摘 要 為了解浙江省內(nèi)不同黃緣閉殼龜（Cuora flavomarginata）群體的種質(zhì)資源現(xiàn)狀，基于線粒體DNA COI序列對(duì)來自浙江省內(nèi)野外和養(yǎng)殖場(chǎng)的8個(gè)黃緣閉殼龜群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：黃緣閉殼龜線粒體COI基因序列長度為1 040 bp，A=27. 4%、T=30. 5%、C=24. 6%、G=17. 5%，有較強(qiáng)的AT偏好性；共定義9 個(gè)單倍型，單倍型多樣性（Hd）為（0. 799 00±0. 210 00），核苷酸多樣性（Pi）為（0. 002 09±0. 001 47），呈“高Hd低Pi”遺傳分布；不同黃緣閉殼龜群體間的遺傳距離為0～0. 003，群體內(nèi)部的遺傳距離為0～0. 004，其中磐安后閣村（YS）群體內(nèi)部的遺傳距離最大，為0. 004；單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹并未呈現(xiàn)明顯的譜系結(jié)構(gòu)；群體間遺傳分化指數(shù)（FST）為-0. 347 52～0. 822 22，8 個(gè)群體的遺傳分化不顯著（pgt;0. 05）；中性檢驗(yàn)（Tajima’s D=-0. 366 27，F(xiàn)u’s FS=-0. 605）與核苷酸錯(cuò)配分布均表明，浙江省內(nèi)黃緣閉殼龜群體并未經(jīng)歷種群擴(kuò)張事件，同時(shí)，由Mantel檢驗(yàn)可知，遺傳距離與地理距離沒有顯著的相關(guān)性（R=0. 293 8，pgt;0. 05）；AMOVA分子方差結(jié)果顯示，群體內(nèi)的遺傳變異高于群體間（85. 06%gt;14. 94%）。研究表明，浙江省內(nèi)黃緣閉殼龜群體之間為高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的遺傳特征，并且存在一定水平的遺傳分化，群體內(nèi)存在明顯的基因交流，根據(jù)COI基因分析顯示，在磐安縣獲得的野生黃緣閉殼龜個(gè)體確定為黃緣閉殼龜浙江種，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)存在浙江種與安徽種的雜交種，建議將分化程度不同的黃緣閉殼龜群體劃分為不同單元保護(hù)。研究結(jié)果為浙江省內(nèi)黃緣閉殼龜種質(zhì)資源開發(fā)利用和合理制定保護(hù)措施提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃緣閉殼龜；COI ；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)；浙江省

中圖分類號(hào)：Q953 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 02 - 0367 - 11

DOI：10.12375/ysdwxb.20240216

黃緣閉殼龜（Cuora flavomarginata）別名夾板龜、克蛇龜、斷板龜和黃緣盒龜，屬地龜科（Geoemydi?dae）閉殼龜屬（Cuora），是水陸兩棲性龜類。野生黃緣閉殼龜主要分布于我國河南省和安徽省，此外，浙江省、湖南省和臺(tái)灣地區(qū)等地也有野生黃緣閉殼龜?shù)膱?bào)道［1］。根據(jù)世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）記錄，黃緣閉殼龜可分為臺(tái)灣亞種（C. f. flavomarginata）、中國大陸南方亞種（C. f. sinensis）以及日本琉球亞種（C. f. evelynae）［2］。由于黃緣閉殼龜具有極高的食用、藥用價(jià)值，馴化性好，長相獨(dú)特，觀賞價(jià)值高，其野生資源遭到嚴(yán)重破壞，已被IUCN列為瀕危（EN）物種［2］，被《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ收錄［3］，被《中國生物多樣性紅色名錄—脊椎動(dòng)物卷（2020）》列為極危（CR）物種［4］，2016年被列入《浙江省重點(diǎn)保護(hù)陸生野生動(dòng)物名錄》［5］。

目前，關(guān)于黃緣閉殼龜?shù)难芯恐饕性谌斯ゐB(yǎng)殖與繁殖［6?7］、形態(tài)與組織［8］、遺傳多樣性［9］及線粒體基因組［10?11］等方面。荊勝利等［12］和郭旭升等［13］通過對(duì)黃緣閉殼龜保護(hù)遺傳學(xué)等方面的分析，分別探究了大別山區(qū)人工馴養(yǎng)黃緣閉殼龜?shù)倪z傳多樣性和河南信陽黃緣閉殼龜保護(hù)區(qū)的種群現(xiàn)狀，為黃緣閉殼龜后續(xù)的保護(hù)提供了基礎(chǔ)。潘冬冬等［14］基于線粒體基因?qū)Π不拯S緣閉殼龜和臺(tái)灣黃緣閉殼龜進(jìn)行了研究，并對(duì)其在安徽省皖南山區(qū)、大別山區(qū)的野外生存情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃緣閉殼龜?shù)馁Y源衰退，并存在種質(zhì)混雜的情況。董傳舉等［15］對(duì)黃緣閉殼龜種群進(jìn)行分類時(shí)，描述了其生物學(xué)特性，但關(guān)于浙江省內(nèi)黃緣閉殼龜種質(zhì)資源現(xiàn)狀、遺傳多樣性研究卻未見報(bào)道。因此，本研究利用線粒體COI基因序列對(duì)浙江省內(nèi)不同黃緣閉殼龜群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析，以期了解其種質(zhì)資源情況，從而為浙江省內(nèi)黃緣閉殼龜?shù)暮侠砝?、資源保護(hù)等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用黃緣閉殼龜取自義烏宏富農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司、東陽金雕養(yǎng)龜基地、東陽巍山養(yǎng)殖場(chǎng)、湖州菱湖龜鱉場(chǎng)、永康后項(xiàng)養(yǎng)龜場(chǎng)和永康下貴養(yǎng)龜場(chǎng)6家養(yǎng)殖場(chǎng)的養(yǎng)殖群體以及杭州清涼峰國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)、磐安后閣村野外個(gè)體，共44個(gè)樣本（表1）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取

