摘要：【目的】發(fā)掘月季內(nèi)生拮抗細(xì)菌資源，為月季炭疽病生物防治提供高效而穩(wěn)定的拮抗菌株資源?！痉椒ā?以20個(gè)健康無病害薔薇屬植物的葉片為試驗(yàn)材料，采用組織勻漿法分離葉片內(nèi)生細(xì)菌，采用平板對(duì)峙法篩選對(duì)月季 炭疽病病原菌（Colletotrichum fructicola）YJY-20具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌菌株，結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化和16S rRNA序列分析對(duì)拮抗菌進(jìn)行種類鑒定。利用平板對(duì)扣法測定拮抗菌揮發(fā)性有機(jī)化合物的拮抗效果；利用牛津杯擴(kuò) 散法測定拮抗菌無菌發(fā)酵液對(duì)炭疽病病原菌及菌絲的影響；通過PCR擴(kuò)增脂肽類抑菌物質(zhì)合成基因；采用瓊脂孔擴(kuò) 散法測定拮抗菌粗蛋白和脂肽類抑菌物質(zhì)的抑菌活性；利用平板檢測法測定拮抗菌產(chǎn)胞外酶活性；通過平板對(duì)峙法 測定拮抗菌對(duì)12種植物病原真菌的抑制效果；采用離體葉片試驗(yàn)測定拮抗菌發(fā)酵液對(duì)月季炭疽病的防治效果?！窘Y(jié) 果】從薔薇屬植物葉片中分離篩選出2株對(duì)菌株YJY-20具有較強(qiáng)拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌DMGSMG4和QZM1，經(jīng)鑒定分 別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）。菌株DMGSMG4和QZM1的揮 發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)菌株YJY-20的抑制率分別為11.72%和30.71%，同時(shí)能減少病原菌黑色素生成；其無菌發(fā)酵液對(duì)菌株YJY-20的抑制率分別為60.25%和61.24%，并能造成病原菌菌絲斷裂扭曲。菌株DMGSMG4和QZM1粗蛋白對(duì)菌株YJY-20的抑制率分別為59.76%和50.63%，且熱穩(wěn)定性較好；其脂肽類抑菌物質(zhì)對(duì)菌株YJY-20的抑制率分別為50.07% 和45.03%。2株拮抗菌均能擴(kuò)增出bmyB、fenD、srfAA和srfAB脂肽類抑菌物質(zhì)合成相關(guān)基因。2株拮抗菌可產(chǎn)纖維素 酶和蛋白酶，其中菌株DMSGMG4還可產(chǎn)有機(jī)酸。菌株DMGSMG4和QZM1對(duì)12種植物病原真菌的抑制率均大于50.00%，其對(duì)月季炭疽病離體葉片防治率分別為59.35%和20.58%?！窘Y(jié)論】篩選獲得的菌株DMGSMG4和QZM1對(duì)炭 疽病病原菌具有較強(qiáng)的拮抗效果，具有作為月季炭疽病生防菌株的潛力。

關(guān)鍵詞：月季；炭疽病；內(nèi)生細(xì)菌；拮抗菌；生物防治

中圖分類號(hào)：S436.81

文章編號(hào)：2095-1191（2024）04-1046-14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Screening， identification and bacteriostasic activity of antagonistic endophytic bacteria against Rosa chinensis Jacp.anthracnose

WU Rui1，2， YUAN Mei-jing1，2， KANG Xiao-ling1.2， DU Chong-yang1，2， SUN Rui-rui1，DING Chuan-yu1，2， DU Li1，2，3*

（1College of Life Science and Agricultural Engineering， Nanyang Normal University， Nanyang， Henan 473061， China; 2Henan Province Engineering Research Center of Rose Germplasm Innovation and Cultivation Technique， NanyangNormal University， Nanyang， Henan 473061， China; 3Analysis and Test Center，Nanyang NormalUniversity，Nanyang，Henan 473061， China）

