摘 要：本文對認證認可行業(yè)標準RB/T 151《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》的修訂內容進行了解讀。新標準遵循ISO 19036：2019的理念和思路，分別介紹了技術不確定度、基質不確定度、分布不確定度三個分量的評估方案，以及合成不確定度、擴展不確定度的計算公式和測量不確定度的表示方法，新增了表格示例和數據檢索表，便于實驗室理解和應用。修訂版RB/T 151對于指導我國食品微生物定量檢測方法不確定度評估、保證結果有效性具有重要的現(xiàn)實意義。

關鍵詞：食品，微生物學，測量不確定度

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.14.024

0 引 言

測量不確定度的評估是實驗室質量管理體系的重要組成部分[1-3]，是測試實驗室質量控制有效性的重要內容。我國實驗室認證認可文件GB/T 27025—2019《檢測和校準實驗室能力的通用要求》和 RB/T214—2017《檢驗檢測機構資質認定評審準則》均明確要求實驗室建立和實施評估測量不確定度的程序。CNAS-CL01-A001：2022《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》也明確規(guī)定了檢測人員應掌握測量不確定度評估方法，并在標準、技術規(guī)范有要求時或客戶有需求時正確運用，有能力對定量微生物檢測方法進行不確定度評估。

近三年國內實驗室對食品微生物測量不確定度的研究文獻明顯增加，在菌落總數、大腸菌群、霉菌、金黃色葡萄球菌等檢驗項目[4-10]均有關于不確定度的論文發(fā)表，但這些文獻評定不確定度的方法各異，尚未形成統(tǒng)一意見。筆者承擔認證認可行業(yè)標準RB/T151的修訂工作，參考ISO 19036：2019《Microbiology ofthe food chain — Estimation of measurement uncertainty forquantitative determinations》思路并進行合理優(yōu)化，編制符合我國實際情況的食品微生物定量方法不確定度評估指南，有利于指導國內實驗室在同一原則下開展食品微生物不確定度的評估工作。

1 標準修訂進展

根據國家認監(jiān)委國認監(jiān)〔2022〕 3號文，RB/T 151《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》被列入認證認可行業(yè)標準修訂計劃，由青島海關技術中心組織實施，目前已提交報批稿，即將發(fā)布實施。

2 標準修訂目的和意義

與化學和物理領域不同，微生物是活的生命體，在樣品中的分布不易均勻，檢測結果往往不具備重現(xiàn)性，因此微生物領域的不確定度評估一直是行業(yè)難點和痛點[11-15]?，F(xiàn)行標準RB/ T 151—2016《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》基于ISO 19036：20 06制定，采取的是“黑匣子”策略，通過計算最終結果的再現(xiàn)性標準偏差來評估測量不確定度，未明確區(qū)分食品基質差異（即基質不確定度）和微生物隨機分布差異（即分布不確定度）對結果產生的影響，未闡明基質不確定度、分布不確定度與技術不確定度三者間的相互關系，在科學性、適用性上還有進一步優(yōu)化的空間[16-17]。

修訂版RB/T 151是對最新國際標準進行的國內轉化，有利于統(tǒng)一國內食品微生物測量不確定度的評估思路，對實驗數據的可靠性注釋、標準物質的定值和能力驗證項目的評價具有重要指導意義，其他領域微生物定量檢測方法的不確定度評估也可參考本標準執(zhí)行。

3 主要技術內容

3.1 關鍵技術因素的識別

現(xiàn)行食品微生物檢測國標定量方法主要包括菌落計數法或最可能數法（Mo st P r ob a bleNu m b er，M PN），通過對實驗步驟的分析，可以總結出可能影響這兩類方法的不確定度，并應加以控制的關鍵技術因素包括：培養(yǎng)基和/或試劑的來源和類型、樣品稀釋、接種和培養(yǎng)過程、計數方法（人工計數或自動計數）以及不同操作人員（操作團隊）的變化等[18 -2 0 ]。當以上關鍵技術因素發(fā)生重大變化時，通常需要重新評估測量不確定度。