使用無菌拭子擦拭黃緣閉殼龜口部黏液，置于含有200 μL 0. 01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）的離心管中保存。采用上海生工Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA 抽提試劑盒提取基因組DNA，使用NanoDrop2000分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA純度和濃度，將合格樣品于冰箱中-20 ℃保存。

1. 2. 2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的黃緣閉殼龜線粒體全基因組序列（登錄號(hào)：EU708434. 1），采用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)其線粒體COI序列特異性引物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。引物序列為COI-F：5'-AGCCATCTTACCTGTGTTTT-3'，COI-R：5'-TTGCTCAAGTTTGGTGTAGT-3'。PCR 總反應(yīng)體系為25 μL，其中R Taq DNAPremix 10 μL，基因組DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共5個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測(cè)序。

1. 2. 3 數(shù)據(jù)分析

利用SeqMan軟件參照序列峰圖對(duì)所測(cè)黃緣閉殼龜COI序列進(jìn)行人工校正和修飾［16］。使用MEGA6. 0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)、堿基組成分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建單倍型聚類樹［17］，并計(jì)算群體間及單倍型間的遺傳距離。使用DnaSP 6軟件計(jì)算序列變異位點(diǎn)數(shù)，分析不同群體的單倍型數(shù)、群體單倍型多樣性（Hd）以及核苷酸多樣性（Pi ）等遺傳多樣性指數(shù)［18］，繪制核苷酸不配對(duì)分布曲線。通過Tajiam’s D 檢驗(yàn)和Fu’ FS中性檢驗(yàn)明確黃緣閉殼龜群體在歷史上是否發(fā)生群體擴(kuò)張。由Arlequin3. 11軟件計(jì)算群體遺傳分化指數(shù)（FST），使用Mantel檢驗(yàn)，自展重復(fù)1 000次，對(duì)黃緣閉殼龜群體的遺傳距離與地理距離之間的相關(guān)性進(jìn)行分析［19］，并基于分子方差分析（AMOVA）分析群體間的遺傳變異［20］。采用Network 5. 0（Rohl 2003）軟件基于中間連接法建立單倍型網(wǎng)絡(luò)圖［21］，以描述單倍型序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及地理關(guān)系。

2 結(jié)果

2. 1 線粒體COI基因序列的堿基組成及變異特征

對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行比對(duì)，獲得黃緣閉殼龜線粒體COI基因序列的長度為1 040 bp，基因序列堿基A、T、C、G的平均含量分別為27. 4%、30. 5%、24. 6%和17. 5%，A+T的平均含量為57. 9%，C+G的平均含量為42. 1%，表現(xiàn)出AT偏倚性。在44只黃緣閉殼龜個(gè)體線粒體COI序列中，共檢測(cè)到保守位點(diǎn)1 004個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)13個(gè)，單一信息位點(diǎn)4個(gè)，簡約信息位點(diǎn)9個(gè)。

2. 2 黃緣閉殼龜群體遺傳多樣性

基于線粒體COI 基因序列共定義了9 個(gè)單倍型，8 個(gè)黃緣閉殼龜群體的單倍型多樣性（Hd）為（0. 429 00±0. 169 00）～（1. 000 00±0. 500 00），核苷酸多樣性為（0. 000 42±0. 000 16）～（0. 004 25±0. 001 21）。其中，YS 群體的核苷酸多樣性最高（0. 004 25±0. 001 21），DY1群體、HUZ群體和YW群體的單倍型多樣性較高，分別為（1. 000 00±0. 500 00）、（1. 000 00±0. 096 00）和（1. 000 00±0. 126 00）（表2）。

2. 3 黃緣閉殼龜群體間的遺傳距離和遺傳分化

遺傳距離分析可知，基于線粒體COI基因序列，兩兩群體間的遺傳距離為0～0. 003，其中YW、YS群體與其他群體間的遺傳距離較遠(yuǎn)（0. 002～0. 003）。8個(gè)群體內(nèi)的遺傳距離為0～0. 004，HZ 和YK2群體內(nèi)遺傳距離最小，YS 群體內(nèi)遺傳距離最大，達(dá)到0. 004（表3）。