Abstract：【Objective】To explore the resources of endophytic antagonistic bacteria of Rosa chinensis Jacp.， and pro- vide efficient and stable antagonistic strain resources for biocontrol of R. chinensis anthracnose. 【Method】The leaves of 20 healthy and disease-free Rosa species were used as test materials， the endophytic bacteria were isolated from the leavesby tissue homogenization method， the endophytic bacteria strains with antagonistic effect against Colletotrichum fructicola YJY-20 were screened by plate confrontation method. The antagonistic bacteria were identified according to colony morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. The antagonistic effect againstC. fructicola YJY-20 of volatile organic compounds from antagonistic bacteria were determined by plate interlocking method. The inhibitory activity of sterile fermentation broth of the antagonistic bacteria on C. fructicola YJY-20 and its hyphae were determined by the Oxford cup diffusion method. The PCR was used to amplify lipopeptide biocontrol functional genes. The inhibitory activity of the crude protein and lipopeptide antibacterial substance from antagonistic bacteria against C. fructicola YJY-20 were determined by agar well diffusion method. The extracellular enzyme activity of the antagonistic bacteria were detected by plate assay method. The inhibitory activity of antagonistic bacteria against 12 different plant pathogenic fungi were determined by plate confrontation method. The control effects of fermentation broth of antagonistic bacteria against R. chinensis anthracnose caused by C. fructicola were detected by in vitro leaves experiment. 【Re- sult】Two endophytic bacteria strains DMGSMG4 and QZM1 with strong activity against C. fructicola YJY-20 were iso- lated and screened from the leaves of Rosa species， and they were identified as Bacillus amyloliquefaciens and B. velezen- sis respectively. The inhibition rates against C. fructicola YJY-20 of strains DMGSMG4 and QZM1 volatile organic com- pounds were 11.72% and 30.71% respectively， and they both could reduce melanin production of C. fructicola YJY-20.The inhibition rates against C. fructicola YJY-20 of strains DMGSMG4 and QZM1 sterile fermentation broth were 60.25% and 61.24% respectively， and they could cause hyphae of C. fructicola YJY-20 breakage and distortion. The inhibition rates against C. fructicola YJY-20 of strains DMGSMG4 and QZM1 crude protein were 59.76% and 50.63% respectively， and their thermal stability was good. The inhibition rates of the strains DMGSMG4 and QZM1 lipopeptide antibacterial compounds on C. fructicola YJY-20 were 50.07% and 45.03% respectively. The two strains both could amplify lipopeptide antibacterial substance synthetic related genes such as srfAA， srfAB， fenD and bmyB. The two strains both could produce cellulase and protease， and strain DMSGMG4 could produce organic acids. The inhibition rates of two strains DMGSMG4 and QZM1 were more than 50.00% against 12 different plant pathogenic fungi， and control rates on the in vitro leaves with anthracnose were 59.35% and 20.58% respectively. 【Conclusion】The screened strains DMGSMG4 and QZM1 have strong antagonistic effect against C. fructicola， and they show potential to be biocontrol strains for R. chinen- sis anthracnose.

Key words： Rosa chinensis Jacp.; anthracnose; antagonistic strain; biological control

Foundation items： Henan Youth Science Foundation Project （232300420450） ; Henan Postgraduate Education Reform and Quality Improvement Project （YJS2021JD17）; Innovation and Entrepreneurship Training Program for College Students of Henan （202210481043） ;Nanyang Soft Science Research Project （RKX011）

0 引言

【研究意義]月季（Rosa chinensis Jacq.）為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，是我國十大傳統(tǒng)名花之一，被廣泛應(yīng)用于園林造景、切花和盆栽等，其花、根和葉均可入藥，且含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的觀賞價(jià)值、食用價(jià)值和藥用價(jià)值（賀蕤等，2017；李思思等，2022；劉天天等，2023）。近年來，隨著市場需求量增多，月季種植面積迅速擴(kuò)大。然而，月季在種植過程中常發(fā)生一些病害導(dǎo)致其觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值受到影響（程茂高和喬卿梅，2011），其中炭疽病的危害極大。月季炭疽病致病菌主要為炭疽菌屬（Colletotrichum），該屬真菌的寄主范圍廣，屬于一類全球分布的植物病原真菌（劉麗萍等，2020）。月季感染炭疽菌后，葉片會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則的棕色斑點(diǎn)，隨著病害加重，斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大并變?yōu)樯钭厣―uetal.，2023），最終出現(xiàn)葉片脫落和植株死亡等現(xiàn)象。目前，炭疽病防治以化學(xué)農(nóng)藥為主，但長期使用會(huì)造成土壤酸化和水源污染等問題，還易使病原菌產(chǎn)生耐藥性。生物防治因具有安全、環(huán)保和高效的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是化學(xué)農(nóng)藥的替代品。因此，發(fā)掘月季豐富的內(nèi)生拮抗菌資源，對(duì)月季產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，國內(nèi)外針對(duì)月季炭疽病的研究主要集中在病原菌的分離鑒定及其致病基因調(diào)控方面，并已分離出膠孢炭疽菌（C.gloespo-rioides）（Rivera et al.，2000）、暹羅炭疽菌（C.sia-mense）（Feng et al.，2019）、博寧炭疽菌（C.boni-nense）（Ding et al.，2021）和果生炭疽菌（C.fructi-cola）（Du et al.，2023）等，病原菌的分離為月季炭疽病防治提供了參考依據(jù)。此外，Liu和Li（2019）對(duì)月季炭疽菌（C.siamense）侵染機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CsBzip10在炭疽菌的表達(dá)和致病性中發(fā)揮著重要作用，該基因敲除后能顯著抑制炭疽菌分生孢子和附著孢形成。炭疽病已成為月季高發(fā)病害，但化學(xué)農(nóng)藥防治效果并不理想，因而研究者逐漸將目光轉(zhuǎn)向生物防治。研究表明，內(nèi)生菌對(duì)不同植物炭疽病具有較好的防治效果（歐婷等，2022）。蔣晶晶等（2020）從健康葡萄葉片中分離獲得1株貝萊斯芽孢桿菌X1-6-1，該菌株對(duì)葡萄炭疽病菌具有顯著的拮抗作用。石楊等（2022）從牡丹中分離獲得的枯草芽孢桿菌FJ1.3對(duì)牡丹炭疽病具有較好的拮抗作用，其離體葉片防治率為47.06%，且可產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶。Feng等（2022）從核桃根部分離篩選出的暹羅芽孢桿菌WB1對(duì)核桃炭疽病病原菌（C.acutatum）具有較好的拮抗效果，其溫室盆栽防治率為51.32%，且能增強(qiáng)植株相關(guān)防御酶活和促進(jìn)植株生長。Wei等（2023）從辣椒葉中分離獲得的解淀粉芽孢桿菌L1-7和貝萊斯芽孢桿菌L3-5對(duì)辣椒炭疽菌（C.scovillei）有較強(qiáng)的抑制作用，其室內(nèi)盆栽防治率分別為80.64%和73.39%，且2株菌株均可產(chǎn)生IAA和溶解磷，具有一定的促生功能。內(nèi)生菌在月季炭疽病防治上也有一定成效。宋光桃等（2021）從月季、銀杏、鉤藤、黑老虎和山蒼子植物葉片中分離篩選拮抗內(nèi)生菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種植物葉片中均存在對(duì)月季炭疽菌具有抑菌作用的菌株，其中從月季葉片中分離獲得的細(xì)菌菌株YJX2的拮抗效果較好，拮抗圈大小為8.6mm。莫維弟等（2022）從健康月季葉片中分離出137株芽孢桿菌，通過平板對(duì)峙法篩選出5株對(duì)炭疽病菌（C.boninense）抑菌效果較好的菌株，其中解淀粉芽孢桿菌GUHS97的抑菌效果最好，抑菌率為77.85%，且田間防治試驗(yàn)效果優(yōu)于化學(xué)藥劑?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】內(nèi)生菌在植物炭疽病防治中已展現(xiàn)出良好的生防作用，但由于拮抗菌自身特性和自然環(huán)境的影響，在實(shí)際生產(chǎn)中能穩(wěn)定有效防治植物炭疽病的拮抗菌株較少。目前，國內(nèi)關(guān)于月季炭疽病拮抗菌的研究報(bào)道較少，缺乏高效穩(wěn)定的生防菌株，且對(duì)拮抗菌的抑菌物質(zhì)及拮抗機(jī)理缺乏深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以20個(gè)薔薇屬植物種類為研究對(duì)象，采用組織勻漿法分離月季葉片內(nèi)生細(xì)菌，采用平板對(duì)峙法和混合平板法篩選對(duì)炭疽菌具有拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌菌株，對(duì)拮抗菌株進(jìn)行分類鑒定，并初步探究其抑菌物質(zhì)和拮抗機(jī)理，以期為月季炭疽病生物防治提供高效而穩(wěn)定的拮抗菌株資源，實(shí)現(xiàn)月季炭疽病生物防控。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試材料

