摘要：【目的】探索胰島素樣生長(zhǎng)因子2基因（IGF2）和胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體基因（IGF2R）在中華鱉生長(zhǎng)過程中發(fā)揮的作用，為揭示IGFs系統(tǒng)在中華鱉異速生長(zhǎng)及兩性生長(zhǎng)差異中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎肦ACE克隆中 華鱉IGF2和IGF2R基因cDNA序列，利用BioEdit、ExPASy、TMHMM Server v2.0、SignalP及SMART等在線軟件進(jìn)行 生物信息學(xué)分析，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析IGF2和IGF2R基因在雌雄中華鱉不同組織、不同表型及不同性類固醇激素處理下的表達(dá)變化?！窘Y(jié)果】中華鱉IGF2基因cDNA序列全長(zhǎng)1180bp，共編碼222個(gè)氨基酸殘基；IGF2蛋白相對(duì) 分子量為24.84kD，理論等電點(diǎn)（pI）為9.00，屬于跨膜蛋白，含有1個(gè)IIGF結(jié)構(gòu)域。中華鱉IGF2R基因cDNA序列全長(zhǎng)8765bp，共編碼2443個(gè)氨基酸殘基；IGF2R蛋白相對(duì)分子量為271.92 kD，pI為5.64，屬于跨膜蛋白，含有14個(gè)重復(fù)的CIMR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)FN2結(jié)構(gòu)域?；贗GF2和IGF2R氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹均顯示，中華鱉與龜鱉類的親緣關(guān)系最近，與魚類和兩棲動(dòng)物的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。IGF2和IGF2R基因在中華鱉體內(nèi)具有廣泛的組織表達(dá)譜，IGF2基因在精巢中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵巢（Plt;0.05，下同），IGF2R基因則恰好相反。IGF2基因在成年中華鱉生長(zhǎng)快個(gè)體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于生長(zhǎng)慢個(gè)體，IGF2R基因的表達(dá)模式則相反。在雌二醇（E2）處理下，除雌性中華鱉肝臟中的IGF2R基因相對(duì)表達(dá)量在注射6h時(shí)顯著升高外，IGF2和IGF2R基因在雌雄個(gè)體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量整體上呈下降趨勢(shì)；MT處理對(duì)雄性個(gè)體肝臟中IGF2基因的表達(dá)無顯著影響（Pgt;0.05），但在注射48h后顯著提高雌性個(gè)體肝臟中的IGF2基因相對(duì)表達(dá)量，且顯著下調(diào)雌性中華鱉肝臟中的IGF2R基因相對(duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)論】IGF2和IGF2R基因參與調(diào)控中華鱉性腺的發(fā)育及成熟，且IGF2R可能通過內(nèi)化降解IGF2而對(duì)中華鱉的生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用。此外，IGF2和IGF2R基因會(huì)通過下調(diào)表達(dá)量來響應(yīng)外源激素的刺激，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)中華鱉生長(zhǎng)的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：中華鱉；IGF2基因；IGF2R基因；生長(zhǎng)差異；性類固醇激素

文章編號(hào)：2095-1191（2024）04-1181-13

中圖分類號(hào)：S966.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning and functional analysis of IGF2 and IGF2R genes in Chinese soft-shelled turtle （Pelodiscus sinensis）

ZENG Dan1.2， LI Lin1， YAN Feng1， CHEN Xin-cheng1， WU Cheng-yao1， LI Jing-jing1，TU Yang-yang1， WANG Xiao-qing3*

（1College of Life and Environmental Sciences， Hunan University of Arts and Science， Changde， Hunan 415000， China; 2Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries/Hunan Engineering

Research Center of Aquatic Organism Resources and Environmental Ecology/Changde ResearchCenter for Agricultural Biomacromolecule， Changde， Hunan 415000， China; 3Fisheries College，Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China）

