］。DlSMXL大多數(shù)成員在黑暗和藍光處理下表達上調(diào)，推測在黑暗或者藍光照射的條件下，SMXL基因發(fā)揮功能促進龍眼體胚的光形態(tài)建成。

參考文獻：

［1］夏念和，羅獻瑞. 中國無患子科的地理分布［J］. 熱帶亞熱帶植物學報，1995（1）：13-28.

［2］賴鐘雄，陳振光，潘良鎮(zhèn)，等. 無患子科果樹生物技術研究現(xiàn)狀與展望［J］. 中國南方果樹，1997（6）：37-39.

［3］沐建華. 文山州無患子科植物資源及其開發(fā)利用價值［J］. 文山學院學報，2017，30 （6）：23-27.

［4］陳虞超，鞏檑，張麗，等. 新型植物激素獨腳金內(nèi)酯的研究進展［J］. 中國農(nóng)學通報，2015，31（24）：157-162.

［5］Faizan M，F(xiàn)araz A，SAMI F，et al. Role of strigolactones：signalling and crosstalk with other phytohormones［J］. Open Life Sciences，2020，15：217-228.

［6］Wang L，Wang B，Yu H，et al. Transcriptional regulation of strigolactone signalling in Arabidopsis［J］. Nature，2020，583（7815）：277-281.

［7］Arite T，Umehara M，Ishikawa S，et al. d14，a strigolactone-insensitive mutant of rice，shows an accelerated outgrowth of tillers［J］. Plant and Cell Physiology，2009，50（8）：1416-1424.

［8］Hamiaux C，Drummond R S，Janssen B J，et al. DAD2 is an α/β hydrolase likely to be involved in the perception of the plant branching hormone，strigolactone［J］. Current Biology，2012，22（21）：2032–2036.

［9］Yao R，Wang L，Li Y，et al. Rice DWARF14 acts as an unconventional hormone receptor for strigolactone［J］. Journal of Experimental Botany，2018，69（9）：2355-2365.

［10］王雪菱，王如月，李際紅，等. 獨腳金內(nèi)酯抑制因子D53/SMXLs基因的研究進展［J］. 農(nóng)學學報，2023，13（10）：37-43.

［11］Jiang L，Liu X，Xiong G，et al. DWARF 53 acts as a repressor of strigolactone signalling in rice［J］. Nature，2013，504（7480）：401-405.

［12］Wang L，Wang B，Jiang L，et al. Strigolactone signaling in Arabidopsis regulates shoot development by targeting D53-Like SMXL repressor proteins for ubiquitination and degradation［J］. The Plant Cell，2015，27（11）：3128-3142.

［13］Zhou F，Lin Q，Zhu L，et al. D14-SCF（D3）-dependent degradation of D53 regulates strigolactone signalling［J］. Nature，2013，504（7480）：406-410.

［14］Soundappan I，Bennett T，Morffy N，et al. SMAX1-LIKE/D53 family members enable distinct MAX2-dependent responses to strigolactones and karrikins in Arabidopsis［J］. The Plant Cell，2015，27（11）：3143-3159.

［15］Yao R，Ming Z，Yan L，et al. DWARF14 is a non-canonical hormone receptor for strigolactone［J］. Nature，2016，536（7617）：469-473.

［16］Shabek N，Ticchiarelli F，Mao H，et al. Structural plasticity of D3-D14 ubiquitin ligase in strigolactone signalling［J］. Nature，2018，563（7733）：652-656.

［17］Villaécija-Aguilar J A，Hamon-Josse M，Carbonnel S，et al. SMAX1/SMXL2 regulate root and root hair development downstream of KAI2-mediated signalling in Arabidopsis［J］. PLOS Genetics，2019，15（8）：e1008327.

［18］Wang L，Xu Q，Yu H，et al. Strigolactone and Karrikin Signaling Pathways Elicit Ubiquitination and Proteolysis of SMXL2 to Regulate Hypocotyl Elongation in Arabidopsis［J］. Plant Cell，2020，32（7）：2251-2270.

