摘要 食源性細(xì)菌可造成食物腐敗變質(zhì)并產(chǎn)生多種有害毒素，嚴(yán)重危害食品安全和人體健康。因此，開發(fā)食源性細(xì)菌有效的檢測(cè)方法具有十分重要的意義。本研究提出了基于多重?cái)?shù)字化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）芯片的分析方法，可對(duì)3 種常見食源性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes））進(jìn)行快速且高效的檢測(cè)。此芯片采用離心力驅(qū)動(dòng)的數(shù)字化進(jìn)樣方式， 15 min 內(nèi)即可完成數(shù)字化檢測(cè)過程，操作簡(jiǎn)便。PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)歷25 個(gè)熱循環(huán)后即可檢出陽(yáng)性信號(hào)。此芯片在低濃度細(xì)菌核酸定量檢測(cè)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，可有效避免假陰性結(jié)果。利用此芯片可對(duì)濃度為105～108 CFU/mL 的細(xì)菌樣本進(jìn)行多重檢測(cè)。相比熒光定量PCR 技術(shù)，此芯片在分析低含量靶標(biāo)時(shí)具有更高的準(zhǔn)確度和靈敏度。

關(guān)鍵詞 數(shù)字化芯片；多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；金黃色葡萄球菌；沙門氏菌；單增李斯特菌

食品污染問題是當(dāng)今世界上最廣泛的衛(wèi)生問題之一[1]。病原微生物是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的主要原因之一，可在保存不當(dāng)?shù)氖称分羞^度繁殖而產(chǎn)生大量有害物質(zhì)，嚴(yán)重危害人體健康，甚至導(dǎo)致死亡[2]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和消費(fèi)者認(rèn)知水平的提高，食品安全問題受到了廣泛關(guān)注，這對(duì)食源性細(xì)菌（致病菌）的檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella spp.）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是3 種常見的食源性細(xì)菌，在受到污染的肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品和蔬菜等食品中均能被檢出，其隨食物進(jìn)入人體后可大量繁殖并釋放多種毒性物質(zhì)，從而威脅人體健康，如產(chǎn)生急性胃腸炎、肺炎、偽膜性腸炎、發(fā)熱和惡心等癥狀[3-5]。更為嚴(yán)重的是，食物中有時(shí)可能存在兩種或多種細(xì)菌。因此，構(gòu)建高效的食源性細(xì)菌檢測(cè)方法對(duì)于食品安全存儲(chǔ)、預(yù)防食物中毒及不良反應(yīng)的快速診斷都具有重要意義。

傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法[6-8]是目前檢測(cè)食源性細(xì)菌最常用的檢測(cè)方法，該方法通常需要1～5 d 甚至更久，時(shí)效性較低，并且依賴于專業(yè)的操作人員和特定的工作環(huán)境，步驟繁瑣，對(duì)多種細(xì)菌的同時(shí)檢測(cè)難度較大。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)日益成熟，目前已有多種方法用于食源性細(xì)菌的快速檢測(cè)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction， PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)[9]、核酸探針技術(shù)[10-11]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[12-14]等。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)因其快速、操作簡(jiǎn)單以及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)設(shè)施覆蓋范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際檢測(cè)中被廣泛使用。然而，該技術(shù)在低含量目標(biāo)物檢測(cè)[15]方面尚存在不足，存在假陰性信號(hào)。因此，開發(fā)一種檢出速率快、成本低、靈敏度高以及可多通道檢測(cè)的定量分析技術(shù)用于食源性細(xì)菌的分析檢測(cè)對(duì)保障食品安全至關(guān)重要。

數(shù)字化PCR（Digital PCR， dPCR）技術(shù)[16]是一種被廣泛認(rèn)可的核酸定量檢測(cè)技術(shù)。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)相比，數(shù)字化PCR 技術(shù)在核酸絕對(duì)定量方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，如具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性[17-18]。該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在多個(gè)微單元內(nèi)同時(shí)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，并在反應(yīng)結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性和陰性的單元數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[19]，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)原始樣本中核酸濃度的絕對(duì)定量分析。該技術(shù)不依賴于循環(huán)閾值（Cycle threshold， Ct），也不需要參照已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，是一種更直接有效的定量擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。因此，數(shù)字化PCR 技術(shù)在癌癥早期檢測(cè)[20-21]、單細(xì)胞基因表達(dá)[22]和病原微生物檢測(cè)[23-25]等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