Abstract：【Objective】To explore the role of insulin-like growth factor 2 gene （IGF2） and insulin-like growth factor 2 receptor gene （IGF2R） in the growth of Pelodiscus sinensis， and to lay a foundation for revealing the mechanism of IGFssystem in the allometric growth and sexual growth difference of P. sinensis. 【Method】The cDNA sequences of IGF2 and IGF2R genes in P. sinensis were cloned by RACE. Bioinformatics analysis was performed using online softwares such as BioEdit， ExPASy， TMHMM Server v2.0， SignalP and SMART. The expression changes of IGF2 and IGF2R genes in dif- ferent tissues， different phenotypes and different sex steroid hormones of male and female P. sinensis were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The total length of the cDNA sequence of IGF2 gene was 1180 bp， en- coding 222 amino acid residues. IGF2 protein， with a relative molecular weight of 24.84 kD and theoretical isoelectric point （pI） of 9.00， was a transmembrane protein and contained one IIGF domain. The total length of the cDNA sequence of IGF2R gene was 8765 bp， encoding 2443 amino acid residues. IGF2R protein had a relative molecular weight of 271.92 kD and a pI of 5.64. It was a transmembrane protein with fourteen repeated CIMR domains and one FN2 domain.Phylogenetic trees based on IGF2 and IGF2R amino acid sequence similarity showed that P. sinensis was most closely related to tortoises and far from fish and amphibians. IGF2 and IGF2R genes had a wide tissue expression profile in P. sinensis. The relative expression of the IGF2 gene in testis was significantly higher than that in the ovary （Plt;0.05， the same below）， while the situation was the opposite for IGF2R gene. The relative expression of IGF2 gene in the liver of fast growing P. sinensis individuals was significantly higher than that in the slow-growing individuals， while the expression pattern of IGF2R gene was the opposite. Under estradiol（E2） treatment， except that the relative expression of IGF2R gene in the liver of female P. sinensis was significantly increased at 6 h after injection， the relative expression of IGF2 and IGF2R genes in the liver of male and female P. sinensis were decreased on the whole. MT treatment had no significant effect on IGF2 gene expression in male P. sinensis liver （Pgt;0.05）， but significantly increased the relative expression of IGF2 gene in female P. sinensis liver 48 h after injection， and significantly decreased the relative expression of IGF2R gene in female P. sinensis liver. 【Conclusion ]IGF2 and IGF2R genes are involved in the regulation of the gonad develop- ment and maturation of P. sinensis， and IGF2R may negatively regulate the growth of P. sinensis by internalizing and de- grading IGF2. In addition， IGF2 and IGF2R genes regulate the growth of P. sinensis by down-regulating their expres- sion levels in response to exogenous hormone stimulation.

Key words： Pelodiscus sinensis; IGF2 gene; IGF2R gene; growth difference; sex steroid hormone

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （31672640） ; Rural Science and Technology Special Correspodent Serving Rural Revitalization Project of Hunan Innovation Platform and Talent Plan （2022NK4150） ; Science Research Project of Hunan Education Department （22C0385） ; Doctoral Start-up Project of Hunan University of Arts and Sciences（21BSQD12）

