摘 " "要：選取甜瓜栽培材料龍慶八號(hào)作為受體材料，構(gòu)建CmCURT1A基因CRISPR/Cas9基因編輯載體，經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)檢測(cè)靶位點(diǎn)的編輯情況，為后續(xù)甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)提供載體基礎(chǔ)。以甜瓜CmCURT1A基因（ID：MELO3C006053.2）為靶基因構(gòu)建雙靶位點(diǎn)敲除載體，經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的簡單遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)使甜瓜組織長出不定根，經(jīng)PCR測(cè)序發(fā)現(xiàn)在不定根中分別存在65 bp、72 bp不同堿基片段的缺失。該方法成功進(jìn)行了甜瓜CRISPR/Cas9載體靶位點(diǎn)敲除情況的檢測(cè)，簡單高效，實(shí)現(xiàn)了在甜瓜中基因編輯靶點(diǎn)的快速鑒定，為研究甜瓜基因功能和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜瓜；CRISPR/Cas9；發(fā)根農(nóng)桿菌；基因敲除

中圖分類號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）08-015-09

Detection of target sites of CRISPR/Cas9 system in melon by Agrobacterium rhizogenes system

ZHU Lei

（Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Daqing 163711， Heilongjiang， China）

Abstract： The cultivation melon Long Qing No. 8 was used as the receptor material to construct the CRISPR/Cas9 editing vector of CmCURT1A gene. The targe site was detected through Agrobacterium rhizogenes， which provided the vector basis for subsequent genetic transformation experiment of melon. A double target knockout vector was constructed using the CmCURT1A gene（ID： MELO3C006053.2） as the target gene. Through a simple genetic transformation technique mediated by Agrobacterium rhizome K599， adventitious roots were grown. PCR sequencing revealed that different base fragments of 65 bp and 72 bp were absent in the adventitious roots. The method was simple and efficient for the detection of CRISPR/Cas9 vector target site knockout in melon， realizing rapid identification of gene editing targets， and laying a foundation for studying the gene function and genetic improvement in melon.

Key words： Melon; CRISPR/Cas9 system; Agrobacterium rhizogenes; Gene knockout

甜瓜為葫蘆科甜瓜屬作物，其含有豐富的可溶性固形物和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是典型的喜光、耐熱植物，是我國重要的水果型經(jīng)濟(jì)作物。葉片是甜瓜進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，葉片中的葉綠體吸收光能轉(zhuǎn)為化學(xué)能，進(jìn)而積累有機(jī)物供給植物生長發(fā)育。類囊體是葉綠體細(xì)胞器中重要的片層結(jié)構(gòu)，類囊體的結(jié)構(gòu)、數(shù)量、大小都可能會(huì)影響葉綠體的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響植物的光合作用[1-2]。隨著甜瓜全基因組測(cè)序工程的完成，有關(guān)甜瓜葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的研究正在穩(wěn)步進(jìn)行，甜瓜葉綠體基因組中約有115個(gè)基因，且有高度保守性[3]。這些基因主要分為三大類：光合作用相關(guān)基因，葉綠體轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)相關(guān)基因，其他蛋白質(zhì)編碼基因等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，CmCUTR1A基因的表達(dá)顯著下調(diào)，且葉綠體超微結(jié)構(gòu)顯示類囊體排列不均勻、不清晰且數(shù)量減少[5]。因此，深入研究甜瓜葉綠體相關(guān)基因CmCUTR1A，為促進(jìn)甜瓜有機(jī)物的生成和產(chǎn)量的提高奠定了研究基礎(chǔ)。