微流體技術(shù)和微加工工藝的成熟促進(jìn)了數(shù)字化PCR 技術(shù)朝著自動(dòng)化和微型化的方向發(fā)展。根據(jù)工藝的不同，數(shù)字化PCR 技術(shù)可分為基于油包水的微滴數(shù)字化PCR（Droplet digital PCR）技術(shù)[26-30]和基于微流控芯片的芯片數(shù)字化PCR（Chip digital PCR）技術(shù)[31-34]。微滴數(shù)字化PCR 平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)更高通量的數(shù)字化分析，因而具有更寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。但是，微滴數(shù)字化PCR 平臺(tái)依賴復(fù)雜昂貴的設(shè)備和較長(zhǎng)的工作流程，導(dǎo)致測(cè)試成本增加，檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)。此外，在液滴轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)生交叉污染，也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。與微滴數(shù)字化PCR 平臺(tái)相比，芯片數(shù)字化PCR 平臺(tái)采用全封閉芯片結(jié)構(gòu)，利用物理屏障將微單元隔開，不僅避免了操作過程中由于碰撞導(dǎo)致的液滴聚集，還可避免交叉污染和降低熱循環(huán)過程中液滴融合的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而確保絕對(duì)定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

基于食源性細(xì)菌的多重檢測(cè)需求和芯片數(shù)字化PCR 的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，本研究構(gòu)建了一種成本低、操作簡(jiǎn)單的多重微流控?cái)?shù)字化PCR 芯片。此數(shù)字化PCR 芯片包括進(jìn)樣區(qū)、數(shù)字化陣列單元和廢液存儲(chǔ)區(qū)3 個(gè)功能區(qū)，其中，數(shù)字化陣列單元包含4 個(gè)平行模塊，每個(gè)平行模塊分布有2400 個(gè)微腔室，用于平行PCR 反應(yīng)。芯片無需精密的注射泵和復(fù)雜的微閥控制進(jìn)樣，直接采用離心力驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣，一次加樣和離心操作即可完成數(shù)字化進(jìn)樣，操作簡(jiǎn)單。與傳統(tǒng)的熒光定量PCR 分析技術(shù)相比，此數(shù)字化PCR 芯片在針對(duì)低濃度細(xì)菌定量檢測(cè)，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌3 種細(xì)菌同時(shí)檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。此芯片技術(shù)具有良好的實(shí)用性，有望成為食源性細(xì)菌多重定量檢測(cè)的有效技術(shù)手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

URE-2000/35 光刻機(jī)（中國(guó)科學(xué)院光電研究所）；PDC-002 等離子清洗機(jī)（美國(guó)Harrick Plasma 公司）；SSNP-9600A 全自動(dòng)核酸提取儀（江蘇碩世生物公司）；Nikon Ti2-E 熒光顯微鏡成像系統(tǒng)（日本尼康公司）；96S 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（上海宏石公司）；高速離心機(jī)（上海安亭公司）；TC-EA 平板PCR 儀（杭州博日公司）。

聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）和Sylgard 184固化劑（美國(guó)DowCorning 公司）；SU8-2050 系列負(fù)光刻膠（美國(guó)Micro Chem 公司）；三甲基氯硅烷（三氟-1，1，2，2-四氫辛基）和吐溫-20（美國(guó)Sigma Aldrich 公司）；SU8 顯影劑（美國(guó)Kayaku Advanced Materials 公司）；300 cst 和10 cst 硅油（麥克林公司）；核酸提取試劑（江蘇碩世公司）；金黃色葡萄球菌核酸檢測(cè)試劑和沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌三重核酸檢測(cè)試劑均購(gòu)自深圳生科原公司；血瓊脂平板（中國(guó)北京陸橋公司）和實(shí)驗(yàn)所用菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S. aureus， ATCC25923）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium， S. typhimurium， ATCC14028）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes， L. monocytogenes，ATCC19115）由蘇州工業(yè)園區(qū)疾病防治中心檢驗(yàn)科微生物室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)字化芯片的制備