FST 分析結(jié)果顯示，兩兩群體間的FST 值在-0. 347 52～0. 822 22，DY1 與YK2 之間的遺傳分化指數(shù)最大，為0. 822 22；其次為HUZ 群體與YK2 群體，遺傳分化指數(shù)為0. 615 56，處于較高遺傳分化水平。DY1 和YK1 群體間的遺傳分化指數(shù)最小，為-0. 347 52，表明兩個(gè)群體間的遺傳分化較弱（表3）。同時(shí)，Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示，浙江省內(nèi)不同黃緣閉殼龜群體間的遺傳距離與地理距離之間沒有顯著的相關(guān)性（R=0. 293 8，p=0. 134），表明黃緣閉殼龜種群的遺傳分化受地理因素的影響不顯著。

利用分子方差分析和遺傳分化系數(shù)對(duì)8個(gè)群體間的遺傳變異和遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析?；贑OI基因序列，群體間的分子變異率為14. 94%，群體內(nèi)的分子變異率為85. 06%，分子變異主要發(fā)生在群體內(nèi)部。群體總體遺傳分化系數(shù)為0. 149 39（pgt;0. 05），總體分子變異處于中等水平（表4）。

2. 4 黃緣閉殼龜群體間單倍型組成和分布

對(duì)9 個(gè)單倍型進(jìn)行分析，構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)（圖1）。在定義的9個(gè)單倍型中，共有5個(gè)共享單倍型，4個(gè)特有單倍型。共享單倍型分別為Hap1（在DY1和YW 群體中共享）、Hap2（在YW、YS、HUZ和YK1群體中共享）、Hap3（在YW、DY2、YS、HZ和YK2群體中共享）、Hap4（在DY1、DY2、HZ、HUZ和YK1群體中共享）和Hap8（在YS和YK1群體中共享），其余4個(gè)單倍型在不同群體中獨(dú)有，Hap5和Hap9為YS群體獨(dú)有，Hap6和Hap7為HUZ群體獨(dú)有。

2. 5 黃緣閉殼龜群體單倍型系統(tǒng)發(fā)育

基于線粒體COI基因序列的9個(gè)單倍型，以三線閉殼龜（C. trifasciata）和潘氏閉殼龜（C. pani）為外群，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，8個(gè)黃緣閉殼龜群體單倍型整體分為兩個(gè)大分支，其中，Hap1、Hap5、Hap8 和Hap7 與黃緣閉殼龜（C. flavomarginata，KJ680321）線粒體基因組中的COI 基因聚為一支；Hap3、Hap9、Hap6 與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的黃緣閉殼龜（C. flavomarginata，EU708434. 1）線粒體基因聚為一支（圖2）。不同群體的單倍型混雜分布，并未呈現(xiàn)一定的地理規(guī)律。8 個(gè)群體的單倍型遺傳距離為0. 001～0. 011，其中Hap5和Hap9之間的遺傳距離最大，為0. 011（表5）。

2. 6 黃緣閉殼龜種群歷史動(dòng)態(tài)

所有黃緣閉殼龜?shù)乩砣后w的中性檢驗(yàn)（Tajiam’sD 和Fu’ FS）結(jié)果見表6。Tajiam’s D 檢測(cè)中，除DY1、DY2和HZ群體外，其余群體的檢測(cè)結(jié)果均為負(fù)值（pgt;0. 10），且并未檢測(cè)到種群擴(kuò)張（pgt;0. 05）；Fu’ FS檢測(cè)中，除DY1、DY2、YK1和HZ群體外，其余群體檢測(cè)結(jié)果均為負(fù)值（pgt;0. 05）。核酸不匹配分布圖（圖3）顯示，基于COI基因，8個(gè)浙江省內(nèi)黃緣閉殼龜群體的錯(cuò)配分布曲線除DY1、DY2和YK2外，均未呈現(xiàn)明顯的單峰模式，與中性檢驗(yàn)結(jié)果大致吻合，表明檢驗(yàn)結(jié)果偏離了中性模式，但并不顯著（pgt;0. 05）?？傮w上說，黃緣閉殼龜群體在歷史上比較穩(wěn)定，均未經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。

3 討論

3. 1 黃緣閉殼龜線粒體DNA COI序列組成

本研究基于線粒體COI 序列對(duì)浙江省8個(gè)黃緣閉殼龜群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析。在44條序列堿基組成中，A+T堿基含量為57. 9%，G+C堿基含量為42. 1%，表現(xiàn)出明顯的AT堿基偏倚性，結(jié)果與王玨［22］和張艷云等［10］的研究相似，而這也與大部分脊椎動(dòng)物線粒體基因的編碼模式［23］一致。經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)，黃緣閉殼龜線粒體基因中的A、T、C、G分布呈現(xiàn)不均一性，并且具有高含量A+T堿基的線粒體基因，這也使得黃緣閉殼龜在進(jìn)化中更具有優(yōu)勢(shì)［24］。