供試植物葉片材料采集于南陽師范學(xué)院月季種質(zhì)資源苗圃中心（32°58'45.66\"N，112°28'31.76\"E）5年生健康無病害的20個(gè)薔薇屬植物，包括大馬革士薔薇、野薔薇、黃木香、瑞典女王、七姊妹薔薇、夏令營、朝圣者、紫色天際線、藤冰山、藤本櫻霞、粉團(tuán)薔薇、艾拉絨球、安吉拉、哈德?？　⒓t色沙龍寶石、嫦娥奔月、蜂蜜焦糖、歡笑格魯吉亞、雀之舞和薰衣草花環(huán)。

1.1.2 供試病原真菌

月季炭疽病病原菌（C.fruc-ticola）YJY-20、YJY-22、YJY-23和花生白絹病病原菌（Sclerotium rolfsii Sacc）H2-1，由河南省月季種質(zhì)創(chuàng) 新與栽培技術(shù)工程研究中心實(shí)驗(yàn)室分離保存；大葉黃楊稻黑孢菌（Nigrospora oryzae）HY12、石榴白二輪 籃狀病病原菌（Talaromyces albobiverticillius）Tp-2、 大葉黃楊擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis disseminata）HY98、白玉蘭葉斑病病原菌（Diaporthe pesciola）BYL-9、石榴葉斑病病原菌（Dwiroopa punicae）SL1-2、石榴葉斑病病原菌（Pilidiella granati）SL1-1、 石榴葉斑病病原菌（Alternaria alternata）SL1-3、艾草 葉斑病病原菌（A.alternata）ACO5和歐石竹鐮刀菌 （Fusarium fujikuroi）OSZ-P1，均由南陽師范學(xué)院生 命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院分離保存。

1.1.3供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20g、馬鈴薯200g、瓊脂18g、蒸餾水1000mL；NA培養(yǎng)基： 蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾 水1000mL，pH7.0～7.2；NB培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基不加 瓊脂。

1.2內(nèi)生細(xì)菌分離與純化

稱取0.5g葉片，先用無菌水沖洗，75%乙醇浸 泡30s后無菌水沖洗1～2次，再在5%次氯酸鈉溶液 中浸泡3min后無菌水沖洗5～6次。葉片置于無菌 濾紙上晾干，并作印跡對(duì)照處理；消毒后的葉片放入 研缽中，加入9.5mL的0.9%生理鹽水充分研磨，勻漿吸入試管中靜置6～10min，吸取200μL上清液涂布于NA培養(yǎng)基上，30℃暗培養(yǎng)。待培養(yǎng)基上長出菌落后，挑取形態(tài)、大小和顏色不同的單菌落到NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)純化3～4次后轉(zhuǎn)入NA斜面試 管4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3拮抗菌篩選