0 引言

【研究意義】中華鱉（Pelodiscus sinensis）俗稱甲 魚、團(tuán)魚等，屬于以肺呼吸的水陸兩棲爬行動(dòng)物。 21世紀(jì)初，鱉類養(yǎng)殖業(yè)得到迅速發(fā)展，2022年的年 產(chǎn)量已達(dá)37.37萬t（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等， 2023），成為我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。生長(zhǎng)性能是水產(chǎn)養(yǎng)殖品種選育首要關(guān)注的目標(biāo)性狀，也是 進(jìn)行遺傳改良最有價(jià)值的經(jīng)濟(jì)性狀之一。除個(gè)體間 的生長(zhǎng)差異外，中華鱉還存在明顯的兩性生長(zhǎng)差異， 即在相同養(yǎng)殖條件下，雄鱉較雌鱉生長(zhǎng)快25%～30% （楊振才等，1999）。兩性生長(zhǎng)差異給水產(chǎn)養(yǎng)殖及品 種改良研究帶來新的切入點(diǎn)：（1）通過發(fā)展性別控制 技術(shù)能實(shí)現(xiàn)單性養(yǎng)殖，有效提高養(yǎng)殖產(chǎn)量；（2）可致 力于解析異速生長(zhǎng)和兩性生長(zhǎng)差異的形成機(jī)制與分 子基礎(chǔ)，進(jìn)而發(fā)展針對(duì)性的生長(zhǎng)控制技術(shù)，為科學(xué)指 導(dǎo)育種提供新思路。因此，開展兩性生長(zhǎng)差異研究 可為中華鱉遺傳育種、品種改良及健康養(yǎng)殖提供科 學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，有關(guān)中華鱉的研究 主要集中在養(yǎng)殖模式（Li et al.，2016;Zhang et al.，2017）、營(yíng)養(yǎng)調(diào)控（Sun et al.，2018a，2018b）、免疫抗 ?。↙yu et al.，2020;Zhou et al.，2023）及性別決定與 分化機(jī)制（Zhou et al.，2022;Lei et al.，2023）等方面，而針對(duì)其發(fā)育生長(zhǎng)的分子調(diào)控機(jī)制，特別是兩性生長(zhǎng)差異的研究相對(duì)較少。胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growth factors，IGFs）系統(tǒng)在調(diào)控動(dòng)物的發(fā)育、生長(zhǎng)和代謝，以及細(xì)胞增殖、存活、遷移和分化等過程中發(fā)揮重要作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF2）是IGFs系統(tǒng)的重要成員之一（Sélénou ct al.，2022），通過與IGF1受體（IGF1R）結(jié)合而激活下游磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/PKB）途徑和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，有效將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)（楊偉杰等，2022）。另一種受體——IGF2受體（IGF2R），也稱為非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體，是一種無酪氨酸激酶活性的單鏈蛋白，也能特異性結(jié)合IGF2（Brown et al.，2008）。IGF2R是跨膜二聚體，其胞外結(jié)構(gòu)域由1個(gè)與纖連蛋白膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源的小區(qū)域和15個(gè)重復(fù)序列組成，其中1個(gè)重復(fù)序列介導(dǎo)其與IGF2結(jié)合（Morgan et al.，1987）。IGF2R通過內(nèi)化降解細(xì)胞外的IGF2，達(dá)到抑制IGF2的促細(xì)胞分裂作用（Ghoshet al.，2003）。有研究表明，IGF2R基因缺失小鼠的血清IGF2水平較正常小鼠明顯上升，小鼠胎兒體細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的增速（Brown et al.，2009）。此外，IGF2R還是重要的抑癌因子（Lemany et al.，2016），在哺乳動(dòng)物中主要扮演生長(zhǎng)抑制因子的角色（Schwartz and Bronikowski，2016），但在爬行動(dòng)物中的功能尚未明確。[本研究切入點(diǎn)]IGFs是調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，其表達(dá)水平與動(dòng)物生長(zhǎng)密切相關(guān)。IGFs基因表達(dá)性別偏向可能對(duì)動(dòng)物性別二態(tài)性的發(fā)育和進(jìn)化起重要促進(jìn)作用（岳蒙蒙，2017），因此，明確IGF2 和IGF2R基因在中華鱉生長(zhǎng)及兩性生長(zhǎng)差異中扮演的角色，可為解析中華鱉異速生長(zhǎng)和兩性生長(zhǎng)差異的形成機(jī)制提供理論依據(jù)。[擬解決的關(guān)鍵問題]克隆中華鱉IGF2和IGF2R基因 cDNA全長(zhǎng)序列，通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè) 2 個(gè)基因在雌雄中華鱉不同組織、不同表型及不同性類固醇激素處理下的表達(dá)變化，探索IGF2 和IGF2R基因在中華鱉生長(zhǎng)過程中發(fā)揮的作用，為揭示IGFs系統(tǒng)在中華鱉異速生長(zhǎng)及兩性生長(zhǎng)差異中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試中華鱉由常德河洲水產(chǎn)有限公司提供，挑 選無損傷、體質(zhì)健康的成年鱉和稚鱉。動(dòng)物試驗(yàn) 由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)HUAS- 2020-0012。（1）組織表達(dá)譜檢測(cè)取樣：取成年鱉的肌 肉、腸道、肝臟、性腺、腎臟、脾臟、垂體、心臟及肺臟 等組織樣品，經(jīng)液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)?用。（2）差異生長(zhǎng)個(gè)體取樣：同批次孵化同池養(yǎng)殖，在 幼鱉期和成鱉期時(shí)分別選取生長(zhǎng)差異顯著的中華鱉 個(gè)體各5只（表1），解剖后取其肝臟組織，液氮速凍 后置于-80℃冰箱保存。（3）性類固醇激素處理試 驗(yàn)：設(shè)甲基睪丸酮（17a-Methyltestosterone，MT）組和 雌二醇（Estradiol，E2）組，每組45只中華鱉（平均體質(zhì)量35.42±14.25g）。取15mgMT和15mgE2分別溶于0.5mL無水乙醇，加入4.5mL橄欖油稀釋，4℃ 避光保存。注射前禁食1周，自由飲水。通過后肢 大腿部肌肉注射，每只中華鱉約注射0.1mL配制的 試劑，注射后自由飲水，不喂食。于注射后0、6、12、 24和48h，分別剖檢采集MT組及E2組稚鱉的肝臟 組織樣品，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫煌?時(shí)剪取裙邊組織，參照FastPure Cell/Tissue DNA Iso-lation Mini Kit（DC102）說明提取中華鱉基因組DNA，采用性別特異分子標(biāo)記進(jìn)行性別鑒定（曾丹 等，2022）。