［19］Feng Z，Liang X，Tian H，et al. SUPPRESSOR of MAX2 1 （SMAX1） and SMAX1-LIKE2 （SMXL2） Negatively Regulate Drought Resistance in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Cell Physiol，2023，63（12）：1900-1913.

［20］Wallner E S，López-Salmerón V，Belevich I，et al. Strigolactone- and karrikin-independent SMXL proteins are central regulators of phloem formation［J］. Current Biology，2017，27（8）：1241-1247.

［21］劉小杰.蘋果全基因組PIN和SMXL成員鑒定、系統(tǒng)進化及在腋芽萌發(fā)中的表達分析［D］. 陜西：西北農(nóng)林科技大學，2018.

［22］Yang H L，Liu X K，Li J L，et al. Genome-wide identification，phylogenetic and expression analysis of SMAX1-Like genes in rapeseed（Brassica napus L.）［J］. Oil Crop Science，2018，3（2）：71-85.

［23］Zhang X Y，Lai C W，Liu M Y，et al. Whole genome analysis of SLs pathway genes and functional characterization of DlSMXL6 in longan early somatic embryo development［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（22）：14047.

［24］Chen C，Chen H，Zhang Y，et al. TBtools：An Integrative Toolkit Developed for Interactive Analyses of Big Biological Data［J］. Mol Plant，2020，13（8）：1194-1202.

［25］Chen R Z，Chen X H，Huo W，et al. Transcriptome analysis of azacitidine （5-AzaC）-treatment affecting the development of early somatic embryogenesis in longan［J］. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2021，96（3）：311-323.

［26］Munir N. Genome-wide Expression Profiling of D.longan，and Identification and Expression Analysis of NAC TF during Somatic Embryogenesis under Drought Stress Conditions［D］. 福建：福建農(nóng)林大學，2023.

［27］陳曉東. 龍眼體胚發(fā)生早期對溫度響應的轉錄組和sRNA分析及SR作用的分子機制研究［D］. 福建：福建農(nóng)林大學，2021.

［28］Li H，Lyu Y，Chen X，et al. Exploration of the Effect of Blue Light on Functional Metabolite Accumulation in Longan Embryonic Calli via RNA Sequencing［J］. Int J Mol Sci，2019，20（2）：441.

［29］陳榮珠，賴鐘雄. 5-氮胞苷與2，4-D處理對龍眼早期體胚發(fā)生及DlAGOs表達的影響［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學，2021，41（8）：31-39.

［30］王琪，李云洲，須文，等. 葉綠體TOC-TIC蛋白復合體轉運機制研究進展［J］. 園藝學報，2021，48（4）：689-704.

［31］Fu X J，Wang J，Shangguan T W，et al. SMXLs regulate seed germination under salinity and drought stress in soybean［J］. Plant Growth Regulation，2022，96（3）：397-408.

［32］Fang P，Li M，Guo Q，et al. Genome-wide analysis of the SMXL gene family in common bean and identification of karrikin-responsive PvSMXL2 as a negative regulator of PEG-induced drought stress［J］. Gene，2023，887：147741.

［33］Yang T，Lian Y K，Kang J H，et al. The suppressor of MAX2 1 （SMAX1）-Like SMXL6，SMXL7 and SMXL8 Act as Negative Regulators in Response to Drought Stress in Arabidopsis［J］. Plant and Cell Physiology，2020，61（8）：1477-1492.

［34］林小萍，賴鐘雄，黃淺. 光質對植物離體培養(yǎng)的影響［J］. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2008 （1）：73-80.

［35］李小芳. 光質和ABA對龍眼愈傷組織生長與類胡蘿卜素含量的影響及DlPIFs的作用機制［D］. 福建：福建農(nóng)林大學，2023.

（責任編輯：賴瑞聯(lián)）