近年來，利用基因工程和細(xì)胞工程等技術(shù)改良園藝作物品質(zhì)已取得重大進(jìn)展?；蚓庉嫾夹g(shù)實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)地對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行定向修飾，使DNA雙鏈斷裂，并利用DNA自身的修復(fù)特性對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行敲除、替換、插入、突變等人工修飾[6]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)因具有簡單、高效、精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前廣泛應(yīng)用到擬南芥[7]、水稻[8]、玉米[9]、大豆[10]、棉花[11]、番茄[12]等重要作物中的基因編輯系統(tǒng)[13]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在尋找靶位點(diǎn)時(shí)，可能會(huì)受到基因組中其他高度相似序列的干擾，導(dǎo)致在非目標(biāo)位置發(fā)生切割，即脫靶效應(yīng)[14-15]。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在研究甜瓜基因功能方面非常重要，因此高效、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的切割是進(jìn)行甜瓜基因功能分析的重要基礎(chǔ)。由于甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化周期較長、過程復(fù)雜繁瑣、轉(zhuǎn)化效率偏低等，利用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）[16]介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)促使甜瓜產(chǎn)生不定根進(jìn)行靶位點(diǎn)檢測(cè)是當(dāng)前可以快速獲得甜瓜靶位點(diǎn)切割情況的方式。發(fā)根農(nóng)桿菌的工作原理是利用其能力誘導(dǎo)植物傷口形成不定根，并通過攜帶T-DNA的Ri質(zhì)粒侵入細(xì)胞，將T-DNA插入植物基因組中[17]。發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大豆、黃瓜、西瓜、甜瓜等植物中[18-21]。

甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化過程復(fù)雜，周期較長，且CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)存在一定的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。2016年，Chandrasekaran等[22]報(bào)道了利用pKSE402基因編輯載體在黃瓜中成功敲除eIF4E單個(gè)核苷酸，但轉(zhuǎn)化率不足1%；Feng等[23]利用添加了GRF/GIF生長因子基因的CRISPR/Cas9載體使得西瓜材料TC的基因編輯效率達(dá)到47.02%；2022年，Xin等[24]對(duì)甜瓜基因型、侵染時(shí)間和條件等進(jìn)行優(yōu)化，通過觀察GFP熒光信號(hào)的強(qiáng)弱獲得最優(yōu)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。因此，為了快速檢測(cè)靶位點(diǎn)的敲除情況，便于后續(xù)甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的順利進(jìn)行，筆者構(gòu)建了甜瓜CmCUTR1A基因雙靶點(diǎn)基因敲除載體，并利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜瓜外植體產(chǎn)生不定根，通過不定根中GFP熒光信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)行篩選并測(cè)序，為實(shí)現(xiàn)甜瓜基因組編輯及基因功能的驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選取的甜瓜栽培材料龍慶八號(hào)為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院自主選育的薄皮甜瓜品種，其具備可溶性固形物含量高、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良性狀，且再生能力較強(qiáng)，種質(zhì)資源保存在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)與時(shí)間安排

2023年3月，挑選甜瓜栽培材料龍慶八號(hào)飽滿種子進(jìn)行催芽、育苗，于黑龍江省安達(dá)市育種基地育苗溫室內(nèi)進(jìn)行。

2023年4－5月，選取長勢(shì)一致、健壯幼苗20株，定植于黑龍江省安達(dá)市育種基地，設(shè)置隨機(jī)區(qū)組，株行距30 cm×50 cm，常規(guī)肥水管理，使用地膜覆蓋，田間管理采用多蔓整枝，嚴(yán)格控制人工自交授粉，后期進(jìn)行疏花疏果，每株留1～2個(gè)瓜為宜。

2023年7月，果實(shí)成熟后采收，將采收的種子涮洗、晾干后，挑選成熟、飽滿的籽粒裝袋，注明品種與采收日期，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.3 分子試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 植物材料 分子試驗(yàn)材料為甜瓜栽培材料龍慶八號(hào)幼嫩葉片組織總RNA和龍慶八號(hào)成熟飽滿種子。

1.3.2 菌株材料 基因克隆所使用的載體為pMD-18T，CRISPR-Cas9基因編輯載體為pKSE402、PCBC-DT1T2，載體由黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué)園藝學(xué)院提供。大腸桿菌（E. coli）DH5α菌株和發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌株分別購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2023年5月提取幼嫩葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物，采用TA克隆進(jìn)行CmCUTR1A基因克隆并分析序列差異；2023年7－8月構(gòu)建甜瓜CRISPR/Cas9敲除載體，并進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.4 植物總RNA的提取與cDNA的反轉(zhuǎn)錄

取甜瓜幼嫩葉片于2 mL離心管中，在液氮中速凍、研磨，迅速加入裂解液，后續(xù)操作按照植物總RNA快速抽提試劑盒（上海生工）說明書進(jìn)行，利用高速微型離心機(jī)進(jìn)行低溫、高速離心。

cDNA的反轉(zhuǎn)錄利用HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于-20 ℃保存，避免反復(fù)凍融。