1.2中華鱉IGF2和IGF2R基因克隆

參照E.Z.N.A.?Total RNA Kit IⅡ（OMEGA）使用說明提取各組織總RNA，分別以1.5%瓊脂糖凝膠電泳和超微量檢測(cè)儀（BioSpectrometer）檢測(cè)各組織總RNA的質(zhì)量和完整性，并根據(jù)RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）使用說明合成cDNA第一鏈。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和公共數(shù)據(jù)庫其他物種的IGF2R基因序列信息，利用Primer Premier6.0設(shè)計(jì)IGF2R基因中間片段的擴(kuò)增引物（表2）；再根據(jù)PCR擴(kuò)增獲得的中間片段設(shè)計(jì)5'-RACE和3'-RACE擴(kuò)增引物（表2），參照SMARTer?RACE5/3'Kit（TaKaRa）試劑盒說明完成5'-RACE和3'-RACE擴(kuò)增。所有引物均委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收及連接轉(zhuǎn)化后，挑選陽性克隆送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)SeqMan拼接，即獲得IGF2和IGF2R基因CDNA全長(zhǎng)序列。

1.3中華鱉IGF2和IGF2R基因生物信息學(xué)分析

利用 NCBI 的 ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）檢索目的基因開放閱讀框（ORF），并預(yù)測(cè)其推導(dǎo)氨基酸序列;獲得的氨基酸序列與NCBI 中已公布物種的相關(guān)氨基酸序列進(jìn)行BLASTp同源比對(duì)分析;利用BioEdit分析編碼蛋白理化性質(zhì)，包括分子量、理論等電點(diǎn)（pI）及氨基酸組成;通過ExPASy預(yù)測(cè)蛋白親/疏水性;使用TMHMMServer v2.0 預(yù)測(cè)蛋白序列跨膜結(jié)構(gòu);采用 SignalP 預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽;運(yùn)用SMART預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域;通過MEGA 11.0分析中華鱉IGF2 和IGF2R氨基酸序列同源性，并以鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Bootstrap設(shè)為1000次）。

1.4中華鱉IGF2和 IGF2R基因表達(dá)分析

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)檢測(cè)IGF2和IGF2R基因表達(dá)的特異性引物（表2）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系10.0μL：cDNA模板1.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.25μL，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 5.0 uL，Deionized H2O 3.5 uL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃10s，58℃10s，72℃10s（延伸完成檢測(cè)熒光信號(hào)）。為判斷擴(kuò)增產(chǎn)物專一性，是否含有引物二聚體，在擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，從65 C以 0.5 °℃/5 s的速率升至95 C。以GAPDH為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，并利用2-Ma法計(jì)算 IGF2和IGF2R基因的相對(duì)表達(dá)量。采用 SPSS 22.0 對(duì)目的基因在不同組織、不同表型及不同性類固醇激素處理下的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），通過Duncan’s 多重比較進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，最后使用GraphPad Prism 8.0制圖。

2結(jié)果與分析

2.1中華鱉IGF2 和IGF2R基因序列分析結(jié)果

中華鱉IGF2基因 cDNA序列（GenBank登錄號(hào)MH807577）全長(zhǎng)1180bp，包含669 bp的ORF、232 bp的5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）和279bp的3'端非編碼區(qū)（3'-UTR），且3'-UTR含有21 bp的poly（A）尾；共編碼222個(gè)氨基酸殘基。中華鱉IGF2蛋白相對(duì)分子量為24.84kD，pI為9.00，屬于跨膜蛋白，含有1個(gè)IIGF結(jié)構(gòu)域（位于第65～120位氨基酸處）。中華鱉IGF2成熟肽包含68個(gè)氨基酸，由B-C-A-D4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。多序列比對(duì)分析結(jié)果（圖1）顯示，B-C-A-D4個(gè)結(jié)構(gòu)域在不同物種間的相似性較高，包含6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，通過形成二硫鍵以加固蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)，維持蛋白穩(wěn)定性。位于A和B結(jié)構(gòu)域的IGF1R識(shí)別序列和結(jié)合蛋白識(shí)別位點(diǎn)在所有脊椎動(dòng)物中高度保守，但位于A結(jié)構(gòu)域的IGF2R結(jié)合位 點(diǎn)在兩棲動(dòng)物和魚類中的保守性較差。多序列比對(duì) 分析結(jié)果還顯示，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)的SERD 基序僅在兩棲動(dòng)物中存在差別，在其他物種中則高 度保守；另一酪蛋白激酶IⅡ磷酸化位點(diǎn)的SKYD基 序在爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚類中的保守性均高于鳥 類和哺乳動(dòng)物。

