摘" " 要：減數(shù)分裂是有性生殖的關(guān)鍵過(guò)程。為了明確蘆筍超雄株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的具體情況及異常行為對(duì)配子生長(zhǎng)發(fā)育的影響，采用改良苯酚品紅壓片法對(duì)58株蘆筍超雄株的986個(gè)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)觀察。結(jié)果表明，（1）超雄株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂為胞質(zhì)分裂同時(shí)型，染色體構(gòu)型為10個(gè)二價(jià)體，四分體為十字交叉型。（2）中期Ⅰ小型棒狀二價(jià)體的出現(xiàn)比例為96.55%，四價(jià)體為8.62%，染色體粘連為22.41%。（3）后期Ⅰ落后染色體的出現(xiàn)比例為12.07%，染色體橋?yàn)?3.79%；分裂期出現(xiàn)微核的比例為6.59%。（4）在中期Ⅱ～末期Ⅱ中分裂不同步的出現(xiàn)比例為34.45%。超雄株花粉母細(xì)胞在整個(gè)減數(shù)分裂進(jìn)程中，前期Ⅰ所需時(shí)間最長(zhǎng)。減數(shù)分裂配對(duì)成10個(gè)二價(jià)體，在倍性水平上屬于二倍體。減數(shù)分裂異常行為主要出現(xiàn)在中期Ⅰ和后期Ⅰ。對(duì)超雄株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程的觀察，不僅能夠豐富蘆筍的細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容，還可以為蘆筍發(fā)育生物學(xué)、雜交育種、基因定位等方面提供必要的細(xì)胞遺傳學(xué)信息。

關(guān)鍵詞：蘆筍；超雄株；花粉母細(xì)胞；減數(shù)分裂

中圖分類(lèi)號(hào)：S644.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）07-095-05

Observation on meiosis of pollen mother cells of super-male plants in Asparagus officinalis L.

LI Xia， NIU Xiaoxue， BAO Yancun， LU Yuan， LI Fujun， MU Meng， LEI Ting， TIAN Hongping， LI Baohua， YANG Lin

（Weifang Academy of Agricultural Sciences， Weifang 261071， Shandong， China）

Abstract： Meiosis is a key process in sexual reproduction. In order to clarify the specific situation and the effect of abnormal meiotic behavior of pollen mother cells（PMCs） on the growth and development of gametes in super -male asparagus plants， the improved phenol fuchsin method was used to systematically observe the meiosis process of 986 PMCs of 58 super-male asparagus plants. The results showed that：（1）The PMCs of super-male plants carried meiosis and cytokinesis simultaneously， with a chromosome configuration of 10 bivalents and the tetrad of a cross shaped structure.（2）At metaphase I， the proportion of small rod bivalents was 96.55%， tetravalent was 8.62%， and chromosome sticking was 22.41%.（3）At anaphase I， the proportion of lagging chromosomes was 12.07%， chromosome bridges was 13.79%， and the proportion of micronucleus was 6.59% in the division phase.（4）At metaphase II to telophase II， the proportion of asynchronization of chromosomes segregation was 34.45%. In the whole process of meiosis， the prophase Ⅰ is the longest. There was paired as 10 bivalents at meiosis metaphase Ⅰ，thus it is a diploid species．The abnormal behavior of meiosis mainly occurs in metaphase I and anaphase I. Based on the observation of the meiosis process of PMCs of the super-male， it can not only enrich the cytogenetic content of asparagus， but also provide the necessary cytogenetic information for asparagus of developmental biology， cross breeding， gene localization， and so on.

Key words： Asparagus officinal L.; Super-male plants; Pollen mother cells; Meiosis

