摘要：【目的】基于iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)篩選不同OsAAP6轉(zhuǎn)基因水稻胚乳的差異蛋白，明確胚乳中的差異蛋白，以期為后續(xù)利用OsAAP6基因提升稻米的營養(yǎng)品質(zhì)提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳运綩sAAP6超量表達(dá)陽性[OX（+）]和陰性 對照[OX（-）]材料及OsAAP6互補表達(dá)陽性[ZpZc（+）]和陰性對照[ZpZc（-）]為試驗材料，采用同位素標(biāo)記相對與絕對定量（iTRAQ）技術(shù)對其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測分析，并利用考馬斯亮藍(lán)G-250法對其胚乳中的4類儲藏蛋白（谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白）進(jìn)行含量檢測?！窘Y(jié)果】與ZpZc（-）和OX（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，ZpZc（+）和OX（+）轉(zhuǎn)基因陽性胚乳中OsAAP6基因的表達(dá)量分別在Plt;0.01和Plt;0.001水平極顯著升高。與ZpZc（-）和OX（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，ZpZc（+）和OX（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻共有58種差異蛋白共同上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，其中有39種蛋白顯著增加（Plt;0.05，下同），有19種蛋白顯著降低。在39種共同上調(diào)表達(dá)的蛋白中有27種蛋白參與水稻種子儲藏底物的合成與積累，且有16種上調(diào)表達(dá)蛋白參與種子儲藏蛋白的代謝和積累。與ZpZc（-）和OX（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，ZpZc（+）和OX（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻胚乳中的谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白含量均顯著增加?！窘Y(jié)論】OsAAP6基 因上調(diào)表達(dá)，能抑制與支鏈淀粉合成相關(guān)蛋白的積累，但能促進(jìn)其胚乳中儲藏蛋白的積累，進(jìn)而提高胚乳中谷蛋白、 醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白含量，可用于高蛋白水稻新品種的分子育種和遺傳改良。

關(guān)鍵詞：水稻；iTRAQ；蛋白質(zhì)組學(xué)；OsAAP6基因；差異蛋白；營養(yǎng)品質(zhì)

中圖分類號：S511.035.3

文章編號：2095-1191（2024）04-1060-10

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Screening differential proteins in OsAAP6 different transgenic rice endosperms based on iTRAQ proteomics

PENG Bo1， SUN Xiao-yu1， QIU Jing1， PENG Juan2， ZHAO Qiang3， SUN Yan-fang1， SONG Xiao-hua4， ZHANG Zhi-guo5， ZHOU Wei1， WANG Quan-xiu1*

（1College of Life Sciences， Xinyang Normal University/Dabie Mountain Agricultural Biological Resource Protection and Utilization Research Institute， Xinyang， Henan 464000， China; 2Xinyang Plant Protection and Inspection Station， Xinyang， Henan 464000， China; 3Henan Scientific Research Platform Service Center， Zhengzhou， Henan 450003， China;4Xinyang Academy of Agricultural Sciences， Xinyang， Henan 464000， China; 5Henan Lingrui PharmaceuticalCompany Limited， Xinyang， Henan 465550， China）