根據(jù)PDMS 的微腔結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖紙，采用SU-8 標(biāo)準(zhǔn)濕刻法[35]制作芯片模板。首先在硅片基板上旋涂光刻膠，再移至烘膠臺(tái)，分別于65 ℃加熱2 min， 95 ℃加熱5 min。硅片冷卻后，移至URE-2000/35 光刻機(jī)校準(zhǔn)臺(tái)，覆蓋光掩膜后曝光。曝光后的硅片再移至烘膠臺(tái)，分別于65 ℃加熱3 min、95 ℃加熱6 min。硅片冷卻后，用SU8 顯影劑處理并用氮?dú)獯蹈?，最終得到干凈的硅片模具。

將得到的硅片和50 μL 烷基化試劑置于干燥皿中，室溫下抽真空，靜置6 h。將PDMS 預(yù)聚物和固化劑以體積比10∶1 混勻，并利用真空泵脫氣去除混合液中的氣泡，獲得PDMS 混合物。采用旋涂機(jī)在硅片模具上旋涂一層PDMS 混合物，并于70 ℃烘箱中固化。在固化后的PDMS 表面覆蓋大小合適的玻片，并用PDMS 混合物進(jìn)一步封裝固化。取下固化后的PDMS，將非圖案部分切掉，并用打孔器在進(jìn)出樣口部分打孔。將PDMS 和載玻片用等離子清洗機(jī)處理，再將二者鍵合封裝。封裝后的芯片在110 ℃烘箱內(nèi)保溫3 h， 得到實(shí)驗(yàn)用芯片。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)和核酸提取

分別挑取3 種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干磁珠1 顆于10 mL 營(yíng)湯肉湯過夜培養(yǎng)。將復(fù)蘇后的菌液分別接種于3 個(gè)血瓊脂平板：金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌在36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；單增李斯特菌在36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。分別挑取單個(gè)新鮮菌落用無菌生理鹽水稀釋，并充分混勻，采用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)整濁度至0.5 McF（約相當(dāng)于細(xì)菌濃度1.5×108 CFU/mL）。將108 CFU/mL 菌液稀釋10 倍，獲得一組4 個(gè)梯度密度的細(xì)菌懸液，每種菌每個(gè)稀釋濃度取200 μL， 上機(jī)30 min 完成核酸提取。

1.2.3 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

金黃色葡萄球菌的熒光定量PCR 反應(yīng)體系包括：0.5 μL 聚合酶、15.5 μL PCR 反應(yīng)液、1 μL 核酸和1 μL 10% 吐溫-20。PCR 反應(yīng)參數(shù)為：UNG 處理50 ℃， 2 min；預(yù)變性95 ℃， 3 min；PCR 擴(kuò)增每個(gè)循環(huán)為95 ℃、5 s 和55℃、60 s；40 個(gè)循環(huán)。沙門氏菌和單增李斯特菌的PCR 反應(yīng)體系和參數(shù)以及3 種組分的多重PCR 按同樣方法完成。采用無菌生理鹽水作為陰性對(duì)照樣本。

1.2.4 芯片上的數(shù)字化樣品加載

采用移液器將1.2.3 節(jié)得到的PCR 反應(yīng)溶液（18 μL）和硅油（10 cst， 40 μL）依次加入芯片的進(jìn)樣口，將芯片放入改裝后的離心機(jī)托盤中固定，以2000 r/min 運(yùn)行15 min， 完成數(shù)字化樣品加載。數(shù)字化加樣完成后，在芯片的進(jìn)樣口和出樣口充注硅油（300 cst）封閉微腔，以防止PCR 過程中低粘度硅油揮發(fā)。

1.2.5 數(shù)字化芯片檢測(cè)

