關鍵詞多功能水凝膠；硫化鉍-金納米簇；光熱治療；熒光；術后傷口

世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2020 全球癌癥報告》顯示， 2020 年全球癌癥新發(fā)1930 萬，死亡近1000 萬，預計到2040 年，全球癌癥新發(fā)病例將達到2700 萬[1]。目前，手術切除仍是實體腫瘤主要的臨床治療方式之一。手術切除后輔助全身化療或局部放療是目前防治癌癥復發(fā)的主要策略[2-3]。但是，由于某些惡性腫瘤對輻射或化療藥物不敏感，加上術后組織缺失容易引發(fā)細菌感染，造成術后傷口愈合不良[4-5]。因此，亟需開發(fā)新的術后輔助治療平臺，實現(xiàn)殘留腫瘤細胞清除，防止手術切除部位細菌感染。

水凝膠是目前生物材料領域的研究熱點。水凝膠具有良好的生物相容性、生物降解性、穩(wěn)定性以及可調(diào)的孔隙度和機械強度，可使傷口區(qū)域保持相當?shù)某睗駸o菌環(huán)境。盡管傳統(tǒng)水凝膠制備方法簡單，但由于不能完全覆蓋不規(guī)則傷口，限制了其在傷口愈合過程中的應用。目前，研究者已經(jīng)開發(fā)了具有不同特性的各種新型水凝膠敷料[6-12]，其中，可注射水凝膠可通過微創(chuàng)給藥實現(xiàn)持續(xù)的藥物釋放，引起了廣泛關注。熒光成像因具有非放射性、可視化、簡便、安全和高靈敏度等優(yōu)勢，已被廣泛用于腫瘤診斷、生物分子檢測和藥物分析等領域[13-18]。將熒光納米材料與水凝膠結合構筑多功能可注射水凝膠，可實現(xiàn)實時精確可視化監(jiān)測傷口填充情況，防止傷口創(chuàng)面敷料貼合不完全造成傷口創(chuàng)面暴露而影響傷口愈合。

光熱治療（PTT）是指在近紅外（NIR）激光照射下，聚集在腫瘤組織部位的納米光熱材料將光能轉(zhuǎn)化為熱能，從而使腫瘤部位局部升溫并產(chǎn)生大量氧自由基，進而殺死腫瘤細胞的治療方法[19-21]?；贜IR的光熱治療被認為是一種有效的癌癥治療策略。同時，光熱試劑可通過局部升溫引發(fā)細菌內(nèi)蛋白質(zhì)變性和膜通透性的變化，最終殺死細菌[22]，進而改善傷口病灶微環(huán)境，促進傷口愈合。

基于此，本研究采用快速凝膠的方法設計了具有黏附性、光熱性能、熒光性能和可注射的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠。在室溫（25 ℃）下，鄰苯二酚改性殼聚糖（CHI-C）和硫化鉍-金納米簇納米顆粒（Bi2S3-Au NCs NPs）經(jīng)過簡單攪拌混勻后，放置1 min 即可形成交聯(lián)網(wǎng)絡。所制備的水凝膠具有以下優(yōu)點：（1）可在小鼠創(chuàng)面原位凝膠化，適應不規(guī)則的創(chuàng)面形狀，促進創(chuàng)面愈合；（2）具備優(yōu)異的光熱性能，可殺死腫瘤殘余組織及感染細菌，為降低術后腫瘤復發(fā)及改善術后傷口微環(huán)境提供保障；（3）具有熒光性能，可用于實時精確監(jiān)測其在傷口部位的填充情況。本研究所制備的水凝膠為降低腫瘤術后復發(fā)風險和防止傷口感染提供了新的策略。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-6000 熒光分光光度計（日本島津公司）；VERTEX70 近紅外激光器（美國布魯克公司）；ZEN3690馬爾文激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；FD-1D-50 冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；WFH-203B 三用紫外燈（上海耀壯檢測儀器設備有限公司）；FLIR E40 紅外熱成像儀（上海前視紅外光電科技有限公司）；Varioskan LUX 多功能酶標儀、HAAKE RheoStress 6000 旋轉(zhuǎn)流變儀和ThermoScientific Nicolet iN10 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；HITACHI SU8010 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）。

牛血清白蛋白（BSA，≥98.0%，德國Biofroxx 公司）；HNO3（65%～68%，國藥集團化學試劑有限公司）；殼聚糖（CS，脫乙酰度≥ 95%，黏度100～200 mPa·s， 中分子量，上海麥克林生化科技有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）和DMEM 培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司）。其它試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。昆明鼠（華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心）；小鼠黑色素瘤細胞（B16F10）、金黃色葡萄球菌（S. aureus，編號ATCC6538）和大腸桿菌（E. coli，編號ATCC25922）均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究所。實驗用水為超純水（18.2 MΩ?cm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 水凝膠的制備

配制CS-HCl 溶液（0.5 g CS 溶于50 mL 0.1 mol/L HCl 溶液中）。將0.24 g 3，4-二羥基苯甲酸、1.24 g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC）和0.37 g N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）溶于25 mL HCl-無水乙醇（1∶1， V/V）混合溶液中，將此溶液加入到CS 溶液中，調(diào)至pH 4.5～5.5，室溫攪拌12 h，得到的粗產(chǎn)物在稀HCl（pH 5）中透析2 d， 冷凍干燥后，得到CHI-C。

參考文獻[23]的方法制備Bi2S3-Au NCs NPs。稱取33 mg Bi2S3-Au NCs NPs 固體粉末，超聲下溶于450 μL 超純水中。稱取0.015 g CHI-C 于樣品瓶中，加入550 μL 超純水，攪拌溶解。將Bi2S3-Au NCs NPs溶液和CHI-C 溶液混合，渦旋振蕩約1 min， 靜置1 min 左右，制得Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠。