Abstract：【Objective】The purpose of the study was to screen the differential proteins in the endosperm of different OsAAP6 transgenic rice based on iTRAQ proteomics， and to clarify the differential proteins in the endosperm， in a bid to provide a theoretical basis for the future use of the OsAAP6 gene to enhance the nutritional quality of rice. 【Method】Using rice OsAAP6 overexpression positive [OX（+）] and negative control [OX（-）] materials， as well as OsAAP6 complemen-tary expression positive [ZpZc （+）] and negative control [ZpZc（-）] experimental materials， the isotope marker relative and absolute quantification （iTRAQ） technology was used for proteomic detection and analysis. And the contents of four types of storage proteins （gluten， gliadin， albumin and globulin） in its endosperm was detected using the Coomassie brilliant blue G-250 method. 【Result]Compared with the ZpZc （-） and OX（-） transgenic negative control， the expression of OsAAP6 gene in ZpZc（+） and OX（+） transgenic positive endosperm was extremely significantly increased at Plt;0.01 and Plt;0.001 levels， respectively. Compared with the ZpZc（-） and OX（-） transgenic negative control， a total of 58 differen- tial proteins were simultaneously up-regulated or down-regulated for expression in ZpZc（+） and OX（+） transgenic posi- tive rice， of which 39 proteins significantly increased （Plt;0.05， the same below）， and 19 proteins significantly decreased.Among the 39 co-up-regulated proteins， 27 proteins were involved in the synthesis and accumulation of rice seed storage substrates， and 16 up-regulated proteins were involved in the metabolism and accumulation of seed storage proteins.Compared with the ZpZc（-） and OX（-） transgenic negative control， the content of glutelin， gliadin， albumin and globulin in the endosperm of ZpZc （+） and OX（+） transgenic positive rice was significantly increased. 【Conclusion】 Up- regulation of the OsAAP6 gene expression can inhibit the accumulation of proteins related to amylopectin synthesis， but promote the accumulation of storage proteins in the endosperm， thereby increasing the content of gluten， gliadin， albu- min and globulin in the endosperm. It can be used for molecular breeding and genetic improvement of new high protein rice varieties.

Key words： rice; iTRAQ; proteomics; OsAAP6 gene; differential proteins; nutritional quality

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （U2004141） ; Henan Science and Technology Re-search Project （222102110141，222102110115，212102110249）