首先測(cè)試金黃色葡萄球菌在1×100、1×10?1、1×10?2 和1×10?3 不同稀釋度下的PCR 擴(kuò)增結(jié)果。將含有不同濃度靶標(biāo)核酸的PCR 反應(yīng)溶液注入數(shù)字化芯片，完成數(shù)字化加載后移至芯片反應(yīng)器（配備平板加熱裝置），按照1.2.3 節(jié)的PCR 反應(yīng)條件運(yùn)行擴(kuò)增程序。采用無菌生理鹽水作為陰性對(duì)照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用熒光顯微鏡（尼康-Ti2）獲取熒光圖像。采用Image J 軟件處理采集的熒光照片數(shù)據(jù)，調(diào)整合適的閾值以區(qū)分陽(yáng)性孔和陰性孔并計(jì)數(shù)，根據(jù)泊松分布統(tǒng)計(jì)目標(biāo)核酸的濃度。FAM 熒光染料用于指示金黃色葡萄球菌單重PCR 結(jié)果；FAM、VIC 和CY5 熒光染料分別指示沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的三重PCR 結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 微芯片結(jié)構(gòu)表征

數(shù)字化芯片制作和分析流程圖如圖1 所示。本研究采用玻片-PDMS-玻片“三明治”結(jié)構(gòu)，夾在兩個(gè)玻片之間的PDMS 薄膜厚度（旋涂厚度）約為0.3 mm， 可以最大限度減少PCR 熱循環(huán)過程中的水分丟失。此芯片設(shè)計(jì)為單層模板結(jié)構(gòu)，可顯著降低模具的制作難度。每個(gè)數(shù)字化芯片（圖2A）分為4 個(gè)平行模塊，每個(gè)模塊含有2400 個(gè)微腔陣列，因此，單個(gè)樣品數(shù)字化后將被分割為9600 個(gè)獨(dú)立微腔室，進(jìn)樣口、陣列微室和儲(chǔ)液腔通過微通道連接。如圖2B 所示，芯片微腔的長(zhǎng)和寬均為180 μm， 高度為80 μm。微孔之間的間距為90 μm，通過60 μm寬的通道相連接。芯片制備可預(yù)先完成，包括制作模板、等離子處理和鍵合等步驟。數(shù)字化PCR 檢測(cè)過程，包括提取核酸、離心加樣、PCR 擴(kuò)增和分析，共需3 h。

芯片的工作原理是通過離心產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)力推動(dòng)進(jìn)樣口內(nèi)的液體進(jìn)入芯片。實(shí)驗(yàn)采用密度小于水的不混溶相，在進(jìn)樣口中， PCR 反應(yīng)液（水相）位于底層并優(yōu)先進(jìn)入芯片陣列區(qū)結(jié)構(gòu)。待水相全部進(jìn)入數(shù)字化陣列區(qū)后，油相也隨之進(jìn)入陣列區(qū)，最終充滿通道，并將微腔室內(nèi)的水相隔離，以確保后續(xù)的數(shù)字化擴(kuò)增反應(yīng)。

為驗(yàn)證芯片的數(shù)字化分析性能，本研究首先采用FAM 染料水溶液和硅油模擬數(shù)字化結(jié)果。在進(jìn)樣口加入模擬的水樣品和硅油后，裝載芯片，通過離心驅(qū)動(dòng)液體進(jìn)入芯片微腔。由于硅油比重（0.96 g/mL，25 ℃）小于水相，因此，在進(jìn)樣口中油相位于上層，水相位于下層，水相優(yōu)先進(jìn)入芯片微腔室，然后硅油進(jìn)入芯片，并將微腔室的水相隔離。圖2C 為數(shù)字化過程結(jié)束后局部芯片陣列結(jié)構(gòu)的熒光圖像，結(jié)果表明，水相只在微腔室內(nèi)存在，微腔中的模擬水樣品可以被硅油完全隔離開。因此，此設(shè)計(jì)可進(jìn)一步用于后續(xù)的食源性細(xì)菌核酸數(shù)字化分析的實(shí)驗(yàn)。

