摘 要：四甲基吡嗪是白酒中重要的風味物質，賦予了白酒的健康功效。采用稀釋涂布平板法從貴州高溫大曲中分離產四甲基吡嗪的細菌，通過菌落形態(tài)、顯微鏡觀察和分子生物學方法對其進行鑒定，并對其產酶特性、生長特性及耐受特性進行研究。結果表明：從貴州高溫大曲中篩選得到 1 株產四甲基吡嗪的菌株 FSDQ02，初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens，該菌能分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶；能在 30～40℃ 和 pH5～9 范圍內生長良好；對 6% 的乙醇和 14% 的 NaCl 具有耐受性。該研究結果分離得到的解淀粉芽孢桿菌 FSDQ02 在強化高溫大曲和白酒生產中具有較大的應用潛力。

關鍵詞：高溫大曲；四甲基吡嗪；生物學特性；解淀粉芽孢桿菌

中圖分類號：TS261.4

文獻標志碼：A

文章編號：0253?2301（2024）05?0010?06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.05.002

Identification and Biological Characteristics Analysis of a Tetramethylpyrazine-producing Bacterium from High-temperature Daqu

LAI Bao-ling1，HUANG Na-ting1，HUANG Yuan-long1，ZHANG Shou-cai2，HUANG Zu-xin1，LI Shan-ren1 ＊

（1. College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China;2. Huanghuashan Liquor-making Co. Ltd.， Jian’ou， Fujian 353100， China）

Abstract： Tetramethylpyrazine is an important flavor compound in liquor， which endows liquor with health efficacy.The bacteria that could produce tetramethylpyrazine were isolated from the high-temperature Daqu in Guizhou by using the dilution spread plate method， and were identified by using the methods such as colonial morphology，microscopic observation and molecular biology. Then， their enzyme production characteristics， growth characteristics and tolerance characteristics were studied. The results showed that one strain FSDQ02 producing tetramethylpyrazine was screened from the high-temperature Daqu in Guizhou， which was preliminarily identified as Bacillus amyloliquefaciens. The strain FSDQ02 could secrete protease， amylase and cellulase， and grow well in the range of30?40℃ and pH 5?9， with the tolerance to 6% ethanol and 14% NaCl. Bacillus amyloliquefaciens FSDQ02 isolated from the results of this study had great great application potential in strengthening the production of high-temperature Daqu and liquor.

Key words： High-temperature Daqu；Tetramethylpyrazine；Biological characteristics；Bacillus amyloliquefaciens

醬香型白酒是中國傳統(tǒng)白酒的代表，具有醬香突出、幽雅細膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香持久等特點，受到白酒消費者的歡迎[1?3]。高溫大曲是醬香型白酒生產中重要的糖化劑和生香劑，含有大量微生物和水解酶，可以將原料中大分子物質如糖類和蛋白質等分解為小分子物質如葡萄糖和氨基酸等，為后期酒醅發(fā)酵提供豐富的底物和香味前體物質[4?6]。白酒釀造過程中，微生物的種類和數(shù)量直接關系到醬香型白酒的產量和品質[7]。通過人工添加有益的功能微生物制備強化大曲，有目的地改善發(fā)酵體系，可以提升大曲的發(fā)酵力和增加大曲中風味物質[8]。因此，從高溫大曲中分離功能性菌株應用于白酒生產中，對提高白酒的質量和品質具有重要意義。

四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，最早從中藥川芎中提取的一類吡嗪類化合物，是治療心腦血管疾病的有效成分。四甲基吡嗪也是醬香型白酒中重要的風味物質，具有令人愉悅的特殊烤肉和炒堅果香氣[9]。白酒中四甲基吡嗪主要由微生物代謝合成，首先經過糖降解途徑生成丙酮酸，兩分子丙酮酸縮合形成 α-乙酰乳酸，在α-乙酰乳酸脫羧酶的作用下脫羧生成 3-羥基-2-丁酮（又稱乙偶姻）；乙偶姻與銨離子通過非酶促反應生成 3-氨基-2-丁酮，隨后兩分子 3-氨基-2-丁酮脫水縮合生成 2，5-二氫四甲基吡嗪，最后再氧化生成四甲基吡嗪[10?12]。四甲基吡嗪作為醬香型白酒中特征風味物質和功能活性成分，近年來在白酒健康領域受到了廣泛關注。