1.3.1拮抗菌初篩

以月季炭疽病病原菌菌株 YJY-20為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)峙法進(jìn)行拮抗菌篩選。將直徑為6mm的菌株YJY-20菌餅接種至PDA 培養(yǎng)基中央，并在距離菌餅25mm處以十字對(duì)稱接 種內(nèi)生細(xì)菌，每個(gè)平板接種1株內(nèi)生細(xì)菌，以中心只 接種病原菌菌餅的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），每株 內(nèi)生細(xì)菌設(shè)3次重復(fù)。28℃暗培養(yǎng)，7d后測量病 原菌菌落直徑并計(jì)算抑制率。抑制率（%）=（對(duì)照菌 落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100。

1.3.2 拮抗菌復(fù)篩

將初篩得到的拮抗菌在NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h，用無菌牙簽挑取單菌落接種至NB培養(yǎng)基中，28 C下 180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，制備成拮抗菌發(fā)酵液備用（以下發(fā)酵液制備方法同）。PDA培養(yǎng)基冷卻至50 C后，以10%的比例將拮抗菌發(fā)酵液添加到 PDA培養(yǎng)基中混合倒板。待平板凝固后在其中心位置接種直徑6mm的菌株 YJY-20菌餅，以中心只接種病原菌菌餅的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），每株內(nèi)生細(xì)菌設(shè)3次重復(fù)。28℃暗 培養(yǎng)，7d后測量病原菌菌落直徑并計(jì)算抑制率。

1.4拮抗菌形態(tài)特征及生理生化鑒定

將篩選得到的拮抗菌在NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng) 24h，觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透 明度和顏色，生理生化測定方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng) 鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）和《微生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)》（沈萍等，2001）。

1.5拮抗菌分子生物學(xué)鑒定

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[生工生物工 程（上海）股份有限公司]提取拮抗菌株的基因組 DNA，利用細(xì)菌通用引物27-F（5'-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3'）和 1492-R（5'-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3'）PCR擴(kuò)增拮抗菌的16S rRNA序列 （Wei et al.，2023）。PCR反應(yīng)體系25.0 uL：2×Accu- rate Tag Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，上、 下游引物（10umol/L）各1.0uL，ddH2O9.5μL。PCR擴(kuò)增程序：94°℃預(yù)變性5min；94°℃30s，58℃30s，72℃1.5min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，使用MEGA11.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6拮抗菌抑菌物質(zhì)分泌方式初探

1.6.1拮抗菌揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)菌株YJY-20的抑菌活性

制備拮抗菌的發(fā)酵液備用。取200uL 拮抗菌發(fā)酵液至NA培養(yǎng)基中涂抹均勻；取直徑 6mm的菌株YJY-20菌餅接種至PDA培養(yǎng)基中心。 將涂抹有拮抗菌發(fā)酵液的NA培養(yǎng)基與接種有病原 菌菌餅的PDA培養(yǎng)基相扣，并用封口膜密封；以涂抹NB培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），每處理3次重復(fù)。28℃ 暗培養(yǎng)，7d后測量病原菌菌落直徑并計(jì)算抑制率。

1.6.2拮抗菌無菌發(fā)酵液對(duì)菌株YJY-20及其菌絲的影響

離心收集拮抗菌發(fā)酵上清液，經(jīng)0.22um微 孔濾膜過濾后獲得無菌發(fā)酵液。在PDA培養(yǎng)基中心接種直徑為6mm的菌株YJY-20菌餅，距菌餅25mm處十字對(duì)稱放置牛津杯，并加入100μL無菌發(fā)酵液；以添加同體積的無菌水為對(duì)照（CK），每 處理3次重復(fù)。28°℃暗培養(yǎng)，7d后測量病原菌菌落 直徑并計(jì)算抑制率。按照上述方法制備平板，在菌 餅與牛津杯中間45°插入蓋玻片，以加無菌水為對(duì)照 （CK）。28°C暗培養(yǎng)，待病原菌菌絲生長至蓋玻片 后，觀察菌絲形態(tài)及結(jié)構(gòu)。

1.7拮抗菌抑菌物質(zhì)分離及拮抗效果測定

1.7.1拮抗菌粗蛋白的拮抗效果及熱穩(wěn)定性測定

4℃離心收集拮抗菌發(fā)酵上清液，分別向拮抗 菌上清液中加入硫酸銨直至飽和度達(dá)25%和35%； 0℃充分?jǐn)嚢?h，12000r/min離心25min，4°℃收集 沉淀。用上清液原體積1/50的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）重懸沉淀使其完全溶解，沉淀溶液加入到透析袋（分子截留量8000D）中4℃透析24h； 每8h更換1次透析緩沖液，共3次，透析液經(jīng)0.22um 微孔濾膜過濾備用。將拮抗菌的粗蛋白分別在50、 60、70、80、90和100℃下處理30min，采用瓊脂孔擴(kuò) 散法測定粗蛋白對(duì)菌株YJY-20的拮抗效果，以未處理過的拮抗菌粗蛋白為對(duì)照（CK）。28℃暗培 養(yǎng)，7d后測量病原菌菌落直徑并計(jì)算抑制率。

