摘 要 通過臨床癥狀、尸體剖檢、組織病理學、毒素實驗和細菌分離鑒定的方法確診了1例由A型產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的赤大袋鼠（Macropus rufus）梭菌性腸炎的自然病例。動物園1只成年赤大袋鼠突然精神沉郁、厭食，于20 h后死亡，尸體角弓反張，腹圍膨大。尸體剖檢和組織學檢查表明：胃腸道、肝臟和腎臟出現(xiàn)具有梭菌性腸炎證病意義的病變。小白鼠毒素實驗結果顯示，血樣腸內容物內有急性致死性毒素。從出血的腸黏膜面分離到單一、有芽孢、粗大的革蘭陽性桿菌，經產氣莢膜梭菌毒素基因型多重PCR鑒定為A型產氣莢膜梭菌。研究結果可為赤大袋鼠梭菌性腸炎的診斷和防控提供依據(jù)。

關鍵詞：赤大袋鼠；梭菌性腸炎；出血性壞死性胃腸炎；A型產氣莢膜梭菌

中圖分類號：S858. 9 文獻標識碼：A 文章編號：2310 - 1490（2024）- 02 - 0403 - 06

DOI：10.12375/ysdwxb.20240220

梭菌性腸炎也叫魏氏梭菌病，是由產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的人和動物多發(fā)的腸道疾病，本病以急性、致死性和出血性腸炎為主要特征。產氣莢膜梭菌過度生長，伴隨著細菌外毒素的釋放，導致感染動物胃或腸黏膜嚴重出血和壞死［1］。動物的梭菌性腸炎常見于牛［2］、馬鹿（Cervus ca?nadensis）［3］、野牦牛（Bos mutus）［4］、鹿（Cervidae）［5］和羊駝（Vicugna pacos）［6］等反芻動物，也有豬［7］、家兔［8］和馬［9］等發(fā)生此病的報道。產氣莢膜梭菌分泌的毒素有20多種，單一菌株產生特定毒素，根據(jù)菌株攜帶毒素的情況將其分為7 個基因型：A 型（α）、B 型（α、β、ε）、C型（α、β、+/-cpe）、D型（α、ε、+/-cpe）、E型（α、? 、+/-cpe）、F型（α、cpe）和G型（α、netB）［10］。

赤大袋鼠（Macropus rufus）屬有袋目（Marsupia?lia）袋鼠科（Macropodidae），產于澳大利亞，是袋鼠科中體型最大的一種［11］，以群居活動為主，生活于草原地帶，以各種草類、野菜等為食［12］。目前，在國內外還未見赤大袋鼠梭菌性腸炎病例的報道。本研究通過多種方法確診了1例赤大袋鼠梭菌性腸炎的死亡病例，為該類疾病的診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 實驗動物

1只病死老年赤大袋鼠，由大青山野生動物園提供。6只6周齡昆明種小白鼠（SPF級），購于斯貝福（北京）生物技術有限公司。

1. 1. 2 產氣莢膜梭菌5種毒素基因特異性引物

選取產氣莢膜梭菌陽性菌株，根據(jù)已有文獻［13?14］設計α、β、ε、? 四種毒素基因引物，引物信息見表1。

1. 2 方法

1. 2. 1 尸體剖檢

對病死赤大袋鼠進行尸體剖檢，觀察和記錄大體病變。剖檢過程中分別取心、肝、脾、肺和腎等全身各組織器官（1. 5 cm×1. 0 cm×1. 0 cm），放入10%福爾馬林溶液中固定。

1. 2. 2 病理組織切片制備和觀察

對固定24 h的組織進行修塊、脫水、透明、石蠟包埋、切片（厚度為3 μm）、蘇木素-伊紅染色（HE）、封片和烤片，并在顯微鏡下觀察。

1. 2. 3 小白鼠毒素實驗

取空腸血樣內容物3 mL，加2倍生理鹽水稀釋后，3 000 r/min離心5 min，取上清液，均勻分成2份，1份60 ℃加熱30 min，1份不加熱。取6只小白鼠隨機分為2組，3只/組。2份上清液分別腹腔注射于一組小白鼠，1. 2 mL/只，觀察結果至接種后24 h。