0 引言

【研究意義]水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的糧食作物之一，我國有超過三分之二的人口以稻米為主食（Tian et al.，2009；彭波等，2023）。稻米富含優(yōu)質(zhì)蛋白，是人們能量及營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源（Peng et al.，2021），故改良并提升稻米營養(yǎng)品質(zhì)對改善人類自身營養(yǎng)與健康具有重要作用。利用圖位克隆策略，從水稻基因組中分離克隆到1個正向調(diào)控其種子蛋白質(zhì)含量且對其稻米營養(yǎng)品質(zhì)具有提升作用的氨基酸透性酶基因OsAAP6，其高效表達(dá)有利于提高水稻籽粒中總氨基酸含量（gt;6.0mg/g）、總必需氨基酸含量（gt;5.2mg/g）和蛋白質(zhì)含量（＞5.5mg/g），進(jìn)而提升其稻米的營養(yǎng)品質(zhì)（Peng et al.，2014；彭波等，2019）。但OsAAP6基因?qū)Σ煌瑑Σ乇磉_(dá)蛋白的積累及其分子調(diào)控機制尚不清楚。因此，針對水稻重要的品質(zhì)性狀基因OsAAP6，利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)和考馬斯亮藍(lán)G-250法對OsAAP6轉(zhuǎn)基因稻米胚乳蛋白進(jìn)行定量和定性檢測，揭示OsAAP6轉(zhuǎn)基因稻米中的差異蛋白，對全面闡明OsAAP6基因的生物學(xué)功能及開展高營養(yǎng)品質(zhì)水稻新品種的分子育種具有重要意義和潛在應(yīng)用價值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著經(jīng)濟(jì)社會的持續(xù)發(fā)展，人們生活質(zhì)量不斷提升，對優(yōu)質(zhì)稻米的需求將會持續(xù)增加（羅同平等，2023;Sung et al.，2023）。稻米的品質(zhì)性狀主要包括營養(yǎng)品質(zhì)、研磨加工品質(zhì)、外觀品質(zhì)、安全品質(zhì)、蒸煮與食味品質(zhì)（Li et al.，2018;Peng etal.，2019;Bharali et al.，2022），其中稻米營養(yǎng)品質(zhì)主要取決于水稻種子中的蛋白質(zhì)含量。稻米中的蛋白質(zhì)按溶解性主要分為四大類：溶于稀酸或稀堿的谷蛋白、溶于稀鹽酸的球蛋白、溶于醇與水混合物的醇溶蛋白及溶于水的清蛋白（Shewry and Halford，2006;Zhou et al.，2017;蘭艷等，2019），其中谷蛋白含量最高且最容易被人體消化吸收的蛋白（彭波等，2017；Du et al.，2022）。水稻種子中的蛋白質(zhì)種類與含量不僅是決定其稻米營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)鍵因素，還能影響稻米的其他品質(zhì)性狀，例如稻米的研磨加工品質(zhì)、蒸煮與食味品質(zhì)等（Chen et al.，2018;楊陶陶等，2023）。已有研究表明，水稻種子內(nèi)的氨基酸組成較合理，且必需氨基酸含量相對較多（唐小涵等，2021；高漸飛等，2023）。因此，提高水稻種子內(nèi)的蛋白質(zhì)含量，能有效改善稻米的營養(yǎng)品質(zhì)。水稻種子蛋白質(zhì)含量屬于一個典型的數(shù)量性狀，其遺傳基礎(chǔ)與分子調(diào)控機制相對復(fù)雜，同時外界環(huán)境因素（如氣候條件和營養(yǎng)物質(zhì)等）對水稻種子蛋白質(zhì)含量具有明顯的影響作用（Yang et al.，2019;Long et al.，2023）。水稻中調(diào)控種子蛋白質(zhì)含量的基因通常以基因家族的形式存在，其表達(dá)具有發(fā)育和組織的特異性（Li etal.，2022）。不論是種子中的谷蛋白還是醇溶蛋白，均由多個基因編碼，如水稻種子中編碼谷蛋白的基因家族至少有15個成員，主要分為四大類：A型、B型、C型和D型，故相應(yīng)的谷蛋白也分為4個類型：A型谷蛋白（Glutelin type-A，GluA）、B型谷蛋白（Glute-lin type-B，GluB）、C型谷蛋白（Glutelin type-C，GluC）和D型谷蛋白（Glutelin type-D，GluD），其中A型谷蛋白包括GluA-1、GluA-2、GluA-3和GluA-4，B型谷蛋白包括GluB-1、GluB-2、GluB-3、GluB-4、GluB-5和GluB-6（Chen et al.，2018;Li et al.，2022）。水稻種子中的醇溶蛋白含量僅次于谷蛋白含量，根據(jù)分子量的不同分為3種類型，即10、13和16kD（Chen et al.，2018;Guo et al.，2022）。水稻種子中的球蛋白和清蛋白主要分布于糊粉層，且這2類儲藏蛋白的含量均較低。從水稻中克隆獲得編碼種子中清蛋白（16kDα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑）的基因RAG2（Zhou et al.，2017），其在水稻成熟種子中特異表達(dá)，超表達(dá)或抑制其表達(dá)分別顯著增加或降低種子中蛋白質(zhì)含量和總脂肪含量，同時超表達(dá)RAG2基因能顯著增加水稻籽粒大小。iTRAQ是一種高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在水稻組織、逆境脅迫、亞細(xì)胞水平和激素誘導(dǎo)等方面研究均有應(yīng)用（陳凌華等，2017;Ma et al.，2020），如采用iTRAQ技術(shù)檢測水稻胚胎發(fā)育過程的蛋白質(zhì)組變化，結(jié)果顯示共有867個蛋白發(fā)生了顯著性變化（Ziet al.，2013）；采用iTRAQ技術(shù)對孕穗期、開花期和乳熟期的水稻穎殼進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有563個差異表達(dá)蛋白，主要參與葉綠素的合成途徑（Wang et al.，2015）；利用iTRAQ技術(shù)檢測堊白突變體材料的蛋白組變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)113個與籽粒堊白形成相關(guān)的蛋白，這些差異表達(dá)蛋白主要參與碳水化合物代謝、蛋白合成與降解等過程（Lin et al.，2014）。因此，iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)方法具有檢測范圍廣泛、精度較高、檢測限低、分析結(jié)果可靠等優(yōu)點，為解析水稻胚乳中不同蛋白含量及其4類儲藏蛋白（谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白）含量之間的關(guān)系提供新技術(shù)支持。在水稻基因組中氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因家族有85個成員，分布于水稻的12條染色體上（Zhao et al.，2018），其中，氨基酸透性酶基因亞家族共有19個成員（OsAAPI～OsAAP19），參與調(diào)控水稻的產(chǎn)量及其品質(zhì)等多種生物學(xué)性狀，在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮極其重要的功能。如OsAAP1基因通過增加中性氨基酸的攝取和再分配來改善水稻的生長狀況（Jietal.，2020）；敲除OsAAP3基因能增加水稻的分蘗數(shù)，提高水稻產(chǎn)量（Lu et al.，2018）；OsAAP4基因通過調(diào)節(jié)中性氨基酸分配，提高水稻分蘗數(shù)和產(chǎn)量（Fanget al.，2021）；抑制水稻OsAAP5基因的表達(dá)，能提高水稻產(chǎn)量（Wang et al.，2019）；OsAAP10突變體種子的直鏈淀粉含量與食味值顯著下降（Wang et al.，2020）；OsAAP14基因是調(diào)控水稻分蘗與芽伸長的關(guān)鍵基因（Yang et al.，2022）；OsAAP15是一種響應(yīng)氮濃度的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，在極端氮濃度下有助于提高水稻產(chǎn)量（Yang et al.，2023）。【本研究切入點】本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OsAAP6基因可影響水稻根對多種氨基酸的吸收及其在體內(nèi)不同部位的分布，是水稻種子蛋白質(zhì)含量及其營養(yǎng)品質(zhì)的正向調(diào)節(jié)因子