從樣品堆中抽取實驗室待測樣品產生的誤差可能對最終結果影響很大[21]，但它不屬于與測量本身相關的不確定度范疇，因此在新版RB/T 151中不予考慮。此外，本標準所評估的不確定度也不包括測量的系統(tǒng)誤差。

3.2 技術不確定度（utech）的評估

3.2.1 概述

技術不確定度是在食品微生物定量檢測過程中，由于操作技術的可變性而產生的不確定度，即實驗人員在取樣、混勻、梯度稀釋、培養(yǎng)基的選擇以及整個培養(yǎng)過程中帶入的不確定度。技術不確定度被認為是某一檢測方法的固有特征，例如，對GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》開展技術不確定度評估得到的結果，可用于該方法下所有食品基質合成不確定度和擴展不確定度的計算。

3.2.2 技術不確定度的評估方案

ISO 19036：2019中對于技術不確定度的評估提出了三種評估方案，按優(yōu)先級分別為基于實驗室內再現(xiàn)性標準偏差、實驗室間方法確認的再現(xiàn)性標準偏差和基于能力驗證結果的再現(xiàn)性標準偏差進行評估?？紤]到我國大部分食品微生物實驗室的實際工作情況，修訂版RB/T 151僅規(guī)定了基于實驗室內再現(xiàn)性標準偏差的技術不確定度評估方法，實驗流程見圖1，其中方案（1）適用于基質均勻性較好的樣品（如果汁、牛奶、可可奶、奶粉等），方案（2）適用于基質均勻性欠佳的樣品（如肉塊、魚肉、奶酪、面點、酸奶等）。

選定待評估的檢驗方法，從至少10個實驗室樣品中分別取2個測試部分，在盡可能不同的條件下（如：不同人員、不同品牌培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)設備、不同培養(yǎng)時間等）進行檢驗，每個實驗室樣品至少得到2個可接受的結果A、B，再將所有結果進行常用對數轉換后按照公式（1）計算實驗室內再現(xiàn)性標準偏差，即得到該方法的技術不確定度。

式中：

SIR——實驗室內再現(xiàn)性標準偏差；

n —— 實驗室樣品的數量；

i ——樣品序號，i =1～n （n≥10）；

y i A——在條件A下得出的數值，單位為lo g10（CFU/g、CFU/mL、MPN/g或MPN/mL）；

y i B——在條件B下得出的數值，單位為lo g10（CFU/g、CFU/mL、MPN/g或MPN/mL）。

3.3 基質不確定度（umatrix）的評估

3.3.1 概述

基質不確定度的產生是由于微生物在食品基質中的分布存在不均勻性和隨機性，導致同一實驗室樣品按標準方法取樣時檢驗結果之間存在差異，反映了單個測試部分不能代表整個實驗室樣品的微生物污染程度。

依據食品基質的物理性狀，可分為四類，第一類為均勻性良好的基質（如非粘性液體和粉末），其不確定度較小；第二類至第四類為均勻性不佳的基質（如顆粒狀或塊狀固體），其不確定度較大[2 2 -2 3]。在實驗室資源受控的情況下，基質不確定度不受檢測方法的影響，同一種基質的不確定度評估適用于該基質的所有定量檢測?；|不確定度的評估有三種方式，實驗室可根據樣品基質的實際情況選擇。

3.3.2 均勻性良好的實驗室樣品的基質不確定度評估

均勻性良好的實驗室樣品具有相對低的基質不確定度，在稱取或吸取測試部分后充分均質，基質不確定度可以使用定值，即為umatrix = 0.1 log10（CFU/g、CFU/mL、MPN/g或MPN/mL）。實驗室采用圖1方案（2）時評估測量不確定度時，可直接使用該定值。