1.5 CmCUTR1A基因的克隆及序列差異分析

參考葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫CuGenDB（Cucurbit Genomics Database）獲得CmCUTR1A基因參考序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物。上游引物clone-F：ATGGCAGCCACGGCCTCCCCT，下游引物clone-R：TTATTCGGTTCCAGCAATCTTC。

在無RNA酶的200 μL離心管中添加：稀釋5倍的cDNA 2 μL、10 μmol·L-1 clone-F/R各1 μL、2 × Rapid Taq Master Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL，用瞬時(shí)離心機(jī)進(jìn)行混勻。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)數(shù)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因條帶，并利用DNA純化試劑盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit進(jìn)行切膠回收。

將目的基因與pMD-18T載體按照載體說明書進(jìn)行連接，然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。接著，在含有50 mg·L-1氨芐青霉素的LB固體平板上倒置過夜培養(yǎng)于37 ℃。第2天，挑取白色飽滿的單菌落，利用預(yù)先設(shè)計(jì)的引物和PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR檢測(cè)，隨后將陽性菌液送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。最后，利用DNAMAN進(jìn)行序列差異比對(duì)分析。

1.6 雙靶位點(diǎn)的選擇

本研究所選取的敲除基因?yàn)樘鸸项惸殷w結(jié)構(gòu)蛋白關(guān)鍵基因CmCUTR1A（Gene ID：MELO3C006053.2），在使用在線靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)軟件CRISPR-P2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）進(jìn)行靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)，需要根據(jù) CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的特點(diǎn)來識(shí)別目標(biāo)序列中含有PAM序列的區(qū)域。通常情況下，為確保編輯效果，在選擇靶位點(diǎn)時(shí)會(huì)考慮其GC含量不低于40%。同時(shí)，為避免試驗(yàn)中出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象，會(huì)對(duì)所選的靶位點(diǎn)進(jìn)行特異性分析。為了提高編輯效率，選擇2個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯。

1.7 CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

（1）本試驗(yàn)所用的CRISPR/Cas9載體為pKSE402載體（以pHSE401載體為骨架改造優(yōu)化），以稀釋100倍的pCBC-DT1T2為模板進(jìn)行4引物PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。DT1-BsF/DT2-BsR引物稀釋至10 μmol·L-1；DT1-F0/DT2-R0引物稀釋至5 μmol·L-1。

（2）純化回收上述PCR產(chǎn)物，建立如下酶切連接體系：PCR產(chǎn)物50 ng、10× ligase buffer 1 μL、T4 DNA ligase 0.5 μL、BsaI-HF 0.5 μL、ddH2O補(bǔ)足至10 μL體系。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置：37 ℃酶切2 min，16 ℃連接5 min，50個(gè)循環(huán)數(shù)；80 ℃酶失活5 min。

（3）將5 μL上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含有50 mg·L-1卡那霉素的LB固體平板上，然后在37 ℃下倒置過夜進(jìn)行培養(yǎng)。第2天，挑選白色飽滿的單菌落，利用特異性引物U626-IDF和U629-IDR進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。陽性菌液送往上海生工進(jìn)行測(cè)序（測(cè)序引物選用特異性引物U626-IDF和U629-IDR）。

（4）從測(cè)序正確的菌液中提取重組質(zhì)粒，取1 μg重組質(zhì)粒利用轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入100 μL發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)中，依次進(jìn)行冰浴5 min、液氮5 min、37 ℃水浴5 min、冰浴5 min，加入700 μL無抗生素的TY液體培養(yǎng)基；28 ℃，200 r·min-1振蕩2～3 h。涂布于含有50 mg·L-1卡那霉素和50 mg·L-1鏈霉素的TY固體平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取白色飽滿單菌落，利用特異性引物U626-IDF和U629-IDR進(jìn)行PCR檢測(cè)陽性菌液。

1.8 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化

（1）從成熟甜瓜種子中，選取籽粒飽滿、大小均勻、平整的龍慶八號(hào)甜瓜種子進(jìn)行試驗(yàn)，將其浸泡在55 ℃溫水中處理2 h，去除種皮。接下來，在HDL潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）中進(jìn)行以下操作：用75%酒精消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次，隨后用10% NaClO消毒10 min，最后再用無菌水沖洗5次。將處理后的種子放置于含有8%瓊脂的培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿30～40粒種子。將培養(yǎng)皿置于28 ℃連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)2 d，直至甜瓜種子萌發(fā)。