（Peng et al.，2014;彭波等，2019），但OsAAP6基因是如何精細(xì)調(diào)控稻米胚乳中不同儲藏表達(dá)蛋白積累、胚乳中不同蛋白含量及其4類儲藏蛋白含量的相關(guān)性尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以水稻OsAAP6超量表達(dá)陽性[OX（+）]和陰性對照[OX（-）]材料及OsAAP6互補表達(dá)陽性[ZpZc（+）]和陰性對照[ZpZc（-）]試驗材料，采用iTRAQ技術(shù)和考馬斯亮藍(lán)G-250法對轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行蛋白定量和定性分析，揭示OsAAP6轉(zhuǎn)基因稻米胚乳中的差異蛋白，為后期利用OsAAP6基因提升稻米的營養(yǎng)品質(zhì)提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為本課題組前期（Peng et al.，2014；彭波等，2019）已獲得水稻OsAAP6超量表達(dá)陽性[OX（+）]和陰性對照[OX（-）]材料，OsAAP6互補表達(dá)陽性[ZpZc（+）]和陰性對照[ZpZc（-）]試驗材料。其中，親本材料南洋占為粳稻品種，將來源于珍汕97（種子蛋白質(zhì)含量較高親本）的OsAAP6等位基因轉(zhuǎn)入南洋占（種子蛋白質(zhì)含量較低）得到OsAAP6互補轉(zhuǎn)基因材料。OsAAP6超量表達(dá)和互補轉(zhuǎn)基因水稻從播種到最后的種子成熟，均實行常規(guī)的田間管理及種植。

主要試劑：牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250和DL-二硫蘇糖醇（DTT）購自美國Sigma公司；TRIzolreagent RNA提取試劑盒、聚丙烯酰胺和SuperScriptⅡI反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Invitrogen公司，其余試劑均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。主要儀器設(shè)備：LC-20AD納升液相色譜儀（日本島津公司）、LTQOrbi-trap Velos串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher Scien-tific公司）、NIRStm DS 2500近紅外谷物分析儀（丹麥FOSS公司）、MH-LG2018礱谷機（長春華茂儀器儀表有限公司）、JXFM110-IⅡ高速全自動錘式旋風(fēng)磨（吉林賽亞斯科技有限公司）、SH-6600分光光度計（江蘇盛奧華環(huán)?？萍加邢薰荆┖蚑4799-10G胰蛋白酶（美國Sigma公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1轉(zhuǎn)基因材料中OsAAP6基因表達(dá)分析