3. 2 黃緣閉殼龜群體遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是物種進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境變化的基礎(chǔ)，遺傳多樣性水平越高，種群對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，種群則會(huì)有更好的發(fā)展［25?26］。線粒體DNA的核苷酸多樣性和單倍型多樣性是衡量群體遺傳多樣性和遺傳分化的重要指標(biāo)［27］，共同影響著種群進(jìn)化歷史。通過Grant等［28］的研究可知，Hd和Pi的臨界值分別為0. 5和0. 005，數(shù)值越大，表明一個(gè)群體的遺傳多樣性水平越高，同時(shí)，平均核苷酸差異數(shù)（K）越大，遺傳多樣性也越豐富［29］。本研究中，8個(gè)群體的平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為（0. 799 00±0. 210 00）和（0. 002 09±0. 001 47），表明8個(gè)群體的遺傳多樣性水平處于中等。YS群體的Hd和Pi分別為（0. 833 00±0. 127 00）和（0. 004 25±0. 001 21），在所有群體中K 值最大，為4. 388 89；其次為YW群體，其Hd和Pi分別為（1. 000 00±0. 126 00）和（0. 003 85±0. 001 37），K 值為4. 000 00。由此可知，YS 群體的遺傳變異程度和遺傳多樣性水平在黃緣閉殼龜群體中最高，YW群體次之。根據(jù)Grant等［28］提出的關(guān)于單倍型多樣性和核苷酸多樣性的4種模式可知，本研究中的HZ群體的Hd為（0. 429 00±0. 169 00），Pi為（0. 000 42±0. 000 16），屬于低Hd低Pi模式，由此可推知，在HZ群體中可能發(fā)生了瓶頸效應(yīng)或奠基者事件。除HZ群體，本研究的其余群體均屬于高Hd低Pi模式，但在此7 個(gè)群體中，均未呈現(xiàn)明顯的種群擴(kuò)張，意味著7個(gè)群體目前極有可能均處于瓶頸期。

3. 3 黃緣閉殼龜群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于線粒體DNA COI 基因序列分析了浙江省內(nèi)黃緣閉殼龜群體間的遺傳距離和遺傳分化。遺傳距離在一定程度上影響著種群的遺傳分化程度，遺傳距離大，彼此親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳分化程度就高［30］。本研究中的8個(gè)黃緣閉殼龜群體中，群體間遺傳距離為0～0. 003，而群體內(nèi)的遺傳距離為0～0. 004，此結(jié)果意味著在不同的黃緣閉殼龜群體內(nèi)部或已出現(xiàn)種的分化。其中，YS群體內(nèi)部的遺傳距離最大，為0. 004，推測(cè)在YS黃緣閉殼龜群體內(nèi)已經(jīng)分化出黃緣閉殼龜浙江種。遺傳分化系數(shù)FST作為群體遺傳分化程度的重要衡量指標(biāo)，在群體遺傳學(xué)中起到極為重要的作用，F(xiàn)ST 可表示群體間分化程度［31］，以0. 05、0. 15 作為分化程度的標(biāo)準(zhǔn)，本研究中的AMOVA分析結(jié)果表明，8個(gè)黃緣閉殼龜群體間的FST為0. 149 39，小于0. 150 00，為中等水平的遺傳分化；群體間變異僅占14. 94%，而群體內(nèi)變異為85. 06%，即黃緣閉殼龜遺傳變異主要來源于群體內(nèi)部。此外，本研究中的8個(gè)黃緣閉殼龜群體的FST指數(shù)為-0. 347 52～0. 822 22，其中YS群體與HUZ群體間存在較大遺傳分化（FST=0. 168 78），與HZ 群體（FST=0. 062 40）和YK2群體（FST=0. 005 41）間遺傳分化較小，同時(shí)該群體與其他4個(gè)群體的FST值均小于0，表明YS群體內(nèi)部個(gè)體間的遺傳分化大于與其他群體間的遺傳分化。

單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，8個(gè)黃緣閉殼龜群體并沒有明顯的地理聚群和譜系結(jié)構(gòu)，推測(cè)各群體內(nèi)部存在廣泛的基因交流，沒有形成明顯的種群遺傳結(jié)構(gòu)。基于樣本構(gòu)建的NJ單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）和單倍型遺傳距離（表5）顯示，安徽黃緣閉殼龜（GenBank登錄號(hào)：EU708434. 1）與臺(tái)灣黃緣閉殼龜（GenBank 登錄號(hào)：KJ680321）之間的單倍型遺傳距離為0. 001，這與2014年潘冬冬［32］的研究結(jié)果一致，同時(shí)根據(jù)該研究可知，雖然兩者之間在遺傳距離上并未產(chǎn)生顯著分化，但在形態(tài)上已有顯著差異，因此，極小的遺傳距離可明確區(qū)分安徽黃緣閉殼龜與臺(tái)灣黃緣閉殼龜。通過對(duì)黃緣閉殼龜種群進(jìn)行Mantel 相關(guān)性檢驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)其R 值小于0. 700 0（pgt;0. 05），說明黃緣閉殼龜種群間的遺傳分化并未有顯著的地理隔離效應(yīng)［33］。