減數(shù)分裂是DNA復(fù)制一次，而細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，形成單倍體的精子或卵子，減數(shù)分裂過(guò)程中非同源染色體及非姊妹染色單體間發(fā)生交換，使配子的遺傳多樣化，增加了后代的適應(yīng)性。減數(shù)分裂是維持物種染色體數(shù)目穩(wěn)定，使生物物種得以保存延續(xù)的重要生物過(guò)程，在植物生命周期中維持遺傳穩(wěn)定性和豐富變異性方面起重要作用[1]。在減數(shù)分裂過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)正常二價(jià)體（指在減數(shù)分裂偶線期同源染色體聯(lián)會(huì)時(shí)，正常是每對(duì)同源染色體形成一個(gè)二價(jià)體，此時(shí)，每條染色體由兩條姊妹染色單體組成。有n對(duì)染色體的細(xì)胞中將形成n個(gè)二價(jià)體）、四分體（指花粉母細(xì)胞在孢子母細(xì)胞的分化方向中，在花粉形成前，四個(gè)花粉由胼胝質(zhì)相連形成的結(jié)構(gòu)）。當(dāng)然也會(huì)出現(xiàn)異常分裂行為：（1）單價(jià)體：減數(shù)分裂過(guò)程中不能配對(duì)的染色體。一般在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂前期Ⅰ和中期Ⅰ出現(xiàn)。（2）四價(jià)體：在減數(shù)分裂偶線期發(fā)生聯(lián)會(huì)的四條同源染色體配成一組的多價(jià)體。（3）染色體橋：由兩條染色體分別發(fā)生斷裂后，具有著絲粒的殘臂相接而形成的雙著絲粒染色體所特有的結(jié)構(gòu)，在兩極之間被拉緊而形成橋。（4）落后染色體：在減數(shù)分裂的后期I、末期I、后期Ⅱ、末期Ⅱ，大多數(shù)染色體移向兩極之后，少數(shù)染色體不移向兩極，仍停滯在赤道板上或者在移向兩極過(guò)程中與大多數(shù)染色體不同步，形成落后的染色體或斷片。（5）微核：隨著落后染色體或斷片的出現(xiàn)及分裂的進(jìn)行，這些滯后的染色體或斷片丟失或游離于主核外，形成微核[1]。

蘆筍（Asparagus officinalis L.）為百合科天門(mén)冬屬多年生草本植物，具有2n =2x = 20條染色體，二倍體基因組大小為1323 Mb [2-4]，幼莖質(zhì)嫩味美，營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，是一種具有較高藥用、營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值的高檔蔬菜，暢銷(xiāo)全球，享有“蔬菜之王”的美譽(yù)[5-6]。蘆筍為典型的雌雄異株植物，具有XY型性別決定系統(tǒng)，蘆筍的自然群體中性別表現(xiàn)型有4種，分別為雌性、雄性、超雄性和兩性株，性染色體組成分別為XX，XY，YY和XY[7]。超雄株（YY）可以正常生長(zhǎng)發(fā)育，形態(tài)及生理等各方面特征均與正常雄株（XY）相同，但其與雌株雜交的后代全為雄性，因此超雄株對(duì)蘆筍育種具有重要意義[8-10]。目前生產(chǎn)上獲得超雄株的方法主要有兩種，一是花粉培養(yǎng)誘導(dǎo)蘆筍雄核形成雙單倍體，二是雄性?xún)尚曰ㄗ曰ɑ虍惢ㄊ诜踇11-12]。國(guó)內(nèi)對(duì)蘆筍超雄株的研究主要涉及超雄株的獲得、田間鑒定篩選、分子鑒定篩選等方面[13-16]，還未涉及蘆筍超雄株染色體的研究，因此，筆者采用常規(guī)的細(xì)胞學(xué)分析方法對(duì)蘆筍超雄株花粉母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂觀察，旨在為蘆筍超雄株的研究增加細(xì)胞學(xué)資料，為進(jìn)一步揭示超雄株生長(zhǎng)發(fā)育及全雄育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年在濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園定植968株蘆筍雄性?xún)尚灾辏瑥闹需b定出了58株超雄株[15]，筆者以58株超雄株單株為試驗(yàn)材料，2023年5—6月在超雄株的盛花期不間斷地取長(zhǎng)度0.5 cm左右的花蕾進(jìn)行觀察。

1.2 方法

采用改良的苯酚品紅染色法，取超雄株0.5 cm左右的花蕾，在卡諾氏固定液Ⅰ中固定24 h，然后轉(zhuǎn)移到70%酒精中于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用壓片法制片，取新鮮花蕾或從70%酒精中取出保存的花蕾，用鑷子取出花藥，放置于載玻片中央，滴加1滴苯酚品紅染液，用鑷子和解剖針剖開(kāi)花藥，將其中的小孢子母細(xì)胞擠出，去除雜質(zhì)，蓋上蓋玻片并壓片，用解剖針輕輕敲擊并排除氣泡，在酒精燈外焰烤片3～4 s或者手背感覺(jué)微熱時(shí)，在N-300M生物顯微鏡下100倍觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

筆者對(duì)58株超雄株的986個(gè)花粉細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂過(guò)程包括2次連續(xù)的核分離，第一次減數(shù)是同源染色體的分離，第二次減數(shù)是姊妹染色單體的分離。細(xì)胞胞質(zhì)分裂方式為同時(shí)型，詳細(xì)分裂過(guò)程如圖1所示。

