摘 要：探明罌粟種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為罌粟遺傳育種研究和種質(zhì)指紋圖譜奠定工作基礎(chǔ)。利用形態(tài)標(biāo)記和 SRAP 分子標(biāo)記兩種方法對 25 份罌粟資源的 13 個農(nóng)藝性狀進(jìn)行測定、分析。結(jié)果表明：從 12 對 SRAP 引物中共篩選出 11 對多態(tài)性明顯、條帶清晰的引物組合，對25 份供試材料基因組 DNA 分子進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出 210 條譜帶，其中多態(tài)性條帶 81 條，多態(tài)性比率為 38.57%。SRAP 聚類分析結(jié)果表明：25 份罌粟材料的遺傳相似系數(shù)在 0.907～0.992，當(dāng)相似系數(shù)在 0.936 處作切割線，可將 25 份供試材料分為 5 個大類和若干亞類。對供試?yán)浰诓牧系幕ㄉ?、葉形等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查分析，當(dāng)歐式距離為 5.0 時，可將所有罌粟材料可以分為 12 個大類和若干亞類。綜上分析表明 25 份罌粟種質(zhì)資源遺傳多樣性較豐富，形態(tài)標(biāo)記和 SRAP 分子聚類可以用于研究罌粟種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，研究結(jié)果可為罌粟遺傳育種研究和種質(zhì)指紋圖譜奠定工作基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：罌粟；農(nóng)藝性狀；遺傳多樣性；SRAP 標(biāo)記

中圖分類號：S567.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0253?2301（2024）05?0033?06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.05.006SRAP Analysis of the Genetic Diversity and Genetic Relationship of Poppy Germplasm Resources

WANG Yu-hong1，2，3，WANG Xiao1，2，3，ZHANG Zhao-ping1，2，3，WEI Yu-jie1，2，3，SU Yu-jie1，2，3，YANG Zhen-hua1，2，3

（1. Gansu Academy of Agri-Engineering Technology， Lanzhou， Gansu 730000， China; 2. Key Laboratory of the Special Medicine Source Plant for Germplasm Innovation and Safety Utilization， Wuwei， Gansu 733006， China; 3. Hexi Comprehensive Experimental Station of National Traditional Chinese Medicine Industry Technology System， Wuwei，Gansu 733006， China）

Abstract： The genetic diversity and genetic relationship of poppy germplasm resources were explored， which would lay a foundation for genetic breeding research and germplasm fingerprint of poppy. The 13 agronomic traits of 25poppy resources were measured and analyzed by using the two methods of morphological markers and SRAP molecular markers. The results showed that 11 pairs of primer combinations with obvious polymorphism and clear bands were selected from 12 pairs of SRAP primers. The genomic DNA molecules of the 25 tested materials were amplified， and a total of 210 spectrum bands were amplified， of which 81 were polymorphic bands， and the polymorphism rate was 38.57%. The results of SRAP cluster analysis showed that： the genetic similarity coefficient of25 poppy materials was 0.907-0.992. The cutting line was made when the similarity coefficient was 0.936， and the 25tested materials could be divided into 5 categories and several subcategories. The agronomic traits such as flower color and leaf shape of the tested poppy materials were investigated and analyzed. When the euclidean distance was 5.0， all the poppy materials could be divided into 12 categories and several subcategories. In summary， the analysis showed that the genetic diversity of 25 poppy germplasm resources was abundant. The morphological markers and SRAP molecular clustering could be used to study the genetic diversity and genetic relationship of poppy germplasm resources. The results could lay a foundation for the genetic breeding research and germplasm fingerprint of poppy.

Key words： Poppy；Agronomic character；Genetic diversity；SRAP marker

罌粟 Papaver somniferum L.為 1 年生藥用草本植物，果實(shí)內(nèi)含罌粟堿、嗎啡、海洛因等 30 種生物堿。罌粟具有鎮(zhèn)痛、消咳、止瀉等重要醫(yī)療價值[1]。與此同時，嗎啡類生物堿因其成癮性和依賴性而對社會有極大的危害，國家控制種植，故國內(nèi)對其相關(guān)研究較少。罌粟科植物種類繁多，目前該科在全世界有 38 屬約 700 種，廣泛分布在全世界溫帶和亞熱帶地區(qū)[2]。罌粟的花型、顏色及果實(shí)與虞美人、鬼罌粟等非常相似，僅從外觀上很難鑒別，給公安機(jī)關(guān)的緝毒取證帶來很大困難[3]。對不同生態(tài)區(qū)的罌粟種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)比較研究，有助于揭示遺傳變異及其演化的內(nèi)在原因，并為選育非成癮性的罌粟品種提供理論依據(jù)。