國內很多酒企已經開展產四甲基吡嗪功能菌株的篩選分離、發(fā)酵條件優(yōu)化以及合成途徑改造等方法來提高白酒中四甲基吡嗪的含量，進而提升醬香型白酒的品質[13?16]。產四甲基吡嗪的微生物多為芽孢桿菌，尤其以枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌為主，但能開發(fā)利用的菌株仍然較少。由于芽孢桿菌種類繁多，高溫大曲中還有許多目前尚未被發(fā)現(xiàn)的微生物具有產四甲基吡嗪的能力。因此，本研究從貴州高溫大曲中篩選分離產四甲基吡嗪的微生物，通過菌落形態(tài)、顯微鏡觀察和分子生物學方法對其進行鑒定，并對其產酶特性、生長特性及耐受特性等進行研究，為四甲基吡嗪強化高溫大曲的制備提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料 曲樣：來源于貴州某酒廠高溫大曲。

1.1.2試劑 胰蛋白胨（生化試劑），賽默飛世爾科技公司；酵母提取物（生化試劑），賽默飛世爾科技公司；氯化鈉（分析純），生工生物工程（上海）股份有限公司；芽孢染色液，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNA 提取液（分析純），奧美嘉生物技術公司；瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；無水乙醇（分析純），天津市致遠化學試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉（分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；可溶性淀粉（分析純），成都市科隆化學品有限公司；剛果紅（分析純），天津市大茂化學試劑廠。

1.1.3培養(yǎng)基 （1）LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，去離子水 1 L，121℃ 滅菌 20 min。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，葡萄糖 5 g，氯化鈉 5 g，去離子水 1 L，115℃ 滅菌 20 min。（3）淀粉酶檢測培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，可溶性淀粉 5 g，去離子水 1 L，121℃ 高溫滅菌 20 min。（4）蛋白酶檢測培養(yǎng)基：胰蛋白 10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，瓊脂粉 15 g，去離子水 1 L，121℃ 高溫滅菌 20 min 后，使用前添加 5 mL 無菌脫脂牛奶。（5）纖維素酶檢測培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，羧甲基纖維素鈉 20 g，去離子水 1 L，121℃ 高溫滅菌 20 min。

1.2儀器設備

IS-RDV3 型恒溫搖床，蘇州捷美電子有限公司；IBI-250T 型生化培養(yǎng)箱，上海施都凱儀器設備有限公司；Veriti 96 型梯度 PCR 儀，賽默飛世爾科技有限公司；Tanon 3500 型凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；H1650R 型臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；光學顯微鏡，廣州儀景通光學科技有限公司；UV-8000 型紫外-可見光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌株的分離純化 稱取 5 g 高溫大曲樣品，加入含有 50 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，置于搖床振蕩 20 min，取上清液按 10 倍梯度稀釋至10?3 和 10?4，分別取 0.1 mL 涂布 LB 培養(yǎng)基平板，置于 37℃ 中培養(yǎng) 24 h，觀察平板上菌落形態(tài)。挑取不同形態(tài)的菌落進一步劃線純化后得到純菌株，培養(yǎng)后用 30% 的甘油重懸菌體于?80℃ 超低溫冰箱保藏。

1.3.2產四甲基吡嗪菌株的篩選 四甲基吡嗪的前體物質乙偶姻在堿性條件下被氧化為 2，3-丁二酮，而后與肌酸產生粉紅色復合物。通過 V-P 試驗對菌株發(fā)酵液中乙偶姻進行初步檢測，實現(xiàn)對產四甲基吡嗪菌株的初篩[17]。挑取單克隆接種 3 mL LB 培養(yǎng)基中，于 37℃ 搖床過夜培養(yǎng) 12 h。取 500 μL 飽和菌液轉接至 50 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照。在 37℃、200r·min?1 的搖床中培養(yǎng) 24 h，吸取 1.5 mL 發(fā)酵液于離心管中，10 000 r·min?1 離心 3 min，取 1 mL 上清液，加入 V-P 試劑振蕩混勻，靜置 30 min，觀察其顏色變化。若反應顏色為紅色，表示該菌株具有產四甲基吡嗪的能力。

1.3.3菌株的鑒定

（1）形態(tài)學觀察

將分離得到的菌株在 LB 培養(yǎng)基平板上劃線，在 37℃ 條件下培養(yǎng) 24 h 后觀察菌落的顏色、大小和表面特征。將菌株制片，通過芽孢染色進行鏡檢，在 100 倍顯微鏡下觀察芽孢和細胞的形態(tài)特征。