2.1 間期

染色體呈松散的染色質(zhì)狀態(tài)，核內(nèi)染色較為均勻，核質(zhì)分界明顯（圖1-A）。

2.2 前期Ⅰ-細(xì)線期

花粉母細(xì)胞的核仁開(kāi)始解體，著色能力越來(lái)越弱。染色質(zhì)濃縮為幾條細(xì)而長(zhǎng)的線，首尾不分地繞成一團(tuán)，每一染色體已復(fù)制為2個(gè)單體（圖1-B）。

2.3 前期Ⅰ-偶線期

染色體形態(tài)與細(xì)線期沒(méi)有太大的變化，同源染色體開(kāi)始配對(duì)，出現(xiàn)聯(lián)會(huì)現(xiàn)象，染色體松散，增粗，但無(wú)法辨認(rèn)染色單體（圖1-C）。

2.4 前期Ⅰ-粗線期

同源染色體配對(duì)完畢，出現(xiàn)二價(jià)體，每個(gè)二價(jià)體含有4個(gè)染色單體，但僅含有2個(gè)著絲粒，染色體繼續(xù)縮短變粗、螺旋化，向四周發(fā)散（圖1-D）。

2.5 前期Ⅰ-雙線期

染色體進(jìn)一步縮短變粗，同源染色體分離，此時(shí)可以看到染色體的交叉現(xiàn)象，因?yàn)榻徊媸沟脝误w上的若干點(diǎn)仍然連在一起，出現(xiàn)U形、8字形等多種形狀（圖1-E）。

2.6 前期Ⅰ-終變期

交叉向染色體端部移動(dòng)，交叉數(shù)減少，染色體變得更粗。到終變晚期，染色體與中期染色體大小基本相同，核仁著色變淺，此時(shí)可見(jiàn)10對(duì)同源染色體構(gòu)成10個(gè)二價(jià)體，呈環(huán)狀、棒狀（圖1-F）。

2.7 中期Ⅰ

側(cè)面觀察染色體整齊地排列在赤道板上，極面觀察染色體散布在細(xì)胞中，兩兩配對(duì)分散在細(xì)胞質(zhì)中。在58株超雄株的所有花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程中，單株之間不存在明顯的差異，染色體構(gòu)型均為10個(gè)二價(jià)體，即10Ⅱ，二價(jià)體構(gòu)型的形狀有棒狀、環(huán)狀，以環(huán)狀為主，棒狀二價(jià)體1～5個(gè)不等（圖1-G～K）；在分裂過(guò)程中，小型棒狀二價(jià)體的出現(xiàn)比例為96.55%、四價(jià)體為8.62%、染色體粘連為22.41%。

2.8 后期Ⅰ

同源染色體彼此分開(kāi)，移向細(xì)胞兩極。由于此時(shí)著絲點(diǎn)未分開(kāi)，所以細(xì)胞兩極的染色體數(shù)是母細(xì)胞的一半，但每條染色體中依然含有兩條單體（圖1-L～O）。在分裂過(guò)程中落后染色體的出現(xiàn)比例為12.07%；染色體橋?yàn)?3.79%。

2.9 末期Ⅰ

同源染色體分別到達(dá)兩極，染色體變成了染色質(zhì)狀，核膜、核仁重新出現(xiàn)，形成2個(gè)子核，此時(shí)每個(gè)子核染色體數(shù)目減半為10條，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)分開(kāi)形成2個(gè)子細(xì)胞（二分體），可確定超雄株的細(xì)胞質(zhì)分裂方式為同時(shí)型（圖1-P）。在分裂期微核的出現(xiàn)比例為6.59%（圖1-Q）。

2.10 前期Ⅱ

染色體縮短，前期快結(jié)束時(shí)核膜消失，此時(shí)的每條染色體都有2條單體，細(xì)胞有10條染色體（圖1-R）。

2.11 中期Ⅱ

染色體濃縮變短，2組染色體分別排列在各自的赤道板上，紡錘體出現(xiàn)，每條染色體有2個(gè)染色單體和1個(gè)著絲粒（圖 1-S）。

2.12 后期Ⅱ

著絲點(diǎn)完成復(fù)制，彼此分開(kāi)。姊妹染色單體從著絲粒處分裂為二，在紡錘絲的作用下分別移向兩極（圖 1-T）。

2.13 末期Ⅱ

移到兩極的染色體解螺旋，濃縮成團(tuán)，出現(xiàn)核仁、核膜，形成單倍的子核（圖 1-U），胞質(zhì)分裂，1個(gè)母細(xì)胞分裂成 4個(gè)子細(xì)胞，至此減數(shù)分裂結(jié)束，進(jìn)入四分體時(shí)期（圖 1-V）。在中期Ⅱ～末期Ⅱ中分裂不同步的出現(xiàn)比例為34.45%（圖 1-W～X）。