盧龍斗等[4]研究了罌粟屬的偽東方罌粟根尖細(xì)胞的核型，結(jié)果證明該植物體細(xì)胞的染色體數(shù)目為 2n=42，x=7，具有 6 條中部著絲點(diǎn)染色體，30條近中部著絲點(diǎn)染色體和 6 條近端部著絲點(diǎn)染色體。孫富從等[5]對罌粟屬 3 種植物，罌粟、虞美人和偽東方罌粟的染色體核型進(jìn)行了研究，得出結(jié)論：虞美人的核型類型屬于 1A 型，罌粟和偽東方罌粟均屬于 3A 型。梁倩倩等[6]采用 RT-PCR 對野生罌粟 COR、BBE 基因片段融合及其 RNAi 載體進(jìn)行了構(gòu)建，為進(jìn)一步培育低嗎啡高蒂巴因的罌粟種質(zhì)提供了依據(jù)?？盒闫嫉萚7]為了明確分布在山西省不同地域的野罌粟材料之間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，以在山西省采集的 6 份野罌粟和采集于內(nèi)蒙古的 1 份野罌粟引種為研究對象，建立了山西省野罌粟 RAPD 技術(shù)擴(kuò)增體系，分析得知地域分布為野罌粟聚類的主導(dǎo)因素，花色為野罌粟聚類的次要因素。魏玉杰等[8]為揭示不同地區(qū)生境條件下的罌粟生態(tài)型的染色體核型變化，利用普通壓片法對來自中國 5 個?。ㄊ校┑?10 份罌粟材料染色體與核型進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)來源的罌粟材料可分為白花 1 號和白花 2 號 2 個生態(tài)型，染色體均為二倍體，但核型發(fā)生了多樣性變化。魏玉杰等[9]還利用 ISSR 分子標(biāo)記對不同生態(tài)區(qū)罌粟種質(zhì)進(jìn)行了多樣性研究，發(fā)現(xiàn)樣品在親緣關(guān)系和地理分布上呈一定的相關(guān)性，但沒有形成明顯的地理變異模式。張爽等[10]從 GenBank 上獲得罌粟屬植物共 69 條序列，應(yīng)用 Mega 6.0 軟件分析了罌粟屬的序列特征，對罌粟屬植物核心 DNA條形碼進(jìn)行了篩選。宋炳軻等[11]利用 DNA ITS2條形碼序列分毒品原植物大麻、罌粟及其混偽品植物 r DNA 的 ITS2 序列信息，結(jié)果表明利用 DNA ITS2 條形碼序列有可能鑒定出毒品原植物大麻、罌粟。鑒于前人在罌粟遺傳多樣性研究未進(jìn)行過SRAP 分子標(biāo)記分析。因此，本試驗對 25 份罌粟材料進(jìn)行了 SRAP 標(biāo)記分析和農(nóng)藝性狀的觀察，研究供試?yán)浰诨蚪M DNA 的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為罌粟遺傳育種研究和種質(zhì)指紋圖譜奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試?yán)浰诓牧瞎?25 份，具體品種名稱見表 1。選取各個品種新鮮嫩葉 3～4 片，裝入 2.5 mL 離心管，放入液氮罐中帶回實(shí)驗室，并于?80℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1農(nóng)藝性狀調(diào)查 田間試驗分別于 2021 年3 月至 2021 年 10 月和 2022 年 3 月至 2022 年 9 月連續(xù)兩年在甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院試驗基地進(jìn)行，每份材料種植 40 株，常規(guī)田間管理。在成熟期每個品種選取 10 株典型材料，共調(diào)查 13 個性狀指標(biāo)，包括 8 個質(zhì)量性狀（花色、種子顏色、葉形，花瓣形狀、莖稈是否有刺、是否為油桃、株高、分枝數(shù)）和 5 個數(shù)量性狀（主果重、主殼重、株果重、株殼重、籽重）等形態(tài)學(xué)和生物產(chǎn)量性狀（表 2）。利用 SPSS 16.0 和 NTSYS-pc 2.1 軟件進(jìn)行分子聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖。