中華鱉IGF2R基因cDNA序列（GenBank登錄號(hào)MW876202）全長(zhǎng)8765bp，包含7332 bp的ORF、134 bp的5'-UTR和1299bp的3'-UTR，3'-UTR含有28 bp的poly（A）尾，且在其上游（17bp）處存在1個(gè)典型的多腺苷酸化信號(hào)序列AATAAA。中華鱉IGF2R基因編碼2443個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白相對(duì)分子量為271.92kD，pI為5.64，屬于跨膜蛋白，含有14個(gè)重復(fù)的CIMR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)FN2結(jié)構(gòu)域。將中華鱉IGF2R氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的IGF2R氨基 酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果（圖2）顯示，中華鱉 IGF2R氨基酸序列中每個(gè)CIMR結(jié)構(gòu)域均含有6～ 8個(gè)位置保守的半胱氨酸殘基，表明中華鱉IGF2R蛋白結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中具有一定的保守性，但 CIMR結(jié)構(gòu)域中的其他序列在不同物種間存在明顯 差異。中華鱉IGF2R氨基酸序列與爬行動(dòng)物和鳥類的IGF2R氨基酸序列相似性較高，與哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物和魚類的相似性相對(duì)較低，暗示IGF2R在中華 鱉等爬行動(dòng)物中的生理功能可能更接近于鳥類。

2.2中華鱉IGF2和IGF2R蛋白多序列比對(duì)及系統(tǒng) 進(jìn)化分析結(jié)果

將NCBI已公布多個(gè)物種的IGF2氨基酸序列與 中華鱉IGF2氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果（表3）顯示，中華鱉與棱皮龜（Dermochelys coriacea）的IGF2氨基酸序列相似性最高，達(dá)91.44%；其次是平胸龜（Platysternon megacephalum），為90.09%;與 密西西比鱷（Alligator mississippiensis）和原雞（Gal- lus gallus）的相似性分別為85.11%和78.49%；與斑 馬魚（Danio rerio）的相似性最低，僅50.78%?；?IGF2氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 （圖3）顯示，中華鱉先與同為龜鱉目的棱皮龜和平 胸龜聚為一小分支，再與鱷目、鳥綱的物種聚類在一 起，最后與爬行動(dòng)物、兩棲綱的非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）及哺乳動(dòng)物匯聚成一分支；而鯽（Caras-sius auratus）和斑馬魚在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中聚為另 一分支。

在NCBI中搜索硬骨魚綱、兩棲綱、爬行綱、鳥綱及哺乳綱中代表物種的IGF2R氨基酸序列，與中華鱉IGF2R氨基酸進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果（表4）發(fā)現(xiàn)，中華鱉IGF2R氨基酸序列與三趾箱龜（Terra- pene carolina triunguis）IGF2R氨基酸序列的相似 性最高（87.71%）;其次是紅耳龜（Trachemys scripta elegans）和黃喉擬水龜（Mauremys mutica），對(duì)應(yīng)的 IGF2R氨基酸序列相似性分別為87.51%和87.10%；與揚(yáng)子鱷（A.sinensis）、原雞的IGF2R氨基酸序列相 似性分別為78.06%和74.80%；與硬骨魚類的相似性相對(duì)較低，其中與青鳉（Oryzias latipes）的IGF2R 氨基酸序列相似性僅為48.99%。基于16個(gè)物種的 IGF2R氨基酸序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié) 果（圖4）顯示，中華鱉與龜鱉目動(dòng)物的親緣關(guān)系最 近，在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中聚為一小分支，其次與揚(yáng)子 鱷、虎皮鸚鵡（Melopsittacus undulatus）、原雞、響尾 蛇（Crotalus tigris）、大陸虎蛇（Notechis scutatus）的 親緣關(guān)系較近，再與以家鼠（Mus musculus）、人類 （Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、豬（Sus scrofa）為代表的哺乳動(dòng)物聚類在一起，最后與非洲爪蟾匯聚成一分支；青鳉、斑馬魚、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中則聚為另一分支。