1.7.2拮抗菌脂肽類粗提物的拮抗效果

用1mol/L的HC1溶液將拮抗菌發(fā)酵上清液調(diào)至pH2.0，4°C靜 置24h，離心收集沉淀。用甲醇重懸沉淀使其完全 溶解，萃取8h，共3次；萃取液合并經(jīng)0.22um微孔 濾膜過濾備用。采用瓊脂孔擴(kuò)散法測定拮抗菌脂肽 類粗提物對(duì)菌株YJY-20的拮抗效果，以甲醇為對(duì)照（CK）。28C暗培養(yǎng)，7d后測量病原菌菌落直徑并 計(jì)算抑制率。

1.8拮抗菌脂肽類抑菌物質(zhì)功能基因PCR檢測

以拮抗菌總DNA為模板，采用5個(gè)脂肽類化合 物合成相關(guān)基因（bmyB、fenD、ituC、srfAA和srfAB） 的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件

參照文獻(xiàn)（Joshi and McSpadden Gardener，2006）， PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至生 工生物工程（上海）股份有限公司測序并比對(duì)。

1.9拮抗菌產(chǎn)胞外酶活性測定

參照仇艷肖（2012）、王彪等（2019）的方法制備 果膠酶培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基、有 機(jī)酸培養(yǎng)基和茯苓粉培養(yǎng)基，分別用于檢測拮抗菌 產(chǎn)果膠酶、蛋白酶、纖維素酶、有機(jī)酸和β-1，3葡聚糖 酶的活性。將拮抗菌在NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24h， 挑取單菌落接種在各檢測培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng) 48h，觀察拮抗菌周圍是否有透明圈產(chǎn)生，判斷拮抗 菌是否具備產(chǎn)上述5種胞外酶的能力。

1.10拮抗菌抑菌譜測定

采用平板對(duì)峙法測定拮抗菌對(duì)12種供試植物 病原真菌的拮抗效果，每種病原真菌處理設(shè)3次重 復(fù)，28℃暗培養(yǎng)，待對(duì)照長滿平板后測量各病原真 菌菌落直徑并計(jì)算抑制率。

1.11拮抗菌對(duì)月季炭疽病的離體葉片防治效果 測定

采集健康的安吉拉月季葉片，無菌水清洗，75% 乙醇消毒30s后用無菌水沖洗2～3次，置于無菌濾 紙上晾干備用。葉片放入墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿 中，用一次性注射器在葉片表面刺破創(chuàng)傷，每片葉片 創(chuàng)傷1處，并向創(chuàng)傷處均勻噴灑1mL拮抗菌發(fā)酵液（1×108CFU/mL）；待葉片表面晾干后在創(chuàng)傷處接種直徑6mm的菌株YJY-20菌餅，培養(yǎng)皿中加入5mL無菌水后用封口膜密封。以只噴灑NB培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），每處理3次重復(fù)，每重復(fù)處理10張葉片。 將葉片置于濕度55%、28℃、光暗交替12h/12h的 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7d后測量各處理葉片病斑直 徑，計(jì)算病情指數(shù)和防治率。病情指數(shù)（%）=[Σ（病 級(jí)斑點(diǎn)數(shù)×該病級(jí)值）]/（接種點(diǎn)數(shù)×最高級(jí)值）×100； 防治率（%）=（對(duì)照病情指數(shù)一處理病情指數(shù)）/對(duì)照 病情指數(shù)×100。

病斑分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Subramani和Aalbersberg （2012）并作適當(dāng)調(diào)整：0級(jí)，刺傷點(diǎn)感??；1級(jí)，病斑直 徑lt;5mm；2級(jí)，5mm≤病斑直徑lt;7mm；3級(jí)，7mm≤ 病斑直徑lt;9mm；4級(jí)，9mm≤病斑直徑lt;14mm； 5級(jí)，病斑直徑≥14mm。

1.12統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2021對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS26.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生細(xì)菌分離與拮抗菌初篩結(jié)果

從20個(gè)薔薇屬植物的葉片中共分離獲得77株 內(nèi)生細(xì)菌（表1）。通過平板對(duì)峙法發(fā)現(xiàn)有26株內(nèi)生 細(xì)菌對(duì)菌株YJY-20有不同程度的拮抗效果（表2）。 對(duì)照長滿平板后第1d，有10株菌株的抑制率為 20.00%～40.00%，5株菌株的抑制率為40.00%～60.00%，7株菌株的抑制率為60.00%～70.00%；其中，菌 株QZM1和DMGSMG4對(duì)菌株YJY-20的拮抗效果 最好，抑制率分別為67.64%和66.55%。滿板后第 5d，有3株菌株抑制率為20.00%～40.00%，2株菌株抑制率為40.00%～60.00%，6株菌株抑制率為60.00%～70.00%；其中，菌株QZM1和DMGSMG4對(duì)菌株YJY-20的拮抗效果最好，抑制率分別為66.40% 和65.55%。將滿板后第1d抑制率gt;40.00%的12株 內(nèi)生細(xì)菌作為后續(xù)復(fù)篩試驗(yàn)菌株。