在本研究中，Hap1 與Hap5、Hap1 與Hap8 之間的單倍型遺傳距離均小于0. 002，表明這3個(gè)單倍型個(gè)體間親緣關(guān)系較近；Hap1、Hap5、Hap8與Hap7、臺(tái)灣黃緣閉殼龜（KJ680321）聚為一支，而Hap7與臺(tái)灣黃緣閉殼龜單倍型間的遺傳距離小且僅為0. 001，即二者親緣關(guān)系較近，由此推測(cè)具有Hap1、Hap5 和Hap8這3個(gè)單倍型之一的黃緣閉殼龜為臺(tái)灣黃緣閉殼龜種群。Hap6與安徽黃緣閉殼龜（EU708434. 1）聚為一支，且二者之間的單倍型遺傳距離為0. 001，即享有該單倍型的個(gè)體在很大程度上是來自安徽本地的黃緣閉殼龜。Hap9為YS群體的獨(dú)有單倍型，且被YS群體中的1只個(gè)體獨(dú)享，Hap9與Hap1、Hap5的單倍型遺傳距離分別為0. 010、0. 011，同時(shí)，Hap9與安徽黃緣閉殼龜和臺(tái)灣黃緣閉殼龜之間的單倍型遺傳距離分別為0. 003和0. 004，均大于安徽黃緣閉殼龜與臺(tái)灣黃緣閉殼龜之間的單倍型遺傳距離，雖未達(dá)到根井正利［34］所得出的亞種之間的遺傳距離（0. 02～0. 20），但Hap9并未與其他單倍型聚為一支，且與其他單倍型的距離均較遠(yuǎn)，推測(cè)獨(dú)享單倍型Hap9 的YS 黃緣閉殼龜為黃緣閉殼龜浙江種。此外，Hap3與Hap9聚為一小支，二者之間的遺傳距離為0. 002，且Hap3與Hap1、Hap5的遺傳距離分別為0. 008、0. 009，由此表明單倍型為Hap3的黃緣閉殼龜群體可能為安徽黃緣閉殼龜與浙江黃緣閉殼龜?shù)碾s交種。

3. 4 黃緣閉殼龜種群動(dòng)態(tài)分析

核苷酸配對(duì)差異分析及中性檢驗(yàn)是研究種群歷史動(dòng)態(tài)的有效檢驗(yàn)方法［35］，可通過Tajima’ D 和Fu’sFS檢驗(yàn)檢測(cè)群體是否發(fā)生擴(kuò)張，若檢測(cè)結(jié)果為顯著負(fù)值且核苷酸錯(cuò)配分布曲線呈單峰時(shí)，表明群體發(fā)生過擴(kuò)張；若為雙峰或多峰時(shí)，則表明群體一直保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，未經(jīng)歷過擴(kuò)張［26］。本研究基于COI序列的分析結(jié)果顯示，黃緣閉殼龜8個(gè)群體中有5個(gè)群體的Tajima’ D 和4個(gè)群體的Fu’s FS為負(fù)值，但沒有顯著性差異（pgt;0. 05），同時(shí)，除DY1、DY2和YK2外，核苷酸錯(cuò)配分布圖顯示均為雙峰或多峰形，DY2和HZ均為正值，DY1的Tajima’ D 和Fu’s FS均為0，上述研究結(jié)果表明，浙江省內(nèi)8個(gè)黃緣閉殼龜群體沒有經(jīng)歷過擴(kuò)張，而是保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

3. 5 黃緣閉殼龜種質(zhì)資源保護(hù)

黃緣閉殼龜具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來被大肆捕殺，導(dǎo)致野生種群數(shù)量急劇下降，黃斌等［36］的研究結(jié)果顯示，安徽省境內(nèi)的野生黃緣閉殼龜分布面積日漸縮小，只在安徽大別山區(qū)存在少量野生個(gè)體。此外，由于黃緣閉殼龜繁殖力較低，同時(shí)對(duì)繁殖產(chǎn)卵的環(huán)境要求極高，隨著山區(qū)旅游業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，導(dǎo)致黃緣閉殼龜沒有合適的繁衍環(huán)境，從根源上減少了野生黃緣閉殼龜?shù)臄?shù)量。目前，河南信陽已于2005年建立了黃緣閉殼龜救護(hù)中心，安徽省的黃緣閉殼龜繁育也已經(jīng)形成較為成熟的生態(tài)技術(shù)模式［32］。在本研究中，針對(duì)浙江省部分養(yǎng)殖場(chǎng)的黃緣閉殼龜群體和野生群體進(jìn)行了遺傳多樣性調(diào)查，結(jié)果顯示，黃緣閉殼龜整體遺傳多樣性較高，但部分群體遺傳多樣性仍舊較低，應(yīng)更大力度加強(qiáng)對(duì)野生黃緣閉殼龜?shù)谋Ｗo(hù)。由于分布在不同地區(qū)的黃緣閉殼龜存在差異，所以應(yīng)對(duì)不同地區(qū)的黃緣閉殼龜劃分保護(hù)單元，防止種質(zhì)混雜，對(duì)于野生黃緣閉殼龜可以進(jìn)行棲息地保護(hù)，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行合理利用，為黃緣閉殼龜?shù)酿B(yǎng)殖及人工繁育提供理論指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 張方， 周婷， 黃成. 安徽黃緣閉殼龜（Cuora flavomarginata）野生種群的現(xiàn)狀及其保護(hù)建議［J］. 生物學(xué)雜志， 2014， 31（2）：87-89.