（2）選取萌發(fā)飽滿的甜瓜種子，將下胚軸切掉并刮去生長點(diǎn)子葉一分為二，切去上半部分，便于發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染。

（3）將PCR檢驗(yàn)正確的菌液接種于50 mL離心管中繼續(xù)培養(yǎng)（10 mL TY液體+50 mg·L-1卡那霉素和50 mg·L-1鏈霉素），待菌液濃度達(dá)到OD600約0.6時(shí)，4000 r·min-1離心，用滅菌的MS液體重懸菌體，調(diào)節(jié)重懸液濃度OD600約0.2。將切好的甜瓜子葉節(jié)置于20 mL注射器中，吸取10 mL菌液抽真空2 min后，取出晾干，平鋪于覆有一層濾紙的MS固體培養(yǎng)基（MS+3.0%蔗糖+NAA α-萘乙酸 0.5 mg·L-1）中，25 ℃暗培養(yǎng)2 d。

（4）2 d后將暗培養(yǎng)的子葉節(jié)取出，用無菌水沖洗干凈并晾干后，置于MS固體培養(yǎng)基（MS+3.0%蔗糖+NAA α-萘乙酸 0.5 mg·L-1+特美汀200 mg·L-1）上，26 ℃、光16 h/暗8 h培養(yǎng)，約2周左右觀察生根情況。

1.9 甜瓜不定根靶位點(diǎn)的檢測(cè)

利用CTAB法提取不定根組織的DNA[25]，根據(jù)靶位點(diǎn)的位置及理論敲除長度在靶點(diǎn)前后設(shè)計(jì)特異性引物CmCUTR1A-F和CmCUTR1A-R，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。對(duì)1%瓊脂糖凝膠電泳目的片段條帶正確的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并送往生工生物工程有限公司測(cè)序，檢測(cè)分析靶位點(diǎn)的編輯情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 CmCUTR1A基因序列差異分析

取龍慶八號(hào)甜瓜栽培材料幼嫩葉片，提取葉片組織的總RNA，后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以CmCUTR1A基因的特異性引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示該目的基因片段長度為494 bp（圖1-A），將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接克隆載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR鑒定，條帶約為494 bp（圖1-B），將陽性菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)龍慶八號(hào)與葫蘆科甜瓜參考基因組數(shù)據(jù)庫中MELO3C006053.2基因相比無突變產(chǎn)生（圖2），故可以用龍慶八號(hào)甜瓜品種進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染及后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 雙靶位點(diǎn)載體的構(gòu)建

根據(jù)CRISPR-P2.0在線工具設(shè)計(jì)了雙靶位點(diǎn)，分別位于第2外顯子和第3外顯子上。以PCBC-DT1T2載體為中間模板進(jìn)行四引物擴(kuò)增，擴(kuò)增雙靶點(diǎn)基因敲除所需要的作用元件sgRNA與兩個(gè)靶位點(diǎn) gRNA1、gRNA2，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)重組載體構(gòu)建示意圖（圖3）。

PCR擴(kuò)增得到的中間產(chǎn)物，利用T4連接酶連接到pKSE402載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中以特異性引物U626-IDF和U629-IDR進(jìn)行菌液PCR以驗(yàn)證陽性菌液，PCR檢測(cè)特異性條帶大小在1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)下應(yīng)為726 bp（圖4-A），測(cè)序結(jié)果顯示所添加的作用元件sgRNA和2個(gè)靶位點(diǎn)的序列均正確無誤（圖5）。以上結(jié)果表明，CRISPR/Cas9敲除載體已經(jīng)構(gòu)建成功。提取測(cè)序成功菌液中的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)細(xì)胞中，輕挑取白色單克隆菌落并進(jìn)行陽性菌液PCR檢測(cè)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段長為726 bp（圖4-B），證明該重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌中，可以用于后續(xù)侵染試驗(yàn)。

2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜轉(zhuǎn)化技術(shù)檢測(cè)靶位點(diǎn)的可行性