2.2拮抗菌復(fù)篩結(jié)果

利用混合平板法對(duì)初篩得到的12株抑菌活性 較強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行拮抗能力復(fù)篩。結(jié)果（表3）顯 示，對(duì)照滿板后第1d，有11株菌株的抑制率gt;80.00%； 對(duì)照滿板后第5d，12株內(nèi)生細(xì)菌的拮抗效果與滿板 第1d的效果基本一致；對(duì)照滿板后第8d，菌株 QZM1、DMGSMG4和YQW1的拮抗效果最好，抑制 率分別為88.93%、89.98%和89.77%。結(jié)合初篩結(jié) 果，由于菌株YQW1初篩試驗(yàn)中滿板后第5d的抑 制率為29.28%，拮抗效果相比其他2株內(nèi)生細(xì)菌弱，因此將菌株DMGSMG4和QZM1作為后續(xù)試驗(yàn)的 目標(biāo)菌株。

2.3拮抗菌DMGSMG4和QZM1鑒定結(jié)果

2.3.1拮抗菌DMGSMG4和QZM1菌落形態(tài)特征 及生理生化鑒定2株拮抗菌在NA培養(yǎng)基劃線培 養(yǎng)24h后，菌株DMGSMG4菌落顏色為白色，中間臍突狀，邊緣不規(guī)則，表面干燥不黏稠、無光澤（圖1-A）。菌株QZM1菌落顏色為乳白色，形態(tài)呈圓形，中間突起，邊緣規(guī)則，表面濕潤黏稠、有光澤（圖1-B）。革蘭氏染色均為陽性，菌體呈桿狀。對(duì)菌株DMGSMG4和QZM1的生理生化測定結(jié)果（表4）顯示，2株拮抗菌的生理生化結(jié)果一致，淀粉水解、V-P試驗(yàn)為陽 性；甲基紅、酪蛋白水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、接觸酶 反應(yīng)、葡萄糖發(fā)酵、固氮試驗(yàn)、溶磷試驗(yàn)和解鉀試驗(yàn) 均呈陰性。

2.3.2拮抗菌DMGSMG4和QZM1分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

測序結(jié)果顯示，菌株DMGSMG4和QZM1的 16S rRNA序列長度分別為 1443 和1423 bp，序列登錄號(hào)分別為OR260987和 OR260999。經(jīng)BLAST比對(duì)分析，菌株 DMGSMG4與解淀粉芽孢桿菌 B9（KY685066）的同源性最高，達(dá)100%;菌株QZM1與貝萊斯芽孢桿菌WGB6（KY962344）的同源性最高，達(dá)99.93%。

通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可見，菌株DMGSMG4與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ht1-1（JF899275）和TL4（KY129662）位于同一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近（圖 2-A）;菌株QZM1與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）CS1.11（MN865798）位于同一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近（圖 2-B）。結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化特征分析，將菌株DMGSMG4鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens），將菌株QZM1 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）。

2.4拮抗菌DMGSMG4和 QZM1的抑菌物質(zhì)分泌方式初探

2.4.1拮抗菌DMGSMG4和QZM1揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)菌株YJY-20的抑菌活性

如表5所示，菌株DMGSMG4和 QZM1 的揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)菌株YJY-20的抑制率分別為 11.72%和30.71%;經(jīng)2 株拮抗菌處理后，菌株YJY-20呈淡黃色，與對(duì)照相比所生成的黑色素較少，表明2 株拮抗菌揮發(fā)性有機(jī)化合物能有效降低菌株YJY-20 黑色素生成（圖 3）。

2.4.2拮抗菌DMGSMG4和QZM1無菌發(fā)酵液對(duì)菌株YJY-20及菌絲的影響

如表6所示，菌株DMGSMG4 和 QZM1 無菌發(fā)酵液對(duì)菌株YJY-20 均具有較強(qiáng)的抑制效果，抑制率分別為 60.25%和61.24%。通過顯微觀察菌絲形態(tài)特征，經(jīng)2 株拮抗菌無菌發(fā)酵液處理后，菌株YJY-20 生長受到抑制，其菌絲出現(xiàn)扭曲和畸形，部分末端出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象；對(duì)照的菌絲生長正常，長短均勻，無斷裂和畸形現(xiàn)象，且表面光滑（圖4）。

2.5拮抗菌DMGSMG4和QZM1抑菌物質(zhì)分離及拮抗效果測定結(jié)果

2.5.1拮抗菌DMGSMG4和QZM1粗蛋白拮抗效果及熱穩(wěn)定性測定

如表7所示，菌株DMGSMG4和QZM1的粗蛋白對(duì)菌株YJY-20具有較強(qiáng)的拮抗效果，抑制率分別為59.76%和50.63%。2株拮抗菌的粗蛋白經(jīng)50～100°℃不同溫度處理后，對(duì)菌株YJY-20仍具有拮抗效果，但與對(duì)照未處理過的粗蛋白相比拮抗能力有所減弱。

2.5.2拮抗菌DMGSMG4和QZM1脂肽類粗提物的拮抗效果

如表8所示，菌株DMGSMG4和QZM1的脂肽類粗提物對(duì)菌株YJY-20具有明顯的抑制效果，抑制率分別為50.07%和45.03%。由此推斷2株拮抗菌可通過產(chǎn)生某些脂肽類抑菌物質(zhì)以抑制菌株YJY-20正常生長，從而實(shí)現(xiàn)防治效果。