分別取OsAAP6超量表達(dá)和互補轉(zhuǎn)基因水稻開花后7 d的胚乳，迅速放人液氮中，然后利用TRIzol reagentRNA提取試劑盒提取總 RNA，利用olig（dT）n引物和 SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以其為模板，采用實時熒光定量 PCR檢測 OsAAP6基因的相對表達(dá)量（Peng et al.，2023）。

1.2.2 水稻胚乳蛋白的提取與含量檢測 水稻種

子成熟后，自然晾干并在室溫放置3個月后用于總蛋白和4類儲藏蛋白的提取。將水稻OsAAP6超量表達(dá)和互補轉(zhuǎn)基因的種子除去胚后，分別提取其胚乳中的總蛋白：胚乳采用旋風(fēng)磨進(jìn)行研磨為米粉，過100目篩子后將樣品轉(zhuǎn)入50mL圓底離心管中，加入適量Lysis Buffer3;冰浴超聲5 min，4℃下15000r/min離心20min，取上清；加入5倍體積的10%TCA/冷丙酮，-20℃沉淀2 h;4℃下15000 r/min離心20min，去上清，沉淀轉(zhuǎn)入1.5mL離心管；加1mL冷丙酮，終濃度為10mmol/LDTT，搗碎沉淀，-20℃沉淀30min，4℃下30000r/min離心15min，去上清，后續(xù)總蛋白的提取參照Paraman等（2007）的方法進(jìn)行。參考Peng等（2014）的方法提取水稻胚乳中的儲藏蛋白（谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白），然后采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定各種蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.3iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)檢測

水稻OsAAP6超 量表達(dá)和互補轉(zhuǎn)基因胚乳總蛋白經(jīng)還原性烷基化處 理、定量、SDS電泳、酶解、iTRAQ標(biāo)記與混合、強陽離子交換色譜（SCX）分離和液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）分析。iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)檢測是由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司參照Gan等（2010） 的方法完成。對鑒定到的蛋白進(jìn)行定量，當(dāng)上調(diào)或 下調(diào)蛋白的差異倍數(shù)（Fold Change）在1.5倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗Plt;0.05時，視為差異蛋白。參考序列來源于水稻GenBank數(shù)據(jù)庫中共134525條序列信息。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因水稻中OsAAP6基因表達(dá)分析結(jié)果

OsAAP6超量表達(dá)陽性[OX（+）]和OsAAP6互補表達(dá)陽性[ZpZc（+）]水稻開花后7d，分別取樣檢測其胚乳中的OsAAP6基因相對表達(dá)量，并進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，與ZpZc（-）和OX（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，ZpZc（+）和OX（+）轉(zhuǎn)基因陽性胚乳中OsAAP6基因的相對表達(dá)量分別在Plt;0.01和Plt;0.001水平極顯著升高（圖1），與本課題組前期研究結(jié)果（Peng et al.，2014；彭波等，2019）相吻合。

2.2OsAAP6轉(zhuǎn)基因胚乳總蛋白提取質(zhì)量檢測結(jié)果

考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白在酸性條件下相結(jié)合，在一定范圍內(nèi)蛋白含量與595nm的吸光度呈正線性相關(guān)。將牛血清蛋白配成0～0.2μg/μL濃度梯度，與考馬斯亮藍(lán)G-250試劑反應(yīng)2min后利用分光光度計在595nm檢測其吸光度，進(jìn)而繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。根據(jù)水稻OsAAP6超量表達(dá)（OX）和互補（ZpZc）轉(zhuǎn)基因水稻胚乳總蛋白溶液在595nm的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到OsAAP6轉(zhuǎn)基因OX（+）、OX（-）、ZpZc（+）和ZpZc（-）胚乳總蛋白溶液濃度分別為1.36、0.85、0.76和0.92μg/μL。分別取OsAAP6轉(zhuǎn)基因OX（+）、OX（-）、ZpZc（+）和ZpZc（-）胚乳總蛋白30.0μg，利用12%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測，結(jié)果（圖3）顯示，提取的水稻OsAAP6超量表達(dá)（OX）和互補表達(dá)（ZpZc）轉(zhuǎn)基因水稻胚乳總蛋白質(zhì)量較好，能滿足后續(xù)的酶解和iTRAQ蛋白組學(xué)分析等試驗。

