摘要：為明確甘肅省張掖市甘藍(lán)黑腐病的病原菌種類，采用平板劃線法對采集到的甘藍(lán)典型發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌分離、致病性測定及基因序列分析鑒定。結(jié)果表明，從具有典型黑腐病的甘藍(lán)葉片上分離純化獲得6個分離株，其中菌株GL3-2為引起該病害的病原菌，為革蘭氏陰性菌，菌落近似圓形，初呈淡黃色，后漸變?yōu)槊埸S色，菌落邊緣整齊光滑， 有隆起，且具光澤；菌體多呈短桿狀， 大小為（0.5～1.0）μm×（1.0～3.0）μm，無芽孢，單生或鏈生。根據(jù)培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征以及16S rDNA和特異性基因序列分析，確定致病菌菌株GL3-2為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestris pv. campestris）。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)黑腐病菌；病原菌；分離；鑒定

中圖分類號：S635；Q938 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2097-2172（2024）08-0779-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.08.015

Isolation and Identification of the Pathogen Causing Black Rot of

Cabbage in Gansu Province

HE Shuwen 1， WEI Xingying 2， XU Yongfeng 1， YANG Chengde 2， WANG Zehao 1， HUA Jun 1

（1. Zhangye Plant Protection and Phytosanitary Station， Zhangye Gansu 734000， China; 2. College of Plant Protection，

Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： To clarify the pathogen causing cabbage black rot in Zhangye City， Gansu Province， the cabbage leaves with typical disease symptoms were collected for pathogen isolation， purification by using plate scribing method. The pathogenicity was determined， and pathogen also was identified by morphological characteristics and molecular biology methods. The results showed that 6 isolates were obtained， among which GL3-2， Gram-negative， was pathogenic bacteria. Its colony was round， light yellow at first， and then honey yellow gradually. The colony edges were neat， smooth， and glossy; Most of the bacteria were short rods with the size of（0.5 to 1.0） μm ×（1.0 to 3.0） μm. No spores， solitary or chained， extremely solitary flagella. GL3-2 was identified as Xanthomonas campestris pv. campestris based on culture traits， morphological characteristics， 16S rDNA and specific genes sequence analysis.

Key words： Black rot of cabbage; Pathogen; Isolation; Identification

甘藍(lán)（Brassicao leracea var. capitata）屬十字花科蕓薹屬，草本植物，最早發(fā)現(xiàn)于地中海至北海沿岸地區(qū)，16世紀(jì)左右由俄羅斯以及東南亞地區(qū)傳入我國，因其口感美味且具有極高的食用價值和營養(yǎng)價值而深受人們喜愛［1 ］。甘藍(lán)在全球各地均廣泛種植，尤其在中國更具有悠久的種植栽培文化歷史，播種面積逐年增加［2 ］，目前我國甘藍(lán)播種總面積在93.6萬hm2以上，且栽培總面積連年遞增，在我國蔬菜的供給以及進(jìn)出口貿(mào)易中占據(jù)市場主導(dǎo)地位［3 ］。黑腐病是危害甘藍(lán)生長的重要病害之一，感病后導(dǎo)致幼苗期和成株期甘藍(lán)不能正常生長。成株期感染，出現(xiàn)葉斑和葉脈變黑，影響植株正常生長，嚴(yán)重時可導(dǎo)致大面積死亡，給甘藍(lán)生產(chǎn)帶來極大危害。20世紀(jì)50年代末，甘藍(lán)黑腐?。╔anthomonas campestris）在我國華北地區(qū)被首次發(fā)現(xiàn)，至20世紀(jì)70年代中期，甘藍(lán)黑腐病在我國山西、北京以及山東等地區(qū)大面積傳播，造成適宜甘藍(lán)栽培的種植區(qū)域不斷減少［4 ］。至20世紀(jì)80年代，甘藍(lán)黑腐病在我國各栽培地區(qū)全面暴發(fā)，使得甘藍(lán)及其他十字花科蔬菜產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重威脅，發(fā)生嚴(yán)重時造成甘藍(lán)減產(chǎn)近70%，極大地降低了甘藍(lán)的品質(zhì)和出口量，這也成為影響甘藍(lán)經(jīng)濟(jì)效益的主要因素之一［5 ］。近年來，由于部分甘藍(lán)生產(chǎn)地區(qū)多年連作，加之夏季陰雨連綿，甘藍(lán)黑腐病大面積發(fā)生和傳播，且逐年加重［6 ］。有關(guān)甘藍(lán)黑腐病的研究國內(nèi)外均有較多報道，但關(guān)于引起甘肅省甘藍(lán)黑腐病的病原種類是否與國內(nèi)外報道一致，還需有待進(jìn)一步確定。因此，我們以采自甘肅省張掖市甘藍(lán)種植基地具備甘藍(lán)黑腐病典型特征的標(biāo)本為研究對象，對其進(jìn)行癥狀描述、病原菌分離、致病性測定及基因序列分析鑒定，以期為甘肅省甘藍(lán)黑腐病田間診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試甘藍(lán)品種為甘中11號，購自甘肅省蘭州市安寧區(qū)農(nóng)資市場。 供試甘藍(lán)黑腐病標(biāo)本采自甘肅省張掖市黨寨鎮(zhèn)汪家鋪村甘藍(lán)大田。將甘藍(lán)種子經(jīng)過浸種、催芽處理后，播種于直徑為20 cm的花盆內(nèi)（栽培基質(zhì)為蛭石和營養(yǎng)土按體積比為1∶1的比例混合而成），每盆8～12株，出苗后每盆保苗6株。