2.6拮抗菌DMGSMG4和QZM1脂肽類抑菌物質(zhì)功能基因PCR檢測結(jié)果

PCR檢測結(jié)果（圖5）顯示，參與脂肽類物質(zhì)合成的4個(gè)相關(guān)基因srfAA、srfAB、fenD和bmyB均能在2株拮抗菌的基因組中擴(kuò)增到，但均未擴(kuò)增到基因ituC。經(jīng)BLAST比對(duì)分析，2株菌株利用特異性引物SrfAF-SrfAR（srfAA）、110F-110R（srfAB）和FenDF-FenDR（fenD）所擴(kuò)增的序列分別與淀粉芽孢桿菌SYBC H47（KY051727）中srfAA基因序列、芽孢桿菌屬FX74（OQ983492）中srfAB基因序列和解淀粉芽孢桿菌PR2（MT125616）中fenD基因序列同源性在98%以上；特異性引物BMBF2-BMBR2（bmyB）所擴(kuò)增的序列分別與枯草芽孢桿菌ATCC55079（KU170613）、枯草芽孢桿菌IBFCBF-4（MG800640）和貝萊斯芽孢桿菌UTB96（OK274217）中脂肽類物質(zhì)合成相關(guān)基因同源性在97%以上。表明2株拮抗菌具有合成細(xì)菌素、豐原素和表面活性素等脂肽類抑菌物質(zhì)的潛力。

2.7拮抗菌DMGSMG4和QZM1產(chǎn)胞外酶活性測定結(jié)果

5種胞外酶活性檢測結(jié)果顯示，菌株DMGSMG4和QZM1在纖維素酶（圖6-A-1和圖6-B-1）及蛋白酶（圖6-A-4和圖6-B-4）檢測培養(yǎng)基上均形成了透明的水解圈，表明2株拮抗菌均具有產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶的能力。此外，菌株DMGSMG4在有機(jī)酸檢測培養(yǎng)基上也形成了透明圈（圖6-A-2），表明菌株DMGSMG4還具產(chǎn)有機(jī)酸的能力。

2.8拮抗菌DMGSMG4和QZM1的抑菌譜測定結(jié)果

由表9和圖7可知，拮抗菌DMGSMG4和QZM1對(duì)12種植物病原真菌均具有較強(qiáng)的拮抗作用，抑制率均大于50.00%；其中對(duì)菌株YJY-22的抑制率分別為72.62%和77.00%，對(duì)菌株YJY-23的抑制率分別為66.39%和66.34%。拮抗菌DMGSMG4和QZM1的抑菌譜較廣，應(yīng)用潛力較大，可用于多種植物病害的防治研究。

2.9拮抗菌DMGSMG4和QZM1對(duì)月季炭疽病的離體葉片防治效果

離體葉片防治結(jié)果（圖8）顯示，處理后第7d對(duì)照葉片創(chuàng)傷處周圍出現(xiàn)明顯的褐化病斑，且病斑直徑較大（圖8-A），而經(jīng)拮抗菌DMGSMG4和QZM1發(fā)酵液處理后的葉片病斑直徑明顯小于對(duì)照（圖8-B和圖8-C）。如表10所示，對(duì)照的離體葉片病情指數(shù)為70.00，而經(jīng)拮抗菌DMGSMG4和QZM1處理過的離體葉片病情指數(shù)均低于對(duì)照，防治率分別為59.35%和20.58%。由此可知，拮抗菌DMGSMG4和QZM1對(duì)月季炭疽病具有較好的防治效果，能有效抑制炭疽病病原菌對(duì)月季葉片的侵染，保證月季植株的正常生長。

3討論

目前，以生物防治為主的植物病害防控措施逐漸成為了研究熱點(diǎn)，并受到許多學(xué)者關(guān)注。芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗真菌能力，對(duì)人體及動(dòng)植物無毒無害，因而廣泛應(yīng)用于植物病害生物防治閆楊等，2019；宇書田，2022）。本研究從20個(gè)薔薇屬植物的健康葉片中分離篩選出2株對(duì)月季炭疽病病原菌YJY-20具有較強(qiáng)抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌DMGSMG4和QZM1，抑菌率分別為67.64%和66.55%。通過生理生化和16SrRNA序列比對(duì)分析，拮抗菌DMGSMG4和QZM1分別鑒定為解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。張曉勇等（2021）從紅花龍膽莖稈中分離出貝萊斯芽孢桿菌SB023能有效抑制杧果炭疽病病原菌生長，抑菌率為71%；本研究2株拮抗菌的抑菌效果與之相似。表明芽孢桿菌在防治植物炭疽病方面具有可行性。此外，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2株拮抗菌DMGSMG4和QZM1對(duì)其他12種植物病原真菌也具有拮抗作用，抑制率均大于50.00%，表明2株菌株的抑菌譜較廣。本研究還利用2株拮抗菌發(fā)酵液對(duì)月季炭疽病離體葉片進(jìn)行防治試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2株拮抗菌發(fā)酵液均具有較好的防治效果，防治率分別為59.35%和20.58%，與張寧等（2022）報(bào)道的利用拮抗菌YJ3-7發(fā)酵液防治人參黑斑病的結(jié)果相似。研究拮抗菌DMGSMG4和QZM1對(duì)月季炭疽病的防治效果，有利于豐富月季炭疽病拮抗菌株資源。