通過發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的甜瓜轉(zhuǎn)化體系對(duì)CRISPR/Cas9表達(dá)載體靶位點(diǎn)的可行性進(jìn)行驗(yàn)證，龍慶八號(hào)種子萌發(fā)后（圖6-A），將切好的甜瓜子葉節(jié)放入20 mL無菌注射器中添加10 mL菌液并進(jìn)行抽真空5 min，25 ℃暗培養(yǎng)3 d（圖6-B），用無菌水脫菌后，將子葉節(jié)表面晾干后放置于生根篩選的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行光照培養(yǎng)。在含有NAA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行不定根的培養(yǎng)約7 d后能觀察到不定根的伸長（圖6-C），利用路陽365L熒光檢測(cè)燈能觀察到明顯的綠色熒光信號(hào)（圖6-D）。

待培養(yǎng)至20 d后提取甜瓜不定根組織的DNA，根據(jù)雙靶位點(diǎn)在CmCUTR1A基因上的位置，在雙靶位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)了特異性引物CmCUTR1A-F和CmCUTR1A-R，利用該引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目的片段進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未經(jīng)敲除的WT條帶大小約300 bp，編輯后的不定根產(chǎn)生的條帶經(jīng)電泳后大小約220 bp（圖7-A），將目的片段進(jìn)行回收純化并送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用GFP熒光信號(hào)篩選不定根，共進(jìn)行PCR測(cè)序檢測(cè)產(chǎn)生不定根的外植體16個(gè)，測(cè)序結(jié)果顯示，經(jīng)基因敲除后的不定根組織的DNA中存在兩種獨(dú)立的不同堿基的缺失，在C-1、C-2的測(cè)序結(jié)果中顯示均從第1個(gè)PAM序列進(jìn)行識(shí)別，并敲除至第2個(gè)PAM序列產(chǎn)生，但DNA在雙鏈斷裂的過程中會(huì)產(chǎn)生堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)而進(jìn)行DNA的修復(fù)。由于重新修復(fù)補(bǔ)充上的堿基數(shù)量不等，導(dǎo)致敲除片段存在長度上的差異。C-1的測(cè)序結(jié)果顯示缺失65 bp，C-2顯示缺失72 bp（圖7-B）。經(jīng)計(jì)算，產(chǎn)生GFP熒光信號(hào)的外植體16個(gè)，測(cè)序獲得的獨(dú)立編輯事件為2個(gè)，初步估算本研究中以pKSE402載體和甜瓜栽培品種龍慶八號(hào)為受體材料的基因編輯效率為12.5%。結(jié)果表明，該方法成功實(shí)現(xiàn)了在甜瓜不定根中的基因編輯，發(fā)生了堿基的缺失，說明該基因編輯載體具有基因編輯的功能，可用于甜瓜材料龍慶八號(hào)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

3 討論與結(jié)論

甜瓜的光合作用是通過葉綠體進(jìn)行的，而葉綠體中的類囊體結(jié)構(gòu)可能直接或間接地影響甜瓜葉片光合速率。筆者之前在甜瓜的研究中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)基因CmCUTR1A[5]，該基因可能控制著甜瓜中類囊體的結(jié)構(gòu)。基于這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了后續(xù)試驗(yàn)以進(jìn)一步探究其基因結(jié)構(gòu)與功能。