（2）分子生物學鑒定

首先利用基因組 DNA 提取試劑盒來提取菌株的基因組 DNA，并以其為模板，利用引物 27F（ 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增 16S rRNA 基因。PCR 擴增體系（50 μL）：10×緩沖液 5 μL，dNTP 4 μL，引物 27 F 與 1492R各 2 μL，DNA 模板 0.5 μL，DNA 聚合酶 0.5 μL，ddH2O 36 μL。PCR 擴增程序：95℃ 預變性 5 min；95℃ 變性 30 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，循環(huán) 30 次；72℃ 再延伸 5 min。利用 1% 瓊脂糖凝膠純化 PCR 產物，割膠回收后送測序公司進行基因測序。測序結果在美國國家生物技術信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，選取同源性高的 16S rRNA 基因序列，利用 MEGA7.0 軟件以鄰接法構建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4菌株胞外水解酶檢測 （1）淀粉酶檢測：采用點接法將菌株 FSDQ02 接種到淀粉酶檢測培養(yǎng)基平板上，在生化培養(yǎng)箱中 37℃ 培養(yǎng) 24 h 后，用0.5% 碘液進行染色，用去離子水沖洗后，靜置 10min，觀察菌落周圍是否有水解圈的生成。（2）蛋白酶檢測：采用點接法將菌株 FSDQ02 接種到蛋白酶檢測培養(yǎng)基平板上，在生化培養(yǎng)箱中 37℃ 培養(yǎng)24 h，觀察菌落周圍是否有水解圈的生成。（3）纖維素酶檢測：采用點接法將菌株 FSDQ02 接種到纖維素檢測培養(yǎng)基平板上，在生化培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng) 24 h 后，加入適量的 1% 剛果紅染液染色 30min，觀察菌落周圍是否有水解圈的生成。

1.3.5菌株生長曲線的測定 從培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種 3 mL LB 培養(yǎng)基，37℃ 搖床培養(yǎng) 12 h，再按 1% 的接種量轉接至 50 mL LB 培養(yǎng)基中，37℃ 搖床培養(yǎng) 12 h 后作為種子液。種子液以 1%接種量接種 50 mL LB 培養(yǎng)基，分別置于 30℃、40℃、50℃，200 r·min?1 搖床培養(yǎng) 36 h，每隔 3 h取樣測定菌液吸光度，紫外可見分光光度計波長設置為 600 nm，每個溫度條件下 3 個平行，以 LB 培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.6菌株耐受性分析 （1）酸堿耐受性試驗：將培養(yǎng)好的種子液以 1% 接種量分別接種 50 mL pH 4、5、6、7、8、9、10 的 LB 培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min?1 培養(yǎng) 24 h，通過測定菌液 OD600 值，判斷菌株對酸堿的耐受程度。每個 pH 條件下 3 個平行，以 LB 培養(yǎng)基作為空白對照。（2）乙醇耐受性試驗：將培養(yǎng)好的種子液以 1% 接種量分別接種于乙醇體積分數(shù)為 0、2%、4%、6%、8%、10%、12% 的 LB 培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min?1 培養(yǎng) 24h，通過測定菌液 OD600 值，判斷菌株對乙醇的耐受程度。每個濃度條件下 3 個平行，以 LB 培養(yǎng)基作為空白對照。（3）NaCl 耐受性試驗：將培養(yǎng)好的種子液以 1% 接種量分別接種于 NaCl 質量濃度為 0、 2%、 4%、 6%、 8%、 10%、 12%、 14%、16% 的 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min?1 培養(yǎng)24 h，通過測定菌液 OD600 值，判斷菌株對鹽的耐受程度。每個濃度條件 3 個平行，以 LB 培養(yǎng)基作為空白對照。

2 結果與分析

2.1產四甲基吡嗪芽孢桿菌的篩選

從涂布培養(yǎng)平板上挑取單菌落，接種發(fā)酵培養(yǎng)基得到發(fā)酵上清液后，加入 V-P 試劑進行顏色觀察。與對照相比，其中菌株 FSDQ02 顯示紅色，V P 反應呈陽性，結果表明篩選得到 1 株產四甲基吡嗪的菌株 FSDQ02（圖 1）。

2.2菌株 FSDQ02 的鑒定

2.2.1菌株的形態(tài)特征 將菌株 FSDQ02 在平板上劃線，得到單菌落。菌落緊貼培養(yǎng)基生長，顏色呈乳白色不透明，表面有褶皺、菌落邊緣不規(guī)則，內部黏稠不易挑起（圖 2A）；通過芽孢染色后鏡檢觀察，菌體呈紅色桿狀，芽孢呈綠色，與典型的芽孢桿菌特征相符（圖 2B）。