1. 2. 4 細菌分離和鑒定

1. 2. 4. 1 細菌分離

用接種環(huán)無菌挑取赤大袋鼠出血的腸黏膜組織，接種于硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（FTG）內，37 ℃厭氧培養(yǎng)6～8 h，取培養(yǎng)物接種于梭菌選擇性培養(yǎng)基（TSN培養(yǎng)基），37 ℃厭氧培養(yǎng)6～8 h，觀察菌落生長情況。挑取菌落制備涂片，革蘭染色，鏡檢。

1. 2. 4. 2 細菌毒素基因型多重PCR鑒定

取純培養(yǎng)的1～2個產氣莢膜梭菌菌落，置于100 μL蒸餾水中97 ℃煮沸10 min，10 000 r/min離心10 min。取上清液用于PCR 模板。PCR 反應體系：25 μL2×Taq Master Mix酶，引物上、下游各1 μL，DNA模板5 μL，補水至50 μL混勻后進行擴增。PCR 反應條件：95 ℃預變性 7 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃，30 min。PCR程序結束后在2%瓊脂糖凝膠上電泳，110 V 30 min結束后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

2 結果

2. 1 臨床病史

大青山野生動物園的1只成年雄性赤大袋鼠突然精神沉郁、厭食，于第2天清晨死亡，病程20 h。

2. 2 剖檢病變

病死赤大袋鼠尸體角弓反張，腹圍膨大（圖1），肛門周圍毛上附著少量污紅色稀便。血液呈黏稠的黑紅色，凝固不良。腹壁腹膜表面有彌漫性分布的出血斑點，胃漿膜面散在大小不等的出血點。脾臟表面分布大小不等的黑紅色輕度隆起病灶。腎臟嚴重淤血和水腫，呈暗紅色，切面髓質有散在和密集呈細線狀排列的灰色結晶樣物，腎乳頭部位結晶樣物密集。肝臟輕度淤血和水腫，呈暗紅色至黑紅色，表面局灶性病變（土黃色），膽囊明顯擴張。心肌色彩混濁無光，心臟橫徑明顯增寬，心肌質軟，右心室質軟、擴張明顯，左右心室內充滿黑紅色凝固不良的帶有氣泡的血液。肺臟呈粉紅色，回縮良好，膈葉表面散在或密集大小不等的出血斑點，肺泡性肺氣腫?？漳c后段漿膜面呈污黑紅色，腸系膜靜脈因嚴重淤血怒張，局部漿膜面散在大小不等的出血斑點?？漳c后段不同程度出血，腸黏膜表面散在或密布黑紅色出血斑點，嚴重區(qū)域腸腔內充有大量污濁的黑紅色血樣液體，腸黏膜彌漫性出血，表面粗糙呈黑紅色（圖2，圖3）。胃漿膜面及附近系膜出血呈黑紅色，胃底部黏膜增厚，因嚴重彌漫性出血呈大面積黑紅色（圖4）。

2. 3 組織病理學變化

嚴重出血性壞死性胃腸炎，胃和空腸黏膜層和局部黏膜下層彌漫出血和水腫（圖5），黏膜層上三分之二組織壞死，上皮細胞完全脫落，嚴重區(qū)域腸黏膜層全部壞死，黏膜下層淋巴濾泡嚴重出血和壞死（圖6）。肺輕度充血和水腫，肺泡腔內可見大量中性粒細胞和少量巨噬細胞，部分巨噬細胞出現(xiàn)“吞紅”現(xiàn)象。急性腎小球腎炎，腎臟水腫，腎小管上皮普遍腫脹，局部整個腎小管上皮發(fā)生明顯的透明變性。壞死性肝炎，肝臟淤血和水腫，肝細胞板上肝細胞排列松散，竇狀隙壁溶解，破壞明顯，肝細胞廣泛散在性壞死，出現(xiàn)大小不等的壞死灶，無炎性細胞浸潤，部分未壞死的肝細胞呈明顯微泡性脂肪變性。急性炎性脾腫，脾臟嚴重充血和出血，淋巴細胞數(shù)量稀少，白髓數(shù)量少，體積縮小，紅髓內淋巴細胞所剩無幾。其他組織器官不同程度的變質性變化。