由于甜瓜基因型的不同會(huì)導(dǎo)致甜瓜在遺傳轉(zhuǎn)化過程中所用激素濃度不同[26]，筆者選擇了具有較強(qiáng)再生能力的龍慶八號(hào)甜瓜材料作為研究對(duì)象。隨著基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，提高植物基因編輯效率并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)靶向基因敲除位點(diǎn)越來越受到重視。傳統(tǒng)育種方法中的物理和化學(xué)誘變產(chǎn)生新突變體具有隨機(jī)性[27]，需要進(jìn)行大規(guī)模操作，從而導(dǎo)致巨大的工作量。然而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的引入解決了這一生產(chǎn)技術(shù)上的難題，通過構(gòu)建確定的雙靶位點(diǎn)等載體，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠高效、精準(zhǔn)靶向編輯相關(guān)基因，實(shí)現(xiàn)基因的精準(zhǔn)定點(diǎn)突變，這一技術(shù)為基因功能的研究及新品種選育提供了新的策略。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在甜瓜上的應(yīng)用已經(jīng)逐漸擴(kuò)大。從2019年至今，通過基因編輯技術(shù)已經(jīng)獲得了大多數(shù)甜瓜基因的功能信息如CmPDS[28]、CmROS1[29]、CmeIF4E[30]等。與此同時(shí)，甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系也在逐步優(yōu)化[24]，使得甜瓜品種的基因優(yōu)化改良不再成為困難。然而，甜瓜的基因編輯進(jìn)程仍然較為緩慢，并且常常存在一定程度的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。為了解決這個(gè)問題，一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法被提出來檢測(cè)靶位點(diǎn)編輯情況。通過評(píng)估載體的可利用性，可以有效地進(jìn)行后續(xù)的基因功能驗(yàn)證工作。通過構(gòu)建雙靶位點(diǎn)CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)，并利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)甜瓜不定根的生成，筆者成功地獲得了敲除突變體，這一方法已被證明是有效的。此外，一些研究表明，在煙草、蒲公英等植物中，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定根[31-32]，可以經(jīng)過脫分化和再分化的過程培育成完整的轉(zhuǎn)基因植株。在南瓜中也成功地通過誘導(dǎo)不定根形成了愈傷組織[33]，為培育出完整的轉(zhuǎn)基因植株提供了新途徑。這些研究結(jié)果為甜瓜不定根的脫分化和再生提供了新的方向。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)基因克隆比對(duì)，龍慶八號(hào)甜瓜栽培材料中類囊體結(jié)構(gòu)蛋白CmCUTR1A基因與甜瓜參考基因組該基因序列無突變差異；構(gòu)建了CmCUTR1A基因雙靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體，并經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)使甜瓜子葉節(jié)產(chǎn)生不定根，且經(jīng)檢測(cè)不定根中存在多種片段缺失，證明此CRISPR/Cas9載體具有一定的基因敲除功能，為后續(xù)進(jìn)行甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 徐振彪，宋林霞．葉綠體的遺傳工程應(yīng)用研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（23）：7085-7087．

[2] 周云龍．載色體與葉綠體的區(qū)別和聯(lián)系[J]．生物學(xué)教學(xué)，2014，39（6）：39-40．

[3] RODRIGUEZ-MORENO L，GONZALEZ V M，BENJAK A，et al．Determination of the melon chloroplast and mitochondrial genome sequences reveals that the largest reported mitochondrial genome in plants contains a significant amount of DNA having a nuclear origin[J]．BMC Genomics，2011，12：424．

[4] 朱強(qiáng)龍，朱子成，王鵬飛，等．葫蘆科作物線粒體和葉綠體基因組研究進(jìn)展[J]．中國瓜菜，2016，29（8）：1-8．

[5] LIU T，AMANULLAH S，XU H C，et al．RNA-Seq identified putative genes conferring photosynthesis and root development of melon under salt stress[J]．Genes，2023，14（9）：1728．

[6] 方銳，暢飛，孫照霖，等．CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)[J]．生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2013，40（8）：691-702．

[7] 瞿禮嘉，郭冬姝，張金喆，等．CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應(yīng)用[J]．生命科學(xué)，2015，27（1）：64-70．

[8] WANG F J，WANG C L，LIU P Q，et al．Enhanced rice blast resistance by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene OsERF922[J]．PLOS ONE，2016，11（4）：e0154027．

[9] FENG C，YUAN J，WANG R，et al．Efficient targeted genome modification in maize using CRISPR/Cas9 system[J]．Journal of Genetics and Genomics，2016，43（1）：37-43．

[10] CAI Y P，CHEN L，LIU X J，et al．CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of GmFT2a delays flowering time in soya bean[J]．Plant Biotechnology Journal，2018，16（1）：176-185．

[11] WANG P C，ZHANG J，SUN L，et al．High efficient multisites genome editing in allotetraploid cotton（Gossypium hirsutum）using CRISPR/Cas9 system[J]．Plant Biotechnology Journal，2018，16（1）：137-150．

[12] BEMER M，KARLOVA R，BALLESTER A R，et al．The tomato FRUITFULL homologs TDR4/FUL1 and MBP7/FUL2 regulate ethylene-independent aspects of fruit ripening[J]．Plant Cell，2012，24（11）：4437-4451．

[13] BHATTA B P，MALLA S．Improving horticultural crops via CRISPR/Cas9：current successes and prospects[J]．Plants-Basel，2020，9（10）：1360．