2.3中華鱉IGF2和IGF2R基因的組織特異性表達(dá) 分析結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IGF2基因在成年 中華鱉各組織（心臟、肝臟、腸道、垂體、肌肉、卵巢、精 巢、腎臟、肺臟和脾臟）中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖5-A）顯示，IGF2基因在檢測(cè)的10個(gè)組織中均有表達(dá)，以 精巢中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他組織中的 相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.05，下同）；其次是腎臟、卵巢、肝 臟、肺臟和脾臟；在垂體、心臟、腸道和肌肉組織中的 相對(duì)表達(dá)量較低，顯著低于其他組織中的相對(duì)表達(dá) 量。中華鱉IGF2R基因也具有廣泛的組織表達(dá)譜（圖5-B）），在檢測(cè)的10個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)。IGF2R基因在性腺中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其 他組織中的相對(duì)表達(dá)量，且在卵巢中的相對(duì)表達(dá)量 顯著高于精巢；在肌肉和心臟中的相對(duì)表達(dá)量較低， 二者間的差異不顯著（Pgt;0.05，下同）。

2.4中華鱉IGF2和IGF2R基因在差異生長(zhǎng)個(gè)體 肝臟中的表達(dá)情況

為探索IGF2和IGF2R基因在中華鱉生長(zhǎng)過程 中的作用，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IGF2和

IGF2R基因在中華鱉不同生長(zhǎng)時(shí)期[成年鱉（3齡） 和稚鱉（1齡）]不同表型個(gè)體間的表達(dá)模式。由圖6 可看出，中華鱉IGF2和IGF2R基因相對(duì)表達(dá)量在稚 鱉期的差異生長(zhǎng)個(gè)體間無顯著差異。在成年鱉期，IGF2基因在雌雄性快生長(zhǎng)個(gè)體肝臟中的相對(duì)表達(dá) 量均顯著高于慢生長(zhǎng)個(gè)體，表明IGF2基因表達(dá)水平 與中華鱉的快速生長(zhǎng)呈正相關(guān)；IGF2R基因的表達(dá) 模式與IGF2基因相反，即IGF2R基因在雌雄性快 生長(zhǎng)個(gè)體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于慢生長(zhǎng)個(gè)體，提示其高表達(dá)水平可能與中華鱉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)。

2.5中華鱉IGF2 和 IGF2R基因在性類固醇激素處理后的表達(dá)變化

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中華鱉IGF2 和IGF2R基因在不同性類固醇激素處理0、6、12、24和48h后雌雄個(gè)體肝臟中的表達(dá)變化，結(jié)果（圖7）表明，注射E2后，除雌性個(gè)體肝臟中的IGF2R基因相對(duì)表達(dá)量在注射6h時(shí)顯著升高外，IGF2和IGF2R基因在雌雄性個(gè)體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量整體上呈下降趨勢(shì)，但至注射48h后雄性個(gè)體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量回升到注射前水平；注射MT對(duì)雄性中華鱉肝臟中的IGF2基因相對(duì)表達(dá)量影響不顯著，但至注射48h后能顯著提高雌性個(gè)體肝臟中的IGF2基因相對(duì)表達(dá)量，IGF2R基因則表現(xiàn)為注射MT后雌雄性個(gè)體肝臟中的相對(duì)表達(dá)量均低于注射前。

3討論

IGFs是一類保守的單鏈多肽，在調(diào)控脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用（Ndandala et al.，2022）。與哺乳動(dòng)物相比，爬行動(dòng)物的生長(zhǎng)會(huì)持續(xù)到成年期之后，暗示這些生長(zhǎng)因子在爬行動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用模式可能更特殊（Beatty and Schwartz，2020）。本研究從中華鱉肝臟中成功克隆出IGF2和IGF2R基因的cDNA序列，二者分別編碼222和2443個(gè)氨基酸殘基。多序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，中華鱉IGF2和IGF2R氨基酸序列中的半胱氨酸高度保守且位置相似，說明IGF2和IGF2R蛋白結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中高度保守。IGFs系統(tǒng)基因正在物種間快速進(jìn)化，有些因子顯示出廣泛的核苷酸變異，說明其功能作用可能在不同群體中存在差異（SchwartzandBronikowski，2016）。中華鱉IGF2含有保守的IGF1R識(shí)別序列和結(jié)合蛋白識(shí)別位點(diǎn)，但I(xiàn)GF2R結(jié)合位點(diǎn)在兩棲動(dòng)物和魚類中的保守性較差。因此，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步對(duì)中華鱉IGF2和IGF2R進(jìn)行建模分析，探索二者間是否也存在結(jié)合關(guān)系，并對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。在物種進(jìn)化上，龜鱉類有著漫長(zhǎng)的演化歷史，是形態(tài)學(xué)上最特化的爬行動(dòng)物之一。基于IGF2和IGF2R氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹均顯示，中華鱉與龜鱉類的親緣關(guān)系最近，其次為鱷類、鳥類和蛇類，與魚類和兩棲動(dòng)物的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。這與各物種在分類學(xué)的地位基本吻合，且與物種起源的進(jìn)化地位相一致，其研究結(jié)果支持龜鱉類可能是鱷類和鳥類共同祖先姐妹群的假說（Wang et al.，2013）。