ZHANG F， ZHOU T， HUANG C. The current status and protec?tive measures on the wild yellow-margined box turtles in AnhuiProvince， China［J］. Journal of Biology， 2014， 31（2）： 87-89.

［2］ Asian Turtle Trade Working Group. Cuora flavomarginata［J/OL］.［2024-01-21］. The IUCN red list of threatened species， 2000： e.T5960A97359069. http：//dx. doi. org/10. 2305/IUCN. UK. 2000.RLTS. T5960A11965283. en

［3］ 國家林業(yè)局瀕危物種進(jìn)出口管理辦公室. 瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約附錄Ⅰ、附錄Ⅱ和附錄Ⅲ［EB/OL］. （2023-02-23）［2023-07-17］. http：//www. cites. org. cn/citesgy/fl/202302/t20230227_734178. html.

Office of Endangered Species Management. Convention on inter?national trade in endangered species of wild fauna and flora appen?dices Ⅰ ， Ⅱ and Ⅲ［EB/OL］. （2023-02-23）［2023-07-17］.http：//www. cites. org. cn/citesgy/fl/202302/t20230227_734178.html.

［4］ 生態(tài)環(huán)境部， 中國科學(xué)院. 中國生物多樣性紅色名錄： 脊椎動(dòng)物卷（2020）［EB/OL］.［2024-01-21］. https：//www. mee. gov.cn/xxgk2018/xxgk/xxgk01/202305/t20230522_1030745. html.

Ministry of Ecology and Environment， Chinese Academy of Sci?ences. China’s red list of biodiversity： vertebrates（2002）［EB/OL］.［2024-01-21］. https：//www. mee. gov. cn/xxgk2018/xxgk/xxgk01/202305/t20230522_1030745. html.

［5］ 浙江省林業(yè)局. 浙江省重點(diǎn)保護(hù)陸生野生動(dòng)物名錄［EB/OL］.［2023-07-17］. http：//lyj. zj. gov. cn/art/2016/3/2/art_1275952_4795065. html.

Zhejiang Forestry Department. Zhejiang Province terrestrial wild?life conservation list［EB/OL］.［2023-07-17］. http：//lyj. zj. gov.cn/art/2016/3/2/art_1275952_4795065. html.

［6］ 黃勇. 黃緣閉殼龜繁殖孵化的研究［J］. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，2020，41（10）：38-40.

HUANG Y. Study on breeding and hatching of Cuora flavomar?ginata［J］. Journal of Aquaculture， 2020， 41（10）： 38-40.

［7］ 王立. 黃緣閉殼龜生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)探究［J］. 農(nóng)家參謀， 2018（5）： 107.

WANG L. Study on ecological culture technology of Cuora flavo?marginata［J］. The Farmers Consultant， 2018（5）： 107.

［8］ 楊貴強(qiáng)， 李文通， 林泉， 等. 黃緣閉殼龜主要形態(tài)性狀與體質(zhì)量的關(guān)系［J］. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 33（6）： 760-768.

YANG G Q， LI W T， LIN Q， et al. Relationship between mainmorphometrics and body weight of Chinese box turtle Cuora""flavo?marginata with different ages［J］. Journal of Dalian Ocean Univer?sity， 2018， 33（6）： 760-768.

［9］ 張坤. 基于DNA分子標(biāo)記的黃緣閉殼龜遺傳多樣性與種群遺傳結(jié)構(gòu)研究［D］. 信陽： 信陽師范學(xué)院， 2017.

ZHANG K. Genetic diversity and population genetic structure ofCuora flavomarginata based on DNA molecular markers［D］. Xin?yang： Xinyang Normal University， 2017.

［10］ 張艷云， 畢婷婷， 宋嬌蓮， 等. 基于線粒體Cyt b 基因的全長序列探討閉殼龜類的系統(tǒng)進(jìn)化［J］. 生物學(xué)雜志， 2011， 28（1）： 22-26； 45.

ZHANG Y Y， BI T T， SONG J L， et al. Phylogenetic evolutionof hinged turtles in China based on the complete mitochondrialcytochrome b gene sequences［J］. Journal of Biology， 2011， 28（1）： 22-26； 45.