1.2.2基因組 DNA 提取 每份材料在四葉期取5 株單株幼嫩葉片提取基因組 DNA。用 1%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用蛋白質(zhì)核酸檢測儀檢測其濃度和純度。

1.2.3引物篩選 SRAP 通過獨(dú)特的雙引物設(shè)計對基因的 ORFs（Open reading frames 開放閱讀框） 的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物長 17 bp，對外顯子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。下游引物長 18 bp，對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。SRAP 正向和反向引物序列來源于 Li 等[12]﹐由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成?；谇叭嗽诙喾N作物研究中篩選得到的 12 對多態(tài)性良好的 SRAP 引物[13?15]，進(jìn)一步篩選得到 11 對引物。

1.2.4SRAP 分析 利用 SPSS 26.0 軟件對罌粟主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行聚類分析。根據(jù)電泳圖譜進(jìn)行分析，計算電泳圖譜上清晰可靠的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，在相同遷移率位置上有條帶記為 1，無條帶記為 0，構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。采用 NTSYS-pc2.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用 Excel 電子數(shù)據(jù)表計算 25 份罌粟材料的相似系數(shù)，采用非加權(quán)平均法進(jìn)行聚類分析，得到罌粟親緣關(guān)系分子聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要農(nóng)藝性狀統(tǒng)計分析

對 25 份罌粟種質(zhì)資源表型性狀進(jìn)行調(diào)查、匯總分析。在調(diào)查的 8 個質(zhì)量性狀中，花色變異類型較多，有白色、淺粉、粉色、粉紫、淺紫、紫色和紅色 7 種顏色。5 個數(shù)量性狀中，25 份罌粟的籽重為 4.91～27.50 g，其中，BM 最小，AS 最大。株果重為 0～40.87 g，其中，BH1 最?。o分枝，不存在株果），AS 最大。株殼重 0～21.68 g，其中，BH1 最?。o分枝，不存在株殼），CS 最大。

2.2 農(nóng)藝性狀的聚類分析

對形態(tài)學(xué)聚類圖進(jìn)行分析時，當(dāng)歐式距離為5.0 時可將 26 份罌粟劃分為 12 大類（圖 1）。Ｉ類共 6 個，分別為 SE、ON、KE、SS、BH2、NT；均為非油桃材料，花色均為白色，葉形全緣，花瓣為單瓣，種子顏色為米黃色，莖稈無刺。Ⅱ類共5 個，分別為 JY、JS、ZB2、EG，GO；均為非油桃材料，葉形全緣，花瓣為單瓣，莖稈無刺。Ⅲ類 1 個，為 GF。Ⅳ類共 1 個，為 CH。Ⅴ類共4 個，分別為 CE、CN、ZB1，CO；非油桃材料，花色為粉紫色，葉形全緣，花瓣為單瓣，種子顏色為藍(lán)紫色，莖稈無刺。Ⅵ類共 1 個，為 CS。Ⅶ類共 1 個，為 BM。Ⅷ類共 1 個，為 BH1。Ⅸ類共1 個，為 AS。Ⅹ類共 1 個，為 HB。Ⅺ類共 2 個，分別為 ZM、HX；非油桃材料，葉形為全緣，花瓣為單瓣，種子顏色為藍(lán)紫色。Ⅻ類共 1 個，為QZ，非油桃材料，花色為淺紫色，葉形全緣，花瓣為單瓣，種子顏色為藍(lán)紫色。

2.3 SRAP 多態(tài)性分析

利用 11 對 SRAP 多態(tài)性引物對 25 份罌粟材料進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出 210 條條帶，其中多態(tài)性條帶 81 條 ， 多 態(tài) 性 比 率 為 38.57%。 引 物 Me7-Em7 擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，為 24 條。引物 Me2-Em2 擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，為 14 條。多態(tài)性最高的引物是 Me6-Em6，多態(tài)性比率達(dá) 47.82%。引物Me10-Em10 對部分罌粟材料的擴(kuò)增圖譜見圖 2。