1.1.2 儀器及器材 打孔器、接種針、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、搖床、錐形瓶、移液槍、Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（B518259-0100）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，光學(xué)顯微鏡（Ni-U 顯微鏡）由日本 Nikon 公司提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）：瓊脂18 g，葡萄糖8 g，蛋白胨6 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 000 mL；NB培養(yǎng)基：瓊脂18 g，酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，NaCl 10 g；LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 甘藍(lán)黑腐病菌的分離

采用平板劃線分離法進(jìn)行分離。在無菌條件下，用滅菌的手術(shù)刀切取甘藍(lán)葉片病健交界處組織（1 cm×1 cm），利用1 g/kg升汞表面消毒1 min，無菌水連續(xù)反復(fù)沖洗3次，置于無菌研缽中研磨后靜置2～3 min，用滅菌的接種針（或滅菌竹簽）蘸取上清液，并在NA培養(yǎng)基上劃線，28 ℃下培養(yǎng)3～5 d，純化后進(jìn)行編號，并于4 ℃保存?zhèn)溆茫? ］。

1.3 致病性測定

采用致傷接種法進(jìn)行致病性測定。將分離物接種于NA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。經(jīng)活化的分離物接種至NB培養(yǎng)液中（50 mL），180 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 d，獲得細(xì)菌懸浮液。利用分光光度計將菌懸液濃度調(diào)整至1×105個/mL（利用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋），并針刺致傷后噴霧接種，以接種無菌水的植株作為對照（CK），3次重復(fù)，室內(nèi)保濕48 h后，逐天觀察發(fā)病情況，對出現(xiàn)癥狀的植株進(jìn)行再分離，將再分離物的菌落形態(tài)以及菌體形態(tài)等與接種分離物進(jìn)行比較，利用柯赫氏法則進(jìn)行病原菌鑒定。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

參照董漢松等［8 ］的《植病研究方法》將分離和純化的甘藍(lán)黑腐病菌株接種至NA培養(yǎng)基上，進(jìn)行四區(qū)劃線，觀察單菌落的形態(tài)、大小以及顏色等，記錄并拍照。對病原菌（菌齡18～24 h）進(jìn)行革蘭氏染色，觀察病原菌菌體的顏色和形狀，測量菌體的大小。