3.3.3 基于重復性標準偏差的基質不確定度評估

對于均勻性不佳的實驗室樣品，可以在重復性條件下對單個實驗室樣品中多個測試部分進行分析，通過計算重復性標準偏差來得到基質不確定度，實驗方案見圖2。

在本方案中，需要保證從每個實驗室樣品中所稱取或吸取測試部分總數比實驗室樣品總數至少多10個，即對于同一個實驗室樣品至少取11個測試部分；如果測試部分來自多個同類實驗室樣品，如實驗室樣品數為10個，則每個樣品至少取2個測試部分。將得到的可接受結果（見3.2.3.3）進行常用對數轉換后，選擇合適的方法評估基質不確定度：由單個實驗室樣品得到的數據，按照公式（2）和公式（3）計算重復性標準偏差得到基質不確定度；由多個實驗室樣品得到的數據，標準偏差是組內均方差的平方根時，可使用Excel軟件計算單因素方差分析（ANOVA）快速得到基質不確定度。

式中：

Sr——重復性標準偏差；

i ——實驗室樣品編號（i =1，2，……，n）；

j ——從實驗室樣品i中取的測試部分的份數（j =1，2，……，pi）；

xij ——樣品i的測試部分j的結果，單位是CFU/g、CFU/mL、MPN/g或MPN/mL；

y ij ——x ij 的常用對數，即y ij =log10x ij ，單位是CFU/g、CFU/mL、MPN/g或MPN/mL。

3.3.4 基質特征已知時的基質不確定度評估

實驗室可以根據之前對某種基質評估得到的基質不確定度，作為相似基質不確定度的近似值。評價基質之間是否相似，可參考S N / T32 6 6—2 012《食品微生物檢驗方法確認技術規(guī)范》的附錄A。

實驗室也可引用來源于其他權威實驗室測得的基質不確定度。歐盟提供了來自參考實驗室的基質不確定度數據庫[24]，方便使用者查詢。

3.4 分布不確定度（udistrib）的評估

3.4.1 概述

即使是均勻性好的樣品，由于微生物分布的隨機性，也會存在分布不確定度。分布不確定度類型取決于所使用的檢測方法的技術特性：

（1）對于平板計數法，為泊松不確定度或/和確證不確定度。

（2）對于最可能數法，為MPN不確定度。

3.4.2 平板計數法—泊松不確定度（uPoisson）的評估

分布不確定度取決于計算結果時所使用的菌落總數ΣC ，對于某一結果的泊松不確定度，可使用公式（4）計算得出：

3.4.3 平板計數法—確證不確定度（uconf）的評估

部分平板計數法（如大腸菌群、金黃色葡萄球菌等）需要對疑似菌落進行確證，并根據確證結果對目標菌落總數進行修正，此時需要使用二項分布來計算某一特定結果的分布不確定度。假設對np個疑似菌落進行了確證試驗，nc個菌落被確證為目標菌，確證不確定度可使用表1中的數值，或通過公式（5）計算得出。

3.4.4 最可能數法—MPN不確定度（uMPN）的評估

MPN不確定度以log10MPN的標準偏差表示，其數值僅與總管數和陽性管數相關，與所選擇的樣品稀釋梯度無關。由于MPN標準偏差的計算公式過于復雜[25]，沒有統(tǒng)計學背景的實驗室難以應用，因此修訂版RB/T 151制作了相應的9管法和15管法的MPN不確定度檢索表供查詢。我國常用標準大部分為9管法，表2是9管法的最可能數（MPN）不確定度檢索表。

3.5 合成不確定度（uc （y））和擴展不確定度（U）的評估

3.5.1 合成不確定度的評估

計算合成標準不確定度時，先計算技術不確定度的平方、基質不確定度的平方以及相關分布不確定度的平方，將這些平方相加后開平方得到對應的合成標準不確定度，計算方法見公式（7）：

需要注意的是，不是所有的分布不確定度分量都納入合成不確定度的計算，根據方法的特性選擇涉及的一種或兩種分布不確定度即可。當某個分量的不確定度小于最大不確定度分量五分之一時，該分量的影響可忽略，不列入合成標準不確定度的計算，而最大不確定度分量通常為技術不確定度。