[14] TSAI S Q，ZHENG Z，NGUYEN N T，et al．GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases[J]．Nature Biotechnology，2015，33（2）：187-197．

[15] GANTZ V M，BIER E．The mutagenic chain reaction：A method for converting heterozygous to homozygous mutations[J]．Science，2015，348（6233）：442-444．

[16] SMITH E F，TOWNSEND C O．A plant-tumor of bacterial origin[J]．Science，1907，25（643）：671-673．

[17] CHILTON M D，DRUMMOND M H，MERIO D J，et al．Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells：The molecular basis of crown gall tumorigenesis[J]．Cell，1977，11（2）：263-271．

[18] JACOBS T B，LAFAYETTE P R，SCHMITZ R J，et al．Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9[J]．BMC Biotechnology，2015，15：16．

[19] WANG X T，JIN B Y，YAN W J，et al．Cucumber abscisic acid 8`-hydroxylase Csyf2 regulates yellow flesh by modulating carotenoid biosynthesis[J]．Plant Physiology，2023，193（2）：1001-1015．

[20] 張?jiān)聠蹋饾?，田樹娟，等．利用發(fā)根農(nóng)桿菌體系檢測(cè)西瓜CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶位點(diǎn)[J]．中國瓜菜，2020，33（4）：7-11．

[21] 王平勇，徐永陽，趙光偉，等．發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜瓜轉(zhuǎn)基因過表達(dá)體系的建立[J]．中國瓜菜，2019，32（12）：15-18．

[22] CHANDRASEKARAN J，BRUMIN M，WOLF D，et al．Development of broad virus resistance in nontransgenic cucumber using CRISPR/Cas9 technology[J]．Molecular Plant Pathology，2016，17（7）：1140-1153．

[23] FENG Q，XIAO L，HE Y，et al．Highly efficient genotype-independent transformation and gene editing in watermelon （Citrullus lanatus） using a chimeric ClGRF4-GIF1 gene[J]．Journal of Integrative Plant Biology，2021，63（12）：2038-2042．

[24] XIN T，TIAN H，MA Y，et al．Targeted creating new mutants with compact plant architecture using CRISPR/Cas9 genome editing by an optimized genetic transformation procedure in cucurbit plants[J]．Horticulture Research，2022，9：uhab086．DOI：10.1093/hr/uhab086.

[25] 王懷松，賀超興，張志斌，等．甜瓜白粉病抗性AFLP連鎖標(biāo)記的初步研究[J]．中國瓜菜，2009，22（2）：4-6．

[26] 祁宏英，徐洪國，王秀文，等．甜瓜再生體系的建立[J]．中國瓜菜，2021，34（5）：105-108．

[27] COLBERT T，TILL B J，TOMPA R．High-throughput screening for induced point mutations[J]．Plant Physiology，2001，126（2）：480-484．

[28] HOOGHVORST I，LOPEZ C，NOGUES S．Efficient knockout of phytoene desaturase gene using CRISPR/Cas9 in melon[J]．Scientific Reports，2019，9：17077．

[29] GIORDANO A，SANTO D M，QUADRANA L，et al．CRISPR/Cas9 gene editing uncovers the roles of constitutive triple response 1 and repressor of silencing 1 in melon fruit ripening and epigenetic regulation[J]．Journal of Experimental Botany，2022，73（12）：4022-4033．

[30] PARSA H S，SABET M S，MOIENI A，et al．CRISPR/Cas9-mediated cytosine base editing using an improved transformation procedure in melon （Cucumis melo L.）[J]．International Journal of Molecular Sciences，2023，24（13）：11189．

[31] ALTAMURA M M，ARCHILLETTI T，CAPONE I，et al．Histological analysis of the expression of Agrobacterium rhizogenes rolB-GUS gene fusions in transgenic tobacco[J]．New Phytologist，1991，118（1）：69-78．

[32] LEE M H，YOON E S，JEONG J H，et al．Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Taraxacum platycarpum and changes of morphological characters[J]．Plant Cell Reports，2004，22（11）：822-827．

[33] BALEN B，LELJAK-LEVANIC D，MIHAIJEVI? S，et al．Formation of embryogenic callus in hairy roots of pumpkin（Cucurbita pepo L.）[J]．In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant，2004，40（2）：182-187．