2.3iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果

對水稻OsAAP6超量表達(dá)（OX）和互補（ZpZc）轉(zhuǎn)基因水稻胚乳蛋白進(jìn)行iTRAQ蛋白組學(xué)分析，共鑒定到63547個肽譜、2369個多肽和984種蛋白（圖4-A）。通過對鑒定到的蛋白和多肽分析發(fā)現(xiàn)，超過47%的蛋白至少有2個或3個多肽支持（圖4-B）；鑒定到的所有蛋白依據(jù)其相對分子質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示超過70%的蛋白分子質(zhì)量為10～70kD（圖5）。針對鑒定到的蛋白進(jìn)行肽段序列覆蓋度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分鑒定到的蛋白均有多種多肽較好覆蓋，其中超過30%的蛋白有10%～25%的多肽覆蓋（表1）。

分別對OsAAP6超量表達(dá)（OX）和互補（ZpZc）轉(zhuǎn)基因水稻胚乳蛋白中的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與OX（-）和ZpZc（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，在OX（+）和ZpZc（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻胚乳中分別有118和77種蛋白上調(diào)，且分別有80和66種蛋白下調(diào)（圖6）。由于OsAAP6超量表達(dá)（OX）和互補（ZpZc）轉(zhuǎn)基因的親本材料均為南洋占，即這2組轉(zhuǎn)基因材料具有相同的遺傳背景，能對其共同上調(diào)或者下調(diào)的蛋白進(jìn)行深入分析。針對水稻OsAAP6超量表達(dá)（OX）和互補（ZpZc）轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中的差異蛋白進(jìn)一步比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ZpZc（-）和OX（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，ZpZc（+）和OX（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻有58種差異蛋白共同上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，其中有39種蛋白顯著增加（Plt;0.05，下同），有19種蛋白顯著降低（表2）。在39種共同上調(diào)表達(dá)的蛋白中有27種蛋白參與水稻種子儲藏底物的合成和積累，且有16種共同上調(diào)表達(dá)的蛋白參與水稻種子儲藏蛋白的代謝和積累過程（表2和圖7）。

2.4OsAAP6轉(zhuǎn)基因水稻胚乳儲藏蛋白定量檢測

利用iTRAQ 蛋白質(zhì)組學(xué)，針對OsAAP6超量表達(dá)（OX）和互補（ZpZc）轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中的蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ZpZc（-）和OX（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，ZpZc（+）和OX（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻胚乳中有16種共同上調(diào)表達(dá)的蛋白均參與水稻種子儲藏蛋白的代謝和積累過程，故再對 OsAAP6 超量表達(dá)（OX）和互補（ZpZc）轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中的4類儲藏蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖8所示。與ZpZc（-）和OX（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，ZpZc（+）和OX（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻胚乳中谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白含量均顯著增加，特別是OX（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻胚乳中谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白含量均高于ZpZc（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻。