1.5 病原菌的16S rDNA基因序列分析鑒定

1.5.1 基因DNA的提取 參照Alvarez等［9 ］的方法，選用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒及其方法提取病原菌的基因組DNA［10 ］，具體方法按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5.2 PCR擴(kuò)增 利用通用引物27F（5'-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，參考楊麗萍等［11 ］的方法并經(jīng)優(yōu)化后應(yīng)用于本試驗。擴(kuò)增體系為：Master Mix 22 μL；DNA 1 μL；1492R 1 μL；27F 1 μL。

擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法：取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在含有1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，由西安擎科生物工程有限公司對具特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，所得序列于BLAST比對，用Mega 7.0采用鄰接法（Neighbor-Joining methods）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹［12 ］，初步確定病原菌的分類地位。

進(jìn)一步利用野油菜黃單胞菌的特異性引物（DLH120，DLH125；Zup2309，Zup2310）進(jìn)行擴(kuò)增［13 ］。擴(kuò)增體系參照張娜娜等［14 - 15 ］的方法進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、測序和比較分析，最終構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以進(jìn)一步鑒定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 25.0和DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及致病性測定

2.1.1 病害癥狀 甘藍(lán)黑腐病苗期、成株期均可發(fā)病。幼苗染病，子葉水漬狀，導(dǎo)致枯死或逐漸蔓延至真葉，最后整株枯死。成株期多從葉緣開始，逐步向內(nèi)擴(kuò)展，形成V型黃褐色病斑，健部界限不明顯，且病斑周圍組織變黃（圖1A、圖1B）。有時病菌沿葉脈向里擴(kuò)展，形成網(wǎng)狀黑脈或黃褐色大斑塊；若病菌從植株傷口侵入，可在葉片的任何部位形成不規(guī)則形的黃褐色病斑；天氣干燥時，葉片病斑干而脆；濕度較大時，發(fā)病部位腐爛，無臭味（圖1C、圖1D）。與已報道癥狀相似［16 - 17 ］。

2.1.2 病原菌分離 從張掖市甘藍(lán)種植地采集的具有典型黑腐病的甘藍(lán)葉片上分離得到6個分離物，分別命名為GL1、GL2、GL3-1、GL3-2、GL4-1、GL4-2。其中GL1菌落圓形，邊緣整齊，淡黃色（圖2A）；GL2菌落近圓形，淺黃色，表面干燥，粗糙（圖2B）；GL3-1菌落近圓形，扁平，淺白色，菌體濕潤，半透明（圖2C）；GL3-2菌落圓形，偏小，凸起，黃色，有光澤（圖2D）；GL4-1菌落淺白色，光滑，扁平（圖2E）；GL4-2菌落圓形，邊緣光滑，淺黃色，扁平（圖2F）。

2.1.3 致病性測定 將6株分離物進(jìn)行盆栽致病性測定結(jié)果（圖3）可知，接種5～7 d后，接種分離物GL1、GL2、GL3-1的甘藍(lán)葉片和CK均未發(fā)生明顯癥狀，接種分離物GL4-1和GL4-2的甘藍(lán)植株葉片在2 d后逐漸開始失水、萎蔫，皺縮（圖3b、圖3c）；接種GL3-2的甘藍(lán)植株葉片3 d后逐漸變黃，且出現(xiàn)病斑，病斑形狀近似“V”字，多呈淡褐色，且邊緣明顯出現(xiàn)黃色暈圈（圖3d、圖3e、圖3f），與田間甘藍(lán)黑腐病的典型癥狀一致，并在發(fā)病植株上再次分離得到接種分離物GL3-2。依據(jù)柯赫氏法則［18 ］，將GL3-2分離菌物確定為甘肅省甘藍(lán)黑腐病病原菌。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 病原菌的菌落特征及形態(tài) 將病原菌GL3-2接種于NA平板上，28 ℃培養(yǎng)18～24 h后，菌落近圓形，前期淡黃色，后期逐漸變?yōu)槊埸S色，菌落邊緣完整，有凸起，且具光澤。通過革蘭氏染色呈陰性，菌體多數(shù)呈短桿狀，大小為（0.5～1.0） μm×（1.0～3.0） μm，無芽孢，菌體多為單生或鏈生（圖4Ⅰ、圖4Ⅱ、圖4Ⅲ）。