［11］ 鄭將臣， 萬全， 程起群， 等. 基于16S rRNA序列探討龜鱉類的遺傳分化和系統(tǒng)發(fā)生［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2011， 37（2）： 199-205.

ZHENG J C， WAN Q， CHENG Q Q， et al. Genetic divergenceand phylogeny of turtles inferred from mitochondrial DNA 16SrRNA sequence［J］. Journal of Hunan Agricultural University（Natural Sciences）， 2011， 37（2）： 199-205.

［12］ 荊勝利， 張坤， 黃小燕， 等. 黃緣閉殼龜微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)及遺傳多樣性分析［J］. 信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2018， 31（4）： 555-561.

JING S L， ZHANG K， HUANG X Y， et al. Isolation and ge?netic diversity of microsatellite molecular markers in the yellowmarginedbox turtle （Cuora flavomarginata）［J］. Journal of Xin?yang Normal University （Natural Science Edition）， 2018， 31（4）： 555-561.

［13］ 郭旭升， 黃斌， 趙良杰， 等. 河南信陽黃緣閉殼龜省級(jí)自然保護(hù)區(qū)黃緣閉殼龜種群現(xiàn)狀調(diào)查［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2017，38（2）： 280-284.

GUO X S， HUANG B， ZHAO L J， et al. Population status ofyellow-margined box turtle（Cuora flavomarginata） in XinyangProvincial Nature Reserve， Henan［J］. Chinese Journal of Wild?life， 2017， 38（2）： 280-284.

［14］ 潘冬冬， 萬全， 沈保平， 等. 安徽省黃緣盒龜資源現(xiàn)狀及馴養(yǎng)繁育調(diào)查［J］. 野生動(dòng)物， 2013， 34（6）： 349-354.

PAN D D， WAN Q， SHEN B P， et al. Investigation on the sta?tus of resources， domestication and reproduction of yellowmarginedbox turtle in Anhui Province［J］. Chinese Journal ofWildlife， 2013， 34（6）： 349-354.

［15］ 董傳舉， 孔勝楠， 王蓉， 等. 黃緣閉殼龜生物學(xué)特性及種群分類研究進(jìn)展［J］. 河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2017，45（4）： 87-91.

DONG C J， KONG S N， WANG R， et al. Research progressesof biological property and population classification of yellowmarginedbox turtle （Cuora flavomarginata）［J］. Journal ofHenan Normal University （Natural Science Edition）， 2017， 45（4）： 87-91.

［16］ 費(fèi)瀟鳴. 義烏小鯢種群資源調(diào)查、胚胎發(fā)育及遺傳多樣性研究［D］. 金華： 浙江師范大學(xué)， 2020.

FEI X M. Hynobius yiwuenisis population resources investiga?tion， embryonic development and genetic diversity research［D］.Jinhua： Zhejiang Normal University， 2020.

［17］ 高嘉昕， 俞丹， 劉煥章. 基于Cyt b 基因的長江中上游大鱗馬口魚遺傳多樣性及譜系生物地理學(xué)過程分析［J］. 四川動(dòng)物，2021， 40（4）： 361-373.

GAO J X， YU D， LIU H Z. Genetic diversity and phylogeogra?phy of Opsariichthys macrolepis from the upper and middle Yang?tze River based on cytochrome b sequences［J］. Sichuan Journalof Zoology， 2021， 40（4）： 361-373.

［18］ 趙良杰. 大眼華鳊遺傳多樣性和親緣地理學(xué)研究［D］. 上海：上海海洋大學(xué)， 2012.

ZHAO L J. Genetic diversity and phylogeographical pattern ofSinibrama macrops［D］. Shanghai： Shanghai Ocean University，2012.

［19］ EXCOFFIER L， LISCHER H E L. Arlequin suite ver 3. 5： anew series of programs to perform population genetics analysesunder Linux and Windows［J］. Molecular Ecology Resources，2010， 10（ 3）： 564-567.

［20］ 陳佳琪， 李潮， 張?chǎng)┚?等. 海南島寬額鱧（Channa gachua）群體遺傳變異與生物地理過程［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2019， 39（7）：2591-2602.

CHEN J Q， LI C， ZHANG W J， et al. Genetic variation andphylogeography of Channa gachua in Hainan Island［J］. ActaEcologica Sinica， 2019， 39（7）： 2591-2602.

［21］ 任永麗. 基于SSR標(biāo)記及mt DNA序列的塔里木裂腹魚群體遺傳多樣性分析［D］. 阿拉爾： 塔里木大學(xué)， 2020.

REN Y L. Genetic diversity of Schizothorax biddulphi based onSSR markers and mt DNA sequences［D］. Ala’er： Tarim Univer?sity， 2020.

［22］ 王玨. 基于線粒體基因組全序列的陸龜科分子系統(tǒng)學(xué)研究［D］. 蕪湖： 安徽師范大學(xué)， 2014.

WANG J. Molecular phylogenetic research for Testudinidaebased on the mtDNA complete sequence［D］. Wuhu： Anhui Nor?mal University， 2014.