如果有實驗室規(guī)定和客戶要求，可僅使用實驗室內再現(xiàn)性標準偏差（即技術不確定度）計算合成標準不確定度，計算方法見公式（8）：

uc（y）=SIR=utech（8）

3.5.2 擴展不確定度的評估

通過合成標準不確定度和選定的包含因子（k）來計算擴展不確定度。k 值等于2（相當于95 %的置信水平）時，擴展不確定度的計算見公式（9）：

U=2×uc（y）（9）

3.6 結果的表示方法

測量不確定度可以按以下兩種方式報告：

（1）技術不確定度、基質不確定度以及相關的分布不確定度進行綜合評估；

（2）根據實驗室規(guī)定以及客戶要求，可僅使用技術不確定度代替合成標準不確定度報告結果。

當檢測報告中需要體現(xiàn)測量不確定度時，需明確地表述測量不確定度是擴展不確定度，同時還需包括置信水平以及測量不確定度按本標準進行評估的聲明，如果僅基于技術不確定度，則檢測報告中要對此進行額外的聲明。

測量不確定度的單位應與檢測結果的單位一致，報告時保留兩位有效數字。修約在最后進行，以避免修約誤差累計造成的影響。在報告中擴展不確定度與檢測結果一起體現(xiàn)，以log10對數值或自然值表示如下：

（1）log10結果±U：y±U log10（CFU/g、CFU/mL、MPN/g或MPN/mL）；

（2）log10結果加限值：y log10（CFU/g、CFU/mL、MPN/g或MPN/mL）[y-U；y+U ]；

（3）自然值加限值：x（CFU/g、CFU/mL、MPN/g或MPN/mL）[10y -U；10y +U]。

4 修訂版RB/T 151與RB/T 151—2016和ISO 19036-2019的差異比較

4.1 修訂版 RB/T 151與RB/T 151—2016間的主要差異

修訂版 RB/T 151與RB/T 151—2016間的主要技術差異在于修改了測量不確定度的評估思路。

RB/T 151—2016基于整體法，將實驗過程中所有不確定度來源視為一個“黑匣子”，通過最終結果的再現(xiàn)性標準偏差來評估測量不確定度。這種方法看似簡單，實際上未闡明方法之間、基質之間的關聯(lián)性，使用同類方法檢測不同基質所得到的測量不確定度差異非常大[26-28]，實驗室需要開展多次評估才能體現(xiàn)這些差異，這無疑增加了實驗室的工作量。

修訂版 RB/T 151是對舊版標準的部分延承和優(yōu)化，采取“自上而下”的評估思路，使用“整體法”評估技術不確定度，將基質不確定度單列，并充分考慮因微生物隨機分布差異造成的分布不確定度。同時，新標準明確了技術不確定度是某一方法的固有屬性，同類方法的技術不確定度相同；明確了基質不確定度不受檢測方法的影響，相同基質的不確定度值適用于該基質針對目標微生物的所有定量檢測，減少了大量重復工作；而分布不確定度通過簡單計算或查詢檢索表得出。將三個分量“模塊化”，并規(guī)定可重復利用歷史數據，實驗室根據實際需求，補充少量實驗即可得到相應數值，結合四個不同場景下的計算示例，實驗室可快速上手評估測量不確定度。

4.2 修訂版 RB/T 151與ISO 19036-2019間的主要差異

修訂版 RB/T 151參考ISO 19036—2019測量不確定度的評估思路，對ISO 19036—2019內容進行了簡化和優(yōu)化，具體差異體現(xiàn)在以下四個方面：第一，針對國內大部分實驗室實際工作情況，刪除了基于實驗室間方法確認結果再現(xiàn)性和實驗室間能力驗證結果再現(xiàn)性的技術不確定度評估方案；第二，為了使不確定度評估方案更能被基層實驗室和企業(yè)實驗室理解應用，刪除了對非預期不確定度分量的修正步驟；第三，出于實用性的考慮，刪除了菌落計數為0、確證陽性菌落數為0以及MPN法陽性管數為0時不確定度的評估和表示；最后，按照國內標準操作技術要求增加了計算的示例表格，增加了歐盟參考實驗室測得的基質不確定度參考數據表、9管法和15管法MPN不確定度數值檢索表，便于實驗室快速查詢數據。