IGF2和IGF2R是影響動(dòng)物胚胎發(fā)育和個(gè)體生長(zhǎng)的重要因子。IGF2基因表達(dá)不受生長(zhǎng)激素（Growthhormone，GH）的調(diào)控，且在不同物種中的表達(dá)模式存在差異（Annunziata et al.，2011）。在嚙齒動(dòng)物中的研究表明，IGF2被稱為產(chǎn)前生長(zhǎng)因子，僅在胚胎發(fā)育期間表達(dá)（Constancia et al.，2002）。相比之下，在人類的整個(gè)生命周期中均能檢測(cè)到IGF2基因表達(dá)（Fagerberg et al.，2014）。McGaugh等（2015）對(duì)爬行動(dòng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)美洲短吻鱷（A.mississippiensis）等14種爬行動(dòng)物在出生后均能檢測(cè)到IGF2基因表達(dá)。此外，鳥類、魚類和兩棲動(dòng)物的代表性物種同樣發(fā)現(xiàn)在成年期的多個(gè)組織中存在IGF2基因表達(dá)（Rotwein，2018）。IGF2R基因表達(dá)存在一定的組織特異性，在南江黃羊肺臟中IGF2R基因表達(dá)量極低，在肝臟中的表達(dá)量呈中等水平，動(dòng)物肌肉組織和肌細(xì)胞中則處于較高水平表達(dá)（占思遠(yuǎn)等，2019）。目前，關(guān)于IGF2和IGF2R的研究主要集中在哺乳動(dòng)物上，針對(duì)爬行動(dòng)物，尤其是龜鱉類則鮮見報(bào)道。在哺乳動(dòng)物中，與遺傳印記使母體IGF2和IGF2R等位基因沉默相比，現(xiàn)有基于雞、蛇和蜥蜴的研究顯示爬行動(dòng)物的IGF2和IGF2R是雙等位基因表達(dá)（Beatty and Schwartz，2020）。本研究結(jié)果顯示，IGF2和IGF2R基因在中華鱉體內(nèi)具有廣泛的組織表達(dá)譜，與在其他物種（Nipkow et al.，2018；韋云芳等，2022）上的研究結(jié)果相似，故推測(cè)IGF2和IGF2R基因參與調(diào)控中華鱉多種組織細(xì)胞的生命過程。IGFs是生長(zhǎng)軸和生殖軸相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因，在魚類中的研究證實(shí)IGFs在其生殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用，IGF2可能以自分泌調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和旁分泌調(diào)節(jié)等多種方式調(diào)控性腺的發(fā)育及成熟（Nelsonand van Der Kraak，2010）。本研究在中華鱉性腺組織中檢測(cè)到IGF2和IGF2R基因高表達(dá)，且IGF2基因在中華鱉精巢中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵巢中的相對(duì)表達(dá)量，IGF2R基因則恰好相反?？梢?，IGF2R主要與IGF2結(jié)合，對(duì)正性生長(zhǎng)基因IGF2的降解起重要作用，說明IGF2和IGF2R基因可能共同參與調(diào)控中華鱉性腺的發(fā)育及成熟。