芯片采用離心力驅(qū)動(dòng)液體數(shù)字化過程。圖3 展示了不同離心轉(zhuǎn)速下芯片微腔室內(nèi)的加載分配情況。在選定的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，在較高的轉(zhuǎn)速下，液體受到的離心力越大，進(jìn)入微腔室的水相體積越多，越有利于完整的數(shù)字化過程。由于等離子處理后的玻璃和PDMS 表面均為親水性，本實(shí)驗(yàn)中的水相會(huì)直接接觸芯片內(nèi)壁。為避免水相在微通道壁殘留，本研究采用將芯片置于鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行熱處理的方式將親水內(nèi)表面轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷砻妗D4 為數(shù)字化芯片鍵合后在110 ℃烘箱中處理不同時(shí)間的油水界面圖，根據(jù)兩相在PDMS 表面的接觸角可以判斷出，在熱烘3 h 后芯片表面轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷砻妗?/p>

2.2 熒光定量PCR 檢測(cè)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌

常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析技術(shù)中，通常在Ct 值為15～35 時(shí)才有定量分析參考價(jià)值。在痕量核酸檢測(cè)體系中，在35 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后才會(huì)出現(xiàn)明顯的識(shí)別信號(hào)，這導(dǎo)致其與假陰性信號(hào)難以區(qū)分。數(shù)字化分析技術(shù)對(duì)于低濃度核酸的定性和定量檢測(cè)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。為驗(yàn)證本研究設(shè)計(jì)的數(shù)字化芯片的檢測(cè)性能，首先利用熒光定量PCR 技術(shù)分別對(duì)3 種不同濃度的目標(biāo)細(xì)菌核酸進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。如圖5 所示， 3 種細(xì)菌低倍稀釋后，其提取核酸的擴(kuò)增曲線（a～d）可以較好地進(jìn)行定性和定量分析；然而，高倍稀釋后（e～f），擴(kuò)增曲線的Ct 值均為35 或者更大，臨床結(jié)果參考價(jià)值較低。例如，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌樣本稀釋500 倍時(shí)，得到的Ct 值分別為37.52、36.56 和36.65；當(dāng)3 種細(xì)菌稀釋1000 倍時(shí)，均已無法得到Ct 值，根據(jù)試劑盒說明書指導(dǎo)，結(jié)果判定為陰性。上述結(jié)果表明，此技術(shù)在檢測(cè)低豐度靶標(biāo)時(shí)可能存在假陰性，難以實(shí)現(xiàn)定量分析。

將已知濃度的金黃色葡萄球菌樣品稀釋1000 倍后，采用此數(shù)字化芯片進(jìn)行分析，并進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，觀測(cè)芯片內(nèi)的熒光信號(hào)變化（圖6）。在經(jīng)歷25 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后，其中一些微腔顯示出可識(shí)別的熒光信號(hào)。當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)延長(zhǎng)至40 個(gè)循環(huán)后，陽(yáng)性微腔內(nèi)的熒光信號(hào)略有增強(qiáng)，但其數(shù)目占總腔室數(shù)目（陽(yáng)性孔/（陽(yáng)性孔數(shù)目+陰性孔數(shù)目））的比值未發(fā)生變化，表明此數(shù)字化芯片內(nèi)的擴(kuò)增反應(yīng)在經(jīng)歷25 個(gè)循環(huán)后即可以準(zhǔn)確顯示陽(yáng)性結(jié)果。進(jìn)一步利用此數(shù)字化芯片對(duì)不同稀釋倍數(shù)的樣本進(jìn)行分析，如圖7 所示，不同陽(yáng)性微孔的數(shù)目對(duì)應(yīng)不同的靶標(biāo)濃度。由圖7A 可見，當(dāng)待測(cè)核酸濃度過高時(shí)，此芯片僅適用于定性檢測(cè)，不適用于定量分析（單個(gè)微腔室內(nèi)可能出現(xiàn)多于一個(gè)的拷貝數(shù)）；當(dāng)待測(cè)核酸濃度較低時(shí)，芯片展現(xiàn)出較高的分析效率和分析準(zhǔn)確度。例如，當(dāng)金黃色葡萄球菌稀釋1000 倍時(shí)，依然可以準(zhǔn)確地識(shí)別并給出陽(yáng)性結(jié)果?？瞻讓?duì)照結(jié)果（圖7E）表明，此芯片分析平臺(tái)可以有效避免污染和假陽(yáng)性結(jié)果。如圖7F 所示，利用此芯片可對(duì)濃度為105～108 CFU/mL 的細(xì)菌樣本進(jìn)行多重檢測(cè)，并且具有較好的線性關(guān)系，表明此芯片適用于對(duì)低濃度靶標(biāo)的定量檢測(cè)。