3 討論與結(jié)論

國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)對(duì)蘆筍超雄株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的研究。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，超雄株花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程符合二倍體減數(shù)分裂的規(guī)律。減數(shù)分裂的染色體行為，在不同植株或相同植株的花蕾上表現(xiàn)基本一致；超雄株花粉母細(xì)胞是胞質(zhì)同時(shí)型；染色體構(gòu)型為10個(gè)二價(jià)體，有棒狀和環(huán)狀，四分體為十字交叉型。絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體的行為正常，但也有不同比例的四價(jià)體、染色體粘連、落后染色體、染色體橋、微核、分裂不同步等現(xiàn)象發(fā)生。在自然條件下，外界因素或個(gè)體細(xì)胞內(nèi)某些生理、生化過(guò)程可誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)變異。中期Ⅰ四價(jià)體的出現(xiàn)可能導(dǎo)致一部分細(xì)胞中的同源染色體不能準(zhǔn)確地分配到兩極，從而造成染色體的重復(fù)或缺失；落后染色體很可能是四價(jià)體在后期分離產(chǎn)生的，最終形成微核或消失在細(xì)胞質(zhì)中從而導(dǎo)致配子染色體數(shù)不平衡，從而影響超雄株的育性[17]。同源染色體之間出現(xiàn)的一定程度異質(zhì)性導(dǎo)致染色體橋的出現(xiàn)，這可以作為鑒定是否出現(xiàn)染色體倒位的證據(jù)之一[18-19]。在第二次減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)現(xiàn)1～3個(gè)時(shí)期分裂同時(shí)出現(xiàn)在1個(gè)花蕾中，這種不同步性可以擴(kuò)展花期，在發(fā)育過(guò)程中增加兩性功能的有效作用時(shí)間，對(duì)種群繁殖后代有利，是一種適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件的進(jìn)化表現(xiàn)[20-21]。

筆者首次對(duì)蘆筍超雄株的減數(shù)分裂過(guò)程進(jìn)行了較為系統(tǒng)的觀察研究，結(jié)果表明，超雄株花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)2次分裂，最終形成4個(gè)子細(xì)胞。超雄株花粉母細(xì)胞在整個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程中，前期Ⅰ所需時(shí)間最長(zhǎng)。減數(shù)分裂配對(duì)成10個(gè)二價(jià)體，在倍性水平上屬于二倍體。減數(shù)分裂異常行為主要出現(xiàn)在中期Ⅰ和后期Ⅰ。在減數(shù)分裂中期Ⅰ有單價(jià)體、四價(jià)體的產(chǎn)生，后期Ⅰ、后期Ⅱ出現(xiàn)落后染色體、染色體橋、微核等，從而導(dǎo)致小孢子發(fā)育成無(wú)育性的配子，進(jìn)而產(chǎn)生無(wú)活力的花粉，降低了花粉的育性。在花粉母細(xì)胞第二次分裂過(guò)程中出現(xiàn)的染色體不同步現(xiàn)象，在一定程度上延長(zhǎng)了花期，可降低外界極端環(huán)境對(duì)散粉或減數(shù)分裂的影響而增加授粉概率，提高了種群繁殖能力，是一種生物適應(yīng)環(huán)境的進(jìn)化機(jī)制。通過(guò)對(duì)超雄株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程的觀察，有助于了解其花粉形成的過(guò)程和超雄性的起源與進(jìn)化。研究結(jié)果不僅能夠豐富蘆筍的細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容，還可以為蘆筍發(fā)育生物學(xué)、雜交育種、基因定位等方面提供必要的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，為全雄育種和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。隨著雙色熒光原位雜交技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)、DAPI分帶技術(shù)等分子細(xì)胞遺傳學(xué)各種研究手段的不斷改進(jìn)，染色體研究的準(zhǔn)確率有了較大提高，染色體研究將在物種的染色體組分析、物種的起源與演化分析、外源染色體導(dǎo)入片段的鑒定、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)分析等方面有更廣闊的應(yīng)用前景。

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收稿日期：2024-01-09；修回日期：2024-03-28

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022LZGC024）；濰坊市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2022ZJ1084，2021ZJ1128）；濰坊市現(xiàn)代種業(yè)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：李" " 霞，女，研究員，研究方向?yàn)樘J筍遺傳育種及栽培。E-mail：55654687@qq.com

通信作者：李保華，男，研究員，研究方向?yàn)樘J筍育種與栽培及推廣。E-mail：shidaiyi@126.com

楊" " 林，男，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向?yàn)槭卟擞N與栽培。E-mail：80408239@qq.com