2.4 遺傳相似性分析

根據(jù) SRAP 擴(kuò)增結(jié)果計算各材料間的 SM 相似系數(shù)，25 份罌粟材料的相似系數(shù)在 0.907～0.992，說明這 25 份罌粟種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系較近。其中 ON 相似系數(shù)最小，為 0.907，表明 ON與其他 24 份罌粟種質(zhì)資源的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)；ZM 和 HX 之間的遺傳相似系數(shù)最大，為 0.992，表明其親緣關(guān)系密切或基本上沒有差異，當(dāng)為同種異名品種。

2.5 基于 SRAP 分子標(biāo)記的聚類分析

構(gòu)建 SRAP 聚類分析樹狀圖（圖 3），在相似系數(shù)為 0.936 處作切割線 L1，可將 25 份罌粟材料分為 5 大類：Ⅰ類為 SS、BH2、NT 和 KE，材料來源于甘肅酒泉，花色為白色，葉緣為全緣，花瓣形狀為單瓣，種子顏色為米黃色。Ⅱ類為 SE 和CH，花瓣形狀為單瓣，種子為米黃色材料。Ⅲ類為 CE、CN、CS、CO、ZB1、JY、ZB2、EG、AS、JS 和 BM，非油桃材料，花瓣形狀為單瓣。Ⅳ類為 BH1、HB、GF、ZM、HX、QZ 和 GO，花瓣形狀為單瓣材料。Ⅴ類為 ON。

在相似系數(shù)為 0.964 處作切割線 L2，可將25 份罌粟材料分為 16 個亞類：1 類為 SS 和 BH2，材料均來源于甘肅酒泉，花色均為白色，葉緣為全緣，花瓣形狀為單瓣，種子顏色為米黃色。2 類為NT，材料來源于甘肅酒泉，花色為白色，葉緣為全緣，花瓣形232be1a18863e147c9a8b957a90e2c3e狀為單瓣，種子顏色為米黃色。3 類為 KE，材料來源于甘肅酒泉，花色均為白色，葉緣為全緣，花瓣形狀為單瓣，種子顏色為米黃色材料。4 類為 SE，材料來源于甘肅定西，花色為白色，葉形為全緣，花瓣形狀為單瓣，種子為米黃色。5 類為 CH，材料來源于新疆石河子，花色為淺粉色，葉形為裂緣，花瓣形狀為單瓣，莖稈有刺，種子為米黃色。6 類為 CE、CN、CS、CO、ZB1，5 份材料均來源于甘肅武威，花色均為粉紫色，葉緣為全緣，花瓣形狀為單瓣，種子顏色為藍(lán)紫色材料。7 類為 JY、ZB2 和 EG，材料均為非油桃，花色為淺粉色，葉緣為全緣，花瓣形狀為單瓣。8 類為 AS，材料來源于新疆石河子，花色為淺粉色，葉形為全緣，花瓣形狀為單瓣，莖稈有刺，種子為藍(lán)紫色。9 類為 JS，材料來源于甘肅武威，花色為淺粉色，葉形為全緣，花瓣形狀為單瓣。10 類為 BM，材料來源于青海海東，花色為白色，葉形為全緣，花瓣形狀為單瓣，莖稈有刺，種子顏色為米黃色。11 類為 BH1，材料來源于甘肅酒泉，非油桃材料，花色為白色，葉緣為全緣，花瓣形狀為單瓣，種子顏色為米黃色。12 類為 HB，材料來源于寧夏石嘴山，花色為白色，葉緣為全緣，花瓣形狀為單瓣，油桃，種子顏色為米黃色。13 類為 GF，材料來源于甘肅武威，花色為淺粉色，葉形為全緣，花瓣形狀為單瓣。14 類為 ZM、HX 和 QZ，材料來源于青海海東。15 類為 GO，材料來源于甘肅武威，花色為粉色，葉形為全緣，花瓣形狀為單瓣。16 類為 ON，材料來源于甘肅定西，非油桃材料，花色為白色，葉緣為全緣，花瓣形狀為單瓣，種子顏色為米黃色。

綜上分析可以看出，大多數(shù)亞類都是由來源地相同且主要形態(tài)學(xué)性狀相同的罌粟材料聚在一起。只有個別來源地不相同的材料聚在一起，但是它們的主要形態(tài)學(xué)性狀相同，可能與外地引種利用有關(guān)。由此可以得出罌粟的 SRAP 分類可將與罌粟種質(zhì)基因型的來源和形態(tài)學(xué)性狀相近的品種較好地聚類。