3討論

從水稻基因組中，目前已篩選到與水稻種子蛋白質(zhì)含量相關(guān)的數(shù)量性狀位點（QTL）超過100個，在1～12號染色體上均有分布，針對這些QTLs位點的深入研究也取得積極進(jìn)展（Varshney et al.，2020;Kim et al.，2021）。例如，調(diào)控水稻種子蛋白質(zhì)含量的QTL基因qGPC-10，編碼一個稻米儲藏蛋白（谷蛋白）的前體蛋白OsGluA2，能顯著影響稻米的營養(yǎng)品質(zhì)性狀（Yang et al.，2019;Wu et al.，2020）。本課題組前期分離克隆到OsAAP6基因，其位于水稻1號染色體上正向調(diào)控水稻種子蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL，編碼的OsAAP6蛋白參與水稻根系對氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運，并對稻米的營養(yǎng)品質(zhì)等性狀產(chǎn)生明顯影響（Peng et al.，2014;彭波等，2019）。為解析OsAAP6基因?qū)Φ久着呷橹胁煌瑑Σ乇磉_(dá)蛋白積累的精細(xì)調(diào)控機制，本研究采用iTRAQ技術(shù)對OsAAP6超量表達(dá)（OX）和互補表達(dá)（ZpZc）轉(zhuǎn)基因水稻胚乳進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果顯示，與ZpZc（-）和OX（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，ZpZc（+）和OX（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻共有58種差異蛋白共同上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，其中有39種蛋白顯著增加，有19種蛋白顯著下調(diào)。針對這19種顯著下調(diào)的蛋白進(jìn)一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有多種與支鏈淀粉合成和積累相關(guān)，如淀粉分支酶等，與本課題組前期研究結(jié)果（Peng etal.，2014）即OsAAP6超量表達(dá)（OX）和互補表達(dá)（ZpZc）轉(zhuǎn)基因水稻種子中的總淀粉含量下降，直鏈淀粉含量升高相吻合，而對應(yīng)的支鏈淀粉含量降低。因此，OsAAP6基因上調(diào)表達(dá)能抑制支鏈淀粉合成和積累相關(guān)的酶類，進(jìn)而導(dǎo)致其種子中支鏈淀粉含量減少。

水稻種子主要營養(yǎng)物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、淀粉和脂類物質(zhì)，其中的淀粉和蛋白質(zhì)占種子干重的90%左右（Chen et al.，2018;Yang et al.，2019;Long et al.，2023）。水稻胚乳中的蛋白質(zhì)主要由儲藏蛋白和功能蛋白兩大類組成，儲藏蛋白占總蛋白含量的90%左右（Taguchi et al.，2021）。水稻胚乳中的儲藏蛋白主要是谷蛋白和醇溶蛋白，其中谷蛋白占胚乳中總蛋白含量的80%左右，且這些蛋白對稻米的營養(yǎng)品質(zhì)及其他品質(zhì)性狀均具有重要影響（Zhou et al.，2017；彭波等，2019）。在OsAAP6轉(zhuǎn)基因稻米胚乳中，OsAAP6超表達(dá)（OX）和互補（ZpZc）轉(zhuǎn)基因陽性胚乳中的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白含量均顯著增加。大田增施氮肥條件下，OsAAP6互補（ZpZc）轉(zhuǎn)基因陽性水稻籽粒中蛋白積累增加進(jìn)而促進(jìn)總蛋白含量的提高（彭波等，2019）。本研究通過iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與ZpZc（-）和OX（-）轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，OX（+）和ZpZc（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻胚乳中有40種蛋白共同顯著上調(diào)表達(dá)，其中有16種共同上調(diào)表達(dá)的蛋白（谷蛋白前體蛋白、谷蛋白B、醇溶蛋白前體蛋白和13kD醇溶蛋白等）參與水稻種子儲藏蛋白的代謝和積累過程，與OX（+）和ZpZc（+）轉(zhuǎn)基因陽性水稻胚乳中谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白含量均顯著增加的結(jié)論相一致。上述試驗結(jié)果與本課題組前期對OsAAP6基因表達(dá)及其對應(yīng)胚乳中相關(guān)基因表達(dá)、種子蛋白質(zhì)總含量的檢測結(jié)果（Peng et al.，2014;彭波等，2019）相一致。因此，上調(diào)OsAAP6基因在水稻體內(nèi)表達(dá)能促進(jìn)其種子儲藏蛋白的積累，進(jìn)而提高胚乳中4類儲藏蛋白含量。

4結(jié)論

水稻植株中OsAAP6基因的上調(diào)表達(dá)，能抑制與支鏈淀粉合成相關(guān)蛋白的積累，但促進(jìn)其種子儲藏相關(guān)蛋白的積累，最終提高胚乳中谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白含量，為高營養(yǎng)品質(zhì)水稻新品種的培育提供了重要信息。

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（責(zé)任編輯陳燕）