5 結 論

修訂版 RB/T 151設計的測量不確定度評估方案充分梳理了ISO 19036—2019的實驗思路，結合國內實驗室的工作現(xiàn)狀和實驗基礎提出優(yōu)化方案，將技術不確定度、基質不確定度和分布不確定度視為三個分量獨立評估，允許在實驗條件未發(fā)生重大改變的前提下，使用歷史數據“合成”得到測量不確定度，將極大減輕實驗室的工作量。在編寫修訂版RB/T 151時，增加了表格示例、計算示例以及便捷的數據檢索表，使食品中微生物定量檢測的測量不確定度評估思路更加清晰。根據實驗原理，其他領域（如：環(huán)境微生物、醫(yī)學微生物）的測量不確定度評估也可參照本方案執(zhí)行[29-30]，這也拓展了修訂版RB/T 151的應用面，標準實施后將為國內相關機構開展微生物測量不確定度評估工作提供范例和依據。

參考文獻

[1]劉虹濤，李青.不確定度評定在微生物檢驗中的應用 [J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2020，30（16）：2046-2049.

[2]SEPAROVIC L， SIMABUKURO R S， COUTO A R， et"al. Measurement uncertainty and conformity assessment"applied to drug and medicine analyses - A review [J].Critical Reviews in Analytical Chemistry， 2023， 53（1）： 123-138.

[3]楊娟，鐘昕，朱世真，等.測量不確定度在微生物檢驗中的應用及研究進展 [J].生物化工，2021，7（4）：119-123.

[4]許瑞清，趙海霞，武瑞杰，等.整體法評定食品中大腸菌群的測量不確定度 [J].食品工程，2023，3：40-43.

[5]魏敏，姜華軍，王言爽，等.食品中霉菌和酵母計數的不確定度評定 [J].食品安全導刊，2023（11）：111-113.

[6]趙金丹，張怡鳴，馮素梅，等.菌懸液定量檢測的不確定度評定[J].中國標準化，2022（19）：207-211.

[7]胡雪梅，李衛(wèi)春，于芳，等.生鮮乳中菌落總數的不確定度測量 [J].草食家畜，2023，（3）：37-41.

[8]趙琪，甄珍.單核細胞增生李斯特氏菌MPN法結果測量不確定度評定 [J].中國口岸科學技術，2022，4（5）：77-81.

[9]田浩，李光耀，張凡，等.飲用水中銅綠假單胞菌檢測結果的不確定度評定 [J].現(xiàn)代食品，2021（3）：206-209.

[10]YOU Y， ZHAO Y， LIN X， et al. Evaluation of uncertainty inmeasurement of staphylococcus aureus in food [J].Journal ofFood Safety and Quality， 2021， 12（6）： 2468-2473.

[11]CORRY J， JARVIS B， PASSMORE S， et al. A criticalreview of measurement uncertainty in the enumeration offood micro-organisms [J]. Food Microbiology， 2007， 24（3）：230-253.

[12]NIEMI R M， NIEMEL? S I. Measurement uncertainty inmicrobiological cultivation methods [M]. MeasurementUncertainty in Chemical Analysis. Berlin， Heidelberg：Springer Berlin Heidelberg. 2003： 70-73.

[13]GARRE A， ZWIETERING M H， DEN B H M. Multilevelmodelling as a tool to include variability and uncertaintyin quantitative microbiology and risk assessment. Thermalinactivation of Listeria monocytogenes as proof of concept[J]. Food Research International， 2020， 137：109374.

[14]MEDEIROS K A R， BRAND?O L P， ATILIO N C， et al.Drawing attention to the measurement uncertainty arisingfrom sampling in chemical and physicochemical analyses：An Overview [J]. Critical Reviews in Analytical Chemistry，2023， 53（8）： 1605-1622.