2.2.2菌株分子生物學鑒定 根據(jù)基因測序結果，將 16S rRNA 基因序列上傳到 NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行比對，利用軟件 MEGA7.0 中的 Neighbor-Joining模型，構建菌株 FSDQ02 系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖 3 可知，菌株 FSDQ02 與解淀粉芽孢桿菌聚在同一個分支，親緣關系較近，相似度在 99% 以上。因此，結合菌株形態(tài)特征，初步鑒定 FSDQ02 為解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens。

2.3菌株 FSDQ02 的產酶特性

在大曲發(fā)酵過程中，微生物代謝過程會產生多種水解酶，如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等，其中淀粉酶水解淀粉生成葡萄糖，最終代謝轉化為乙偶姻，為四甲基吡嗪的合成提供前體；蛋白酶可以分解蛋白質為氨基酸，為四甲基吡嗪的合成提供氨基[18]。為了測試菌株 FSDQ02 產酶情況，將 FSDQ02 分別點種到蛋白酶檢測培養(yǎng)基、淀粉酶檢測培養(yǎng)基和纖維素酶檢測培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn) FSDQ02 菌落周圍均有明顯的水解圈生成，表明 FSDQ02 具有良好產蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的能力（圖 4）。因此，菌株 FSDQ02 良好的產酶特性，不僅有利于釀酒原料的利用，對白酒風味物質的形成也起重要作用。

2.4菌株 FSDQ02 的生長溫度確定

為了確定菌株 FSDQ02 最適生長溫度，在30℃、40℃、50℃ 條件下測試了菌株 FSDQ02 在 LB培養(yǎng)基中的生長曲線。由圖 5 可知，在 30～40℃范圍內，F(xiàn)SDQ02 生長良好，在 21 h 左右達到平穩(wěn)期，在 30 h 后進入衰亡期；在 50℃ 時，F(xiàn)SDQ02生長較弱。綜上分析，菌株 FSDQ02 在 30～40℃條件下生長良好，其最適生長溫度設定為 37℃。

2.5菌株 FSDQ02 的耐受性分析

2.5.1酸堿的耐受性 在白酒發(fā)酵過程中，分解淀粉和蛋白質等營養(yǎng)物質會產生有機酸、氨類或其他產物，從而造成釀造環(huán)境中 pH 發(fā)生變化，這就要求菌株對培養(yǎng)基酸堿變化具有較好的適應能力[19]。由圖 6 可知，菌株 FSDQ02 在 pH5.0～9.0 范圍內生長良好，對酸堿具有較大的適應范圍。

2.5.2乙醇的耐受性 釀酒微生物對乙醇的耐受能力非常重要，因為白酒釀造過程中產生的乙醇會抑制細菌的正常代謝，對其生長繁殖也會造成一定程度的影響[19]。由圖 7 可知，隨著乙醇濃度的增加，菌株 FSDQ02 的生長速率不斷下降，最大耐受乙醇的濃度為 6%，表明菌株 FSDQ02 對乙醇有一定的耐受能力。

2.5.3NaCl 的耐受性 培養(yǎng)基中鹽濃度越高，產生的滲透壓越大，從而會引起細胞內水活度、細胞結構和酶活性的變化。白酒發(fā)酵中高濃度底物引起的高滲透壓會導致細胞內水分流失，引起細胞萎縮，影響細胞正常生長[19?20]。因此，篩選菌株對滲透壓的耐受能力在白酒釀造中非常重要。由圖 8可知，隨著 NaCl 濃度的增加，菌株 FSDQ02 生長速率會受到一定程度的抑制，耐受 NaCl 最高濃度為 14%，表明菌株 FSDQ02 對滲透壓有一定的耐受性。

3 結論

本研究采用稀釋涂布平板法從貴州高溫大曲中篩選得到 1 株產四甲基吡嗪的菌株 FSDQ02，通過形態(tài)學觀察和分子生物學分析初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens。該菌能分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶；在 30～40℃、pH 5～9 的范圍內生長良好，同時對 6% 的乙醇和 14% 的 NaCl具有耐受性。綜上可知，解淀粉芽孢桿菌 FSDQ02在強化高溫大曲和白酒生產中具有較大的應用潛力。

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（責任編輯：柯文輝）