水解酶作為芽孢桿菌重要的抑菌物質(zhì)之一，能降解真菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而抑制病原真菌生長，如葡聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶（Xuet al.，2016;Subbanna et al.，2018;宋利沙等，2020）。本研究對(duì)2株拮抗菌進(jìn)行胞外酶定性分析，結(jié)果顯示，2株菌株均具有產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶的能力，其中拮抗菌DMGSMG4還具產(chǎn)有機(jī)酸的能力。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，炭疽病病原菌YJY-20經(jīng)2株拮抗菌無菌發(fā)酵液處理后菌絲表面粗糙，且出現(xiàn)扭曲斷裂現(xiàn)象，與張荷花（2020）報(bào)道的短小芽孢桿菌W-7抑制致病疫霉生長和章樂樂等（2023）報(bào)道的芒果炭疽菌經(jīng)貝萊斯芽孢桿菌RL-LL04處理后菌絲出現(xiàn)斷裂扭曲現(xiàn)象的結(jié)果相似，且以上所報(bào)道的拮抗菌株均可產(chǎn)蛋白酶或纖維素酶等胞外水解酶。由此推斷胞外水解酶可能是2株拮抗菌對(duì)月季炭疽菌及多種植物病原菌產(chǎn)生拮抗作用的重要物質(zhì)之一。

抑菌物質(zhì)常見提取和分離方法有結(jié)晶、溶劑萃取、酸沉淀法、大孔樹脂抽提法、硫酸銨沉淀法和色譜法等（桑建偉等，2018；賀旭等，2023）。一般認(rèn)為，脂肽類物質(zhì)可通過酸沉淀法提取，大分子抑菌蛋白類物質(zhì)可通過硫酸銨飽和沉淀法提?。ㄌm寶鋒等，2022）。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2株拮抗菌的抑菌物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清液中，因此本研究通過硫酸銨沉淀法和酸沉淀法分離2株拮抗菌的抑菌物質(zhì)，并分別測定抑菌物質(zhì)對(duì)菌株YJY-20的抑菌效果。結(jié)果顯示，2株拮抗菌DMGSMG4和QZM1的粗蛋白對(duì)菌株YJY-20具有較強(qiáng)的拮抗效果，抑制率分別為59.76%和50.63%；且經(jīng)50～100°℃處理后仍具有拮抗能力，與Ran等（2020）報(bào)道的多粘類芽孢桿菌7F1的抗菌蛋白在60～90°℃下對(duì)小麥赤霉病菌仍具有拮抗作用的結(jié)果相似。此外，2株拮抗菌DMGSMG4和QZM1的脂肽類物質(zhì)粗提物對(duì)菌株YJY-20也具有較強(qiáng)的拮抗效果，抑制率分別為50.07%和45.03%，與楊瑞先等（2015）報(bào)道解淀粉芽孢桿菌Md31和Md33的脂肽類物質(zhì)粗提物能抑制牡丹炭疽病菌、牡丹灰霉病菌和牡丹黑斑病菌等病原真菌生長的結(jié)果相似。基于以上研究，推斷2株拮抗菌的抑菌物質(zhì)可能是某些脂肽類物質(zhì)或耐高溫抗菌蛋白。

常見脂肽類抑菌物質(zhì)包括枯草菌素（Subtilin）、伊枯草菌素（Iturins）、桿菌肽（Bacitracin）、豐原素（Fengycin）和表面活性素（surfactin）等（Cameotra andMakkar，2004;Wang et al.，2007;彭啟超等，2022）。本研究利用5對(duì)特異性引物對(duì)拮抗菌DMGSMG4和QZM1脂肽類抑菌物質(zhì)合成關(guān)鍵基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)2株拮抗菌的基因組中均能擴(kuò)增出豐原素、細(xì)菌素和表面活性素等脂肽抑菌物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因；與楊瑞先等（2015）報(bào)道的拮抗菌Md31和Md33中擴(kuò)增到5個(gè)脂肽類物質(zhì)基因簇片段、賀旭等（2023）報(bào)道的從拮抗菌FX1的基因組中擴(kuò)增出8個(gè)參與脂肽類物質(zhì)合成相關(guān)基因的結(jié)果相似。這些關(guān)鍵基因常被用于檢測以上脂肽類抑菌物質(zhì)，由此表明2株拮抗菌具有合成抗菌脂肽類物質(zhì)的潛能。但本研究僅對(duì)2株拮抗菌的抑菌物質(zhì)進(jìn)行初步探究，具體是哪種抑菌物質(zhì)后續(xù)還需進(jìn)一步純化鑒定；此外，針對(duì)2株拮抗菌的抑菌機(jī)理及其在植株上定殖能力有待深入研究。掌握2株拮抗菌的抑菌機(jī)理，有利于充分發(fā)揮其生防作用和應(yīng)用價(jià)值。

4結(jié)論

從薔薇屬植物葉片中分離篩選出2株對(duì)炭疽病病原菌YJY-20具有較強(qiáng)拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌DMGSMG4和QZM1，經(jīng)鑒定分別為解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌，且2株菌株對(duì)供試12種植物病原真菌也具有較強(qiáng)的抑制效果，抑菌譜較廣。菌株DMGSMG4和QZM1具有作為月季炭疽病生防菌株的潛力。

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