2.2.2 基因序列分析鑒定 以病原菌GL3-2的基因組DNA為模板，利用27F和1492R通用引物對16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增、測序，并在Blast中進(jìn)行相似性分析、同源性比對，選擇同源性較高的序列，使用Mega7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，病原菌與Xanthomonas campestris（登錄號：KR708907.1）和X. arboricola pv. pruni（登錄號：LC388643.1）等同源性均高（相似度達(dá)99%），且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在同一分支，初步鑒定為野油菜黃單胞桿菌屬（Xanthomonas sp.）（圖5）。為進(jìn)一步分析鑒定，利用兩對特異性引物擴(kuò)增、測序和比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖6）表明GL3-2與X. campestris pv. campestris（登錄號：CP142008.1、CP017319.1和AP019682.1等）的同源性均很高（相似度達(dá)99%），且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起。根據(jù)形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，確定GL3-2為野油菜黃單胞桿菌野油菜致病變種（X. campestris pv. campestris）。

3 討論與結(jié)論

蔬菜是人類日常生活必需的副食品，其中，甘藍(lán)是居民餐桌上的重要蔬菜之一。甘藍(lán)所含營養(yǎng)成分相當(dāng)豐富，其中包含有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、纖維素、礦物質(zhì)以及維生素等，且甘藍(lán)所含的植化素還可預(yù)防癌癥和冠狀動脈等疾病［19 ］。據(jù)報道，20世紀(jì)80年代以前，甘肅省甘藍(lán)年種植基數(shù)基本穩(wěn)定于666.7 hm2左右。近年來，甘肅省甘藍(lán)年種植面積約6 666.7 hm2，在全省各地均已有分布［20 - 21 ］。但是，隨著高原夏菜大面積種植，甘藍(lán)病害在很多種植區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，嚴(yán)重影響甘藍(lán)的質(zhì)量和產(chǎn)量。

黑腐病的寄主范圍相當(dāng)廣泛，主要危害甘藍(lán)、結(jié)球白菜和不結(jié)球白菜等十字花科蔬菜［22 - 23 ］。本研究從張掖市甘藍(lán)種植地采集的具有典型黑腐病的甘藍(lán)葉片上分離得到細(xì)菌6個分離株，其中菌株GL3-2為引起該病害的病原菌，為革蘭氏陰性菌，菌落近似圓形，初呈淡黃色，后漸變?yōu)槊埸S色，菌落邊緣整齊光滑，有隆起，且具光澤；菌體多呈短桿狀，大小為（0.5～1.0）μm×（1.0～3.0）μm，無芽孢，單生或鏈生。根據(jù)培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征以及生物學(xué)鑒定，明確了甘肅省甘藍(lán)黑腐病病原菌GL3-2為野油菜黃單胞桿菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestris pv. campestris），與蘆燕［24 ］、解永梅等［25 ］、鄭學(xué)立等［26 ］和Afrin等［27 ］對大白菜黑腐病和甘藍(lán)黑腐病病原菌的鑒定結(jié)果一致。為了更精確地鑒別了病原菌種類，本試驗參考Burlakoti等［13 ］的方法對甘藍(lán)黑腐病的病原鑒定采用多基因序列分析方法，對黃單胞菌屬中的不同種細(xì)菌進(jìn)行快速檢測，與金夢軍等［28 ］通過利用多基因鑒定的方法對高寒草地青藏苔草拮抗內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了鑒定類似，有效地避免了利用單一基因鑒定過程中出現(xiàn)的偶然現(xiàn)象。本研究結(jié)果為甘肅省甘藍(lán)黑腐病的診斷提供了依據(jù)，也為后期進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

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