IGF2是IGFs家族中不可或缺的一員，可通過受體一配體結(jié)合的表達(dá)模式進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而發(fā)揮其生理功能（Bella et al.，2020）。在幼鱉期，IGF2基因的相對(duì)表達(dá)量在中華鱉不同表型間無顯著差異；但在成年鱉中，生長(zhǎng)快個(gè)體肝臟中的IGF2基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于生長(zhǎng)慢個(gè)體。這與易少奎等（2015）在團(tuán)頭魴中的研究結(jié)果相似，在3月齡團(tuán)頭魴生長(zhǎng)差異個(gè)體中IGF2基因表達(dá)量無顯著差異，但在6月齡時(shí)快生長(zhǎng)個(gè)體肝臟中的IGF2基因表達(dá)水平顯著高于慢生長(zhǎng)個(gè)體。由此推測(cè)，IGF2基因在中華鱉不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的調(diào)控機(jī)制存在差異，且在成年鱉表現(xiàn)為促生長(zhǎng)作用。IGF2R可靶向降解IGF2，從而影響胚胎或某些組織器官的大?。╖aina and Squire，1998）。中華鱉慢生長(zhǎng)個(gè)體肝臟中的IGF2R基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于快生長(zhǎng)個(gè)體，說明IGF2R可能是通過降低IGF2含量，而抑制中華鱉的生長(zhǎng)發(fā)育。

中華鱉存在明顯的兩性生長(zhǎng)差異現(xiàn)象，在相同 養(yǎng)殖條件下，雄性個(gè)體比雌性個(gè)體的生長(zhǎng)速度快。 雌雄性個(gè)體生長(zhǎng)差異可能與其體內(nèi)性類固醇激素的 水平關(guān)系密切（高麗麗等，2019）。馬文閣（2016）研 究證實(shí)，黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）兩性生長(zhǎng) 異形可能是雌雄性個(gè)體間性激素調(diào)節(jié)的GH/IGF信號(hào)表達(dá)差異所引起。為探索IGF2和IGF2R基因在 中華鱉兩性生長(zhǎng)差異中扮演的角色，本研究檢測(cè)了 性類固醇激素（E，和MT）處理后IGF2和IGF2R基因在雌雄性中華鱉肝臟中的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在E2處理下，中華鱉肝臟中IGF2和IGF2R基因的相對(duì) 表達(dá)量整體上呈下降趨勢(shì)（除雌性個(gè)體肝臟中的 IGF2R基因在注射6h時(shí)顯著升高外），與馬細(xì)蘭等（2015）對(duì)尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、高丹丹等（2021）對(duì)斑鱧（Channa maculata）的研究結(jié)果相似，即E，能抑制正向生長(zhǎng)因子IGF1和GH的表達(dá)，可能是體內(nèi)較高的雌激素抑制肝臟合成IGFs。外源 激素對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)的影響存在3種不同模式：促進(jìn)、抑 制和無影響。申慧（2019）在性類固醇激素連續(xù)投喂 中華鱉稚鱉的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同濃度E2均表現(xiàn)出對(duì)稚鱉生長(zhǎng)的抑制作用。本研究結(jié)果也顯示，短期注 射E2后，IGF2和IGF2R基因在雌雄中華鱉肝臟中的相對(duì)表達(dá)量整體上呈下降趨勢(shì)，表明IGF2和IGF2R 基因可能通過下調(diào)表達(dá)量來響應(yīng)外源激素的刺激， 進(jìn)而抑制稚鱉的生長(zhǎng)，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一 步探究。在MT處理下，雄性中華鱉肝臟中的IGF2基因表達(dá)變化不顯著，但在注射48h后顯著提高雌 性中華鱉肝臟中的IGF2基因相對(duì)表達(dá)量，且顯著下調(diào)雌雄中華鱉肝臟中的IGF2R基因相對(duì)表達(dá)量。鑒于IGF2R基因?qū)GF2基因存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，故推測(cè) MT對(duì)雌雄性中華鱉的生長(zhǎng)調(diào)控功能是通過IGF2和 IGF2R的協(xié)調(diào)配合而實(shí)現(xiàn)，與岳蒙蒙（2017）在尼羅 羅非魚中得到的結(jié)論存在差異，但具體作用機(jī)制還 需聯(lián)合中華鱉血清內(nèi)激素含量變化分析進(jìn)行驗(yàn)證。

4結(jié)論

IGF2和IGF2R基因參與調(diào)控中華鱉性腺的發(fā) 育及成熟，且IGF2R可能通過內(nèi)化降解IGF2而對(duì)中華鱉的生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用。此外，IGF2和IGF2R基 因會(huì)通過下調(diào)表達(dá)量來響應(yīng)外源激素的刺激，進(jìn)而 實(shí)現(xiàn)對(duì)中華鱉生長(zhǎng)的調(diào)控。

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（責(zé)任編輯蘭宗寶）