［23］ MAYFIELD J E， MCKENNA J F. A-T rich sequences in verte?brate DNA. A possible explanation of q-banding in metaphasechromosomes［J］. Chromosoma， 1978， 67（2）： 157-163.

［24］ FOLMER O， BLACK M， HOEH W， et al. DNA primers for am?plification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I fromdiverse metazoan invertebrates［J］. Molecular Marine Biologyand Biotechnology， 1994， 3（5）： 294-299.

［25］ MEYER A. Evolution of mitochondrial DNA in fishes［J］. Bio?chemistry and Molecular Biology of Fishes， 1993， 2： 1-38.

［26］ 趙文浩， 易少奎， 蘇君曉， 等. 新疆塔里木河葉爾羌高原鰍遺傳多樣性研究［J］. 水生生物學(xué)報(bào)， 2022， 46（3）： 364-374.

ZHAO W H， YI S K， SU J X， et al. Genetic diversity of Triplo?physa yarkandensis populations in Tarim River Basin in Xinjiang［J］. Acta Hydrobiologica Sinica， 2022， 46（3）： 364-374.

［27］ 閆華超， 高嵐， 付崇羅， 等. 魚類遺傳多樣性研究的分子學(xué)方法及應(yīng)用進(jìn)展［J］. 水產(chǎn)科學(xué)， 2004， 23（12）： 44-48.

YAN H C， GAO L， FU C L， et al. Molecular methods and ad?vances on genetic diversity evaluation in fish［J］. Fisheries Sci?ence， 2004， 23（12）： 44-48.

［28］ GRANT W， BOWEN B. Shallow population histories in deepevolutionary lineages of marine fishes： insights from sardines andanchovies and lessons for conservation［J］. Journal of Heredity，1998， 89（5）： 415-426.

［29］ 李芬， 陳綺萍， 何佩瑩， 等. 北江大刺鰍（Mastacembelus ar?matus）的核型分析及線粒體Cyt b 基因和D-loop的遺傳多樣性［J］. 海洋與湖沼， 2019， 50（2）： 449-454．

LI F， CHEN Q P， HE P Y， et al. The karyotype pattern and ge?netic diversity of mitochondrial DNA Cyt b gene and D-loop se?quence in Mastacembelus armtus Beijiang River， south China［J］. Oceanologia et Limnologia Sinica， 2019， 50 （2） ：449-454．

［30］ 紀(jì)達(dá)， 許勁松， 姚俊杰， 等. 貴州省5個(gè)金背鯉（Cyprinus car?pio var. jinbei）地理種群的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志， 2022， 35（5）： 8-17.

JI D， XU J S， YAO J J， et al. Genetic diversity and geneticstructure analysis of five geographical populations of Jinbei com?mon carp （Cyprinus carpio var. jinbei） in Guizhou Province［J］.Chinese Journal of Fisheries， 2022， 35（5）： 8-17.

［31］ ARIS-BROSOU S， EXCOFFIER L. The impact of population ex?pansion and mutation rate heterogeneity on DNA sequence poly?morphism［J］. Molecular Biology and Evolution， 1996， 13（3）：494-504.

［32］ 潘冬冬. 安徽黃緣盒龜資源現(xiàn)狀調(diào)查、馴養(yǎng)繁育技術(shù)及線粒體DNA比較研究［D］. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

PAN D D. Research in wildlife resources， breeding technologyand comparative study of the complete mitochondrial genome ofCistoclemmys flavomarginata［D］. Hefei： Anhui AgriculturalUniversity， 2014.

［33］ DIXON P. VEGAN， a package of R functions for communityecology［J］. Journal of Vegetation Science， 2003， 14（6）：927-930.

［34］ 根井正利. 分子群體遺傳學(xué)與進(jìn)化論［M］. 王家玉， 譯. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1983： 169-201.

MASATOSHI N. Molecular population genetics and evolution［M］. WANG J Y， trans. Beijing： Agriculture Press， 1983：169-201.

［35］ 任永麗， 代金彩， 趙年樺， 等. 基于線粒體COII 和ND4 基因序列的塔里木裂腹魚群體遺傳多樣性分析［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2022， 46（12）： 2274-2285.

REN Y L， DAI J C， ZHAO N H， et al. Genetic diversity analy?sis of Schizothorax biddulphi based on mitochondrial DNA COIIand ND4 genes［J］. Journal of Fisheries of China， 2022， 46（12）： 2274-2285.

［36］ 黃斌， 方宇森， 張麗. 野生黃緣閉殼龜資源分布與瀕危機(jī)制研究［J］. 信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 32（1）：74-81.

HUANG B， FANG Y S， ZHANG L. Study on the resource distri?bution and endangered mechanism of wild Cuora flavomarginata［J］. Journal of Xinyang Normal University （Natural Science Edi?tion）， 2019， 32（1）： 74-81.

基金項(xiàng)目：浙江省省級(jí)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021C02044）