[15]SINGH K A， RAI R， NAIR S S. Review on development ofassigned value microbiological reference materials used infood testing [J]. Food Microbiology， 2022， 102：103904.

[16]弓耀忠，王媛慧，張婷.微生物不確定度的理論與實踐 [J].食品工程，2022，（4）： 77-79.

[17]王瑞興，王禮霞，胡巔.食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南之商榷 [J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2023，33（5）：638-640.

[18]BLASI G， PETRUZZELLI A， OT TAVIANI D， et al.Assessment of reproducibility and uncertainty of foodmicrobiology methods： statistical approach of a multi-sitelaboratory [J]. Accreditation and Quality Assurance， 2013，18（2）： 143-148.

[19]W E I S S F E L D A S . E s t i m a t i o n o f Un c e r t a i n t y o fMeasurement in Microbiology [J]. Clinical MicrobiologyNewsletter， 2010， 32（22）： 171-175.

[20]DIAS F R S， LOUREN?O F R. easurement uncertaintyevaluation and risk of 1 conformity assessment formicrobial enumeration tests [J]. Journal of MicrobiologicalMethods， 2021， 189：106312.

[21]LJEVAKOVI?-MUSLADIN I. Uncertainty from samplingin food microbiology [J]. Dubrovnik， 2022， 10（11）： 111-5.

[22]KHEZRI M， KHANZADI S， HASHEMI M. Estimation andcomparison of interalaboratoary standarad deviation（SIR）measurement uncertainty in quantitative microbiologicaltests in different food items based on EN ISO：19036-2019[J]. Journal of Food Science and Technology（Iran）， 2023，20（134）： 201-13.

[23]CHAMPAGNE C P， ROSS R P， SAARELA M， et al.Recommendations for the viability assessment of probioticsas concentrated cultures and in food matrices [J]. Int J FoodMicrobiol， 2011， 149（3）： 185-93.

[24]EURL. Summary of matrix uncertainty values[EB/OL].（2022-06-22）[2024-03-20].https：//sitesv2.anses.fr/en/minisite/listeria-monocytogenes/matrix-uncertainty-mauvalues.html.

[25]JARVIS B， WILRICH C， WILRICH P T. Reconsiderationof the derivation of most probable numbers， their standarddeviations， confidence bounds and rarity values [J]. Journalof Applied Microbiology， 2010， 109（5）： 1660-1667.

[26]DIAS F R S， LOUREN?O F R. Top-down evaluation of thematrix effects in microbial enumeration test uncertainty [J].Journal of microbiological methods， 2020， 171：105864.

[27]鄭東宇，喬昕，王燕梅，等.保健品檢驗中樣品性狀對實驗室微生物定量不確定度評定的影響[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2020，30（9）：1046-1049.

[28]LJEVAKOVI?-MUSLADIN I. Measurement UncertaintyAccording to ISO 19036：2019 [C]. 17th IMEKO TC 10 andEUROLAB Virtual Conference： “Global Trends in Testing，Diagnostics amp; Inspection for 2030”，2020.

[29]GOVINDASWAMY J， ZELLER-PéRONNET V， PAVLOVICM， et al. Digital droplet-PCR for quantification of viableCampylobacter jejuni and Campylobacter coli in chickenmeat rinses [J]. Applied Sciences， 2022， 12（11）： 5315.

[30]KOPR INAROVA M. Methods to improve moleculardetection of salmonella in complex herbal matricescontaining inhibitors [J]. Journal of Food Protection， 2021，84（8）： 1309-1314.

作者簡介

鐘文濤，博士，高級工程師，研究方向為食品微生物檢測和質量控制。

雷質文，通信作者，碩士，研究員，研究方向為食品微生物檢測和質量控制。

（責任編輯：張佩玉）

基金項目：本文受湖南省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目“新疆葡萄干制品中霉菌污染狀況調查與風險分析”（項目編號：2024KJJH05）、國家認監(jiān)委認證認可行業(yè)標準制修訂計劃項目“食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南”（項目編號：2022RB027）資助。