3 討論

通過 SRAP 分子標(biāo)記聚類分析結(jié)果表明，來源地相同的供試?yán)浰诓牧显诜诸悤r基本上聚在一起。比如，第Ⅰ大類包含的 4 個罌粟品種均來自甘肅酒泉以及第Ⅲ大類中來源地相同的材料基本上是相鄰的，或者在同一亞類。然而在形態(tài)學(xué)聚類樹狀圖中并沒有體現(xiàn)出來源地相同的材料分在一起的特點(diǎn)。這說明罌粟種質(zhì)的分子分類與地區(qū)分布存在相關(guān)性，這種差異是罌粟的地理分布與基因型異交和自然進(jìn)化有關(guān)，使表型趨于相近。在分子聚類的第Ⅱ大類中發(fā)現(xiàn)部分形態(tài)差異很大的材料，這說明它們 DNA 水平上的相似度較高，可能與異交產(chǎn)生的遺傳變異較接近有關(guān)。SRAP 聚類與形態(tài)學(xué)聚類之間有一定的一致性，SRAP 的第Ⅰ大類的 4 個罌粟品種在性狀聚類中被分在第Ⅰ類群。罌粟的分子聚類大多數(shù)是將來源地和主要形態(tài)學(xué)性狀相同的罌粟材料聚為一類，但是個別來源地不同，但是它們的主要形態(tài)學(xué)性狀相同，可能與引種利用有關(guān)。

SRAP 分子聚類分析與罌粟種質(zhì)的來源，形態(tài)學(xué)性狀有關(guān)。而形態(tài)學(xué)性狀的分類比較混亂。研究物種的親緣關(guān)系以及種質(zhì)資源的多樣性對作物育種有重要的指導(dǎo)意義。聚類分析是一種非常好的研究植物親緣關(guān)系和分類的生物數(shù)學(xué)方法，可以幫助探明種內(nèi)變種間的遺傳多樣性，為罌粟通過選擇育種、種內(nèi)雜交、雜種優(yōu)勢利用等手段培育價值更高的優(yōu)良品種提供了很好的參考。利用植物學(xué)形態(tài)特征來確定植物種內(nèi)變種或品種之間的親緣關(guān)系這一傳統(tǒng)方法具有一定的合理性，但此方法所憑借的形態(tài)特征仍受到環(huán)境因子和個體發(fā)育的影響，不能提供足夠的能反映內(nèi)在基因型遺傳關(guān)系的信息。分子標(biāo)記所代表的是基因組 DNA 水平上的差異，不受外界環(huán)境及作物生長發(fā)育階段的影響，利用分子標(biāo)記研究作物的親緣關(guān)系及多樣性，其結(jié)果具有客觀、穩(wěn)定的特點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，對罌粟的種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析，SRAP 分子標(biāo)記優(yōu)于形態(tài)學(xué)性狀分析。

4 結(jié)論

本研究分別從形態(tài)學(xué)和 SRAP 分子標(biāo)記方面對 25 份罌粟種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性評價及其親緣關(guān)系的探討。利用 SRAP 標(biāo)記在相似系數(shù)為0.936 處將 25 份罌粟種質(zhì)資源分為 5 大類和若干亞類，在相似系數(shù)為 0.964 處將其分為 16 個大類和若干亞種，體現(xiàn)了 SRAP 分子聚類分析與罌粟種質(zhì)的來源，形態(tài)學(xué)性狀有關(guān)。利用農(nóng)藝性狀系統(tǒng)聚類在歐式距離為 5.0 處將 25 份罌粟材料劃分為 12 大類和若干亞類，歐式距離為 2.0 處將其分為 23 大類和若干亞類，分類比較混亂。因此，對罌粟的種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析，SRAP 分子標(biāo)記優(yōu)于形態(tài)學(xué)性狀分析。本研究通過對罌粟種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究，可為罌粟種質(zhì)資源的合理開發(fā)利用及罌粟優(yōu)勢親本選配提供科學(xué)依據(jù)。此外，SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)的成功應(yīng)用，可為今后進(jìn)一步開展罌粟遺傳育種研究和種質(zhì)指紋圖譜深入研究奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）