2. 4 小白鼠毒素實驗

不加熱組小白鼠于接種后13～18 h全部死亡，加熱組小白鼠接種后24 h未見異常。實驗結果表明血樣腸內容物內有致死性毒素。

2. 5 細菌培養(yǎng)和鑒定

2. 5. 1 細菌培養(yǎng)

在TSN培養(yǎng)基上生長出大量黑色圓形小菌落，菌落涂片可見大量單一的革蘭陽性粗大桿菌（圖7）。

2. 5. 2 產氣莢膜梭菌毒素基因型多重PCR鑒定

產氣莢膜梭菌毒素基因型多重PCR 結果顯示（圖8），獲得475 bp長的α 毒素基因目的條帶，病原菌鑒定為A型產氣莢膜梭菌。

3 討論

本病例赤大袋鼠臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、厭食和排稀便，發(fā)病急，死亡快，尸體角弓反張。這些臨床癥狀和家兔［15］、犢牛［16］感染梭菌性腸炎的表現(xiàn)相似。梭菌性腸炎具有證病意義的病變是胃腸道嚴重出血性壞死性炎。本病例赤大袋鼠剖檢顯示其患嚴重的出血性壞死性胃腸炎，胃、空腸黏膜層和局部黏膜下層彌漫出血和水腫，黏膜層組織壞死，上皮細胞脫落，黏膜下層淋巴濾泡出血和壞死；腸腔內有大量污濁的黑紅色血樣液體，腸黏膜彌漫性出血，呈黑紅色。其他動物梭菌性腸炎也表現(xiàn)出相似的胃腸道出血性壞死性變化，如家兔梭菌性腸炎腸道腫脹充氣，致使腸壁變薄而透明，腸黏膜上有大量出血點，胃黏膜脫落，出現(xiàn)潰瘍灶［15］；犢牛梭菌性腸炎的空腸和回腸出現(xiàn)壞死性腸炎［16］。

梭菌性腸炎肝臟和腎臟的病變也具有證病意義。本病例赤大袋鼠腎臟嚴重淤血和水腫，急性腎小球腎炎，切面髓質、腎乳頭部位有結晶樣物密集，腎小管上皮發(fā)生明顯的透明變性。肝臟輕度淤血和水腫，出現(xiàn)壞死性肝炎。病死赤大袋鼠腎臟和肝臟的病變特征和家兔梭菌性腸炎病變［15］相似，患病家兔腎臟和肝臟均出現(xiàn)充血和腫大，并伴有肝細胞壞死。

本病例赤大袋鼠剖檢脾臟出現(xiàn)炎性脾腫，心臟出現(xiàn)心功能不全。這些病變與家兔發(fā)生的梭菌性腸炎病變相似，患病家兔脾臟腫大，為深褐色，心臟表面血管怒張，呈樹枝狀［15］。

本病例中產氣莢膜梭菌毒素基因型經多重PCR獲得了α 毒素基因目的條帶，病原菌判定為A型產氣莢膜梭菌。梭菌性腸炎的防控難度較大。Arturs?son等［17］報道產氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）可以突破腸道間的緊密連接，引起食源性疾病。A型產氣莢膜梭菌所產生的芽孢能夠長時間存在于外界環(huán)境中，對環(huán)境造成污染，并會隨動物飲食進入其消化系統(tǒng)。動物腸胃內益菌數(shù)量較多時，對梭菌腸炎病原體的抵抗能力就較強，不會發(fā)病。動物自身免疫力下降或者產生應激（長途運輸、幼畜斷奶或更換飼料）時，會導致消化系統(tǒng)功能紊亂、菌群失調，引起動物發(fā)?。凰拗髂挲g變大或者疾病等誘發(fā)因素也可引起梭菌性腸炎的發(fā)生［18］。本案例中，年齡偏大、自身免疫力下降可能是赤大袋鼠發(fā)病的主要原因。定期進行疫苗免疫或在飼草料中添加磺胺咪片等可以預防動物梭菌性腸炎的發(fā)生［19］。

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