2.3 數(shù)字化芯片多重定量分析

在日常檢測(cè)中經(jīng)常會(huì)有幾種細(xì)菌共存于一個(gè)樣品的情況。因此，多重食源性細(xì)菌的檢測(cè)更具有實(shí)際意義。為驗(yàn)證本研究設(shè)計(jì)的芯片的多重檢測(cè)能力，考察了此芯片對(duì)稀釋不同倍數(shù)的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌混合樣品的檢測(cè)性能，并與熒光定量PCR 結(jié)果進(jìn)行比較。3 種致病菌的熒光定量PCR 擴(kuò)增曲線如圖8 所示，將樣本稀釋500 倍時(shí)， 3 種致病菌擴(kuò)增曲線的Ct 值分別為36.83、36.01和36.04；將樣本稀釋1000 倍后，均無法測(cè)得Ct 值。因此，熒光定量PCR 技術(shù)不適用于該濃度范圍內(nèi)的核酸檢測(cè)。圖9為數(shù)字化芯片對(duì)3 種致病菌混合樣本稀釋1000 倍后的分析結(jié)果。3 個(gè)熒光通道（分別對(duì)應(yīng)紅、藍(lán)、綠3 種顏色）分別對(duì)應(yīng)3 種細(xì)菌（圖9A～9C）。通過對(duì)選區(qū)微腔室的灰度值進(jìn)行計(jì)算，如圖9E～9G 所示， 3 種細(xì)菌的陽(yáng)性和陰性灰度值的比值分別約為4、9 和3 倍。當(dāng)對(duì)應(yīng)的灰度值閾值分別設(shè)置為420、580 和340 時(shí)，可以對(duì)此芯片上所有微腔室的熒光結(jié)果進(jìn)行有效統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明， 3 種細(xì)菌在多重PCR 實(shí)驗(yàn)條件下依然可通過微腔室之間的熒光強(qiáng)度差異而被準(zhǔn)確識(shí)別。即使單個(gè)微腔室中存在兩種以上不同種核酸時(shí)，陽(yáng)性熒光信號(hào)依然可以被準(zhǔn)確區(qū)分（圖9D）。因此，本研究設(shè)計(jì)的數(shù)字化芯片在低豐度食源性細(xì)菌的多重定性檢測(cè)方面具有應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)了一種基于微流控芯片的數(shù)字化PCR 分析裝置，成功實(shí)現(xiàn)了3 種食源性細(xì)菌的高靈敏檢測(cè)。利用離心進(jìn)樣方法， 15 min 即可完成樣品加載，操作簡(jiǎn)便。與傳統(tǒng)的熒光定量PCR 技術(shù)相比，此芯片在定量檢測(cè)低濃度核酸靶標(biāo)時(shí)具有顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)在多重細(xì)菌檢測(cè)方面也具有優(yōu)異的性能。然而，此技術(shù)也存在一些需要改進(jìn)之處，如核酸檢測(cè)依然需要先提取核酸再進(jìn)行分析，后續(xù)研究將進(jìn)一步對(duì)芯片結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)無提取、直接擴(kuò)增的分析策略；本研究采用PDMS 制作芯片不利于商業(yè)化產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用推廣，后續(xù)研究將繼續(xù)探索塑料等芯片的制備技術(shù)，以推進(jìn)此數(shù)字化PCR 技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。

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