1.2.2 水凝膠的光熱性能評價

配制不同濃度（CBi=0、1、2、3 和4 μg/mL）的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠，總體積為1 mL，采用808 nm NIR（2 W/cm2）照射10 min， 用數(shù)顯溫度儀每30 s 記錄一次溶液溫度。

1.2.3 水凝膠的體外抗菌性能評價

將E. coli 或S. aureus 懸浮液（100 μL， 107 CFU/mL）與1 mL Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠混合，用808 nm NIR（2 W/cm2）照射10 min。1 h 后， 用1 mL 無菌PBS 重懸細菌。取100 μL 重懸菌液涂布于瓊脂平板上，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。以未經(jīng)NIR 照射的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠為對照組。

1.2.4 MTT 法評價材料的細胞相容性

采用MTT 法研究水凝膠的細胞相容性[24]。在37 ℃下，將滅菌的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠在含有胎牛血清（10%）和青霉素-鏈霉素（1%）的DMEM 完全培養(yǎng)基中共孵育24 h， 然后取上清液，與B16F10 細胞繼續(xù)孵育24 h， 測量吸光度。

1.2.5 活體小鼠傷口愈合實驗性評價

將20 只C57BL/6 雌性小鼠大腿內(nèi)側(cè)部位毛發(fā)剔除，皮下注射B16F10 細胞（100 μL，約106 cell）后，每天定期觀察小鼠原發(fā)腫瘤生長情況，以及小鼠的體重、進食、活動和精神狀態(tài)，大約7 d 后完成荷瘤小鼠模型構建。

在無菌條件下，在小鼠腹腔注射80 μL 1.5%戊巴比妥溶液進行麻醉，用手術剪剝離腫瘤后，將50 μLS. aureus 菌液（107 CFU/mL）滴在傷口上。所有小鼠隨機分為5 組：（1） 空白對照組，對傷口不做任何治療處理；（2） 創(chuàng)口貼組，作為陽性對照組；（3） BSA-CHI-C 水凝膠組；（4） Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠組；（5） Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠+NIR（808 nm， 2 W/cm2）組。實驗期間共給藥4 次，記錄3、7、11 和14 d 小鼠傷口愈合情況，在14 d 處死小鼠并收集傷口組織。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

采用t 檢驗對不同組間的重復樣本進行統(tǒng)計學分析，計算p 值。當plt;0.05（*）、plt;0.01（**）和plt;0.001（***）時，其差異被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 Bi2S3-Au NCs材料性能評價

以牛血清白蛋白（BSA）為模板制備了Bi2S3-Au NCs 復合材料，其水合粒徑為134.2 nm（圖1A）， Zeta電位約為–18.1 mV（圖1B）。較低的電位使其在水溶液中可以穩(wěn)定存在，透射電鏡（TEM）圖如圖1C 所示， Bi2S3-Au NCs 復合材料單個納米顆粒的粒徑約為3 nm。所制備Bi2S3-Au NCs 復合材料的水合粒徑比透射電鏡測量的粒徑大，可能是由于在水溶液中納米材料表面大量的BSA 分子伸展所致。圖1D 的X-射線光電子能譜（XPS）圖顯示納米材料中含有Au 和Bi 元素，證明已經(jīng)成功制備出Bi2S3-Au NCs。由于Bi2S3-Au NCs 溶液顯示出強烈的紅色熒光（圖1E 插圖），因此進一步分析了其熒光性能。圖1E 的熒光光譜顯示，所制備材料的熒光強度顯示出明顯的濃度依賴性，隨著濃度升高，熒光強度逐漸增大，在濃度為4 μg/mL 時熒光強度最大，并且未出現(xiàn)熒光淬滅現(xiàn)象。

Bi2S3 和Au NCs 都具有較強的光熱轉(zhuǎn)換能力，因此考察了Bi2S3-Au NCs復合材料的光熱性能。以純水為對照，采用808 nm紅外激光器照射不同濃度（CBi=1、2、3和4 μg/mL）的Bi2S3-Au NCs溶液， 采用數(shù)顯溫度儀記錄溫度升溫曲線。結果表明， Bi 濃度為4.0 μg/mL 時， Bi2S3-Au NCs 溶液經(jīng)NIR（808 nm、2 W/cm2）照射10 min 后， 溶液溫度達到47 ℃， 升高了18.2 ℃， 而純水在相同條件下溫度僅升高了2.6 ℃（圖1F），表明Bi2S3-Au NCs 具有較好的光熱性能。

2.2 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的構建

在室溫攪拌下，將Bi2S3-Au NCs 與CHI-C溶液混合， 1 min 內(nèi)即可快速形成水凝膠（圖2A）。在此過程中， CHI-C 和Bi2S3-Au NCs 中的BSA 通過氫鍵作用形成多孔網(wǎng)絡。從圖2B中可看出， Bi2S3-Au NCs-CHI-C水凝膠可緊密附著于翻轉(zhuǎn)的手指和豬皮上，說明此水凝膠具有優(yōu)異的黏附性，為其用于術后傷口管理提供了基礎（圖2B）。

所制備的水凝膠在紫外光激發(fā)下顯示出強烈的熒光，這為其用于實時檢測水凝膠敷料傷口填充情況提供了可能（圖3A 和3B）。為了驗證Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的成功制備，首先對其進行了紅外光譜分析。結果顯示， CS 和CHI-C 均顯示出歸屬于O—H 和N—H 的伸縮振動吸收峰（3356 cm–1）；與CS 相比， CHI-C 在1539 和1298 cm–1 處分別出現(xiàn)了對應于芳香族C=C 及酚類結構的特征吸收峰[25]，進一步證實了CHI-C 的成功合成（圖3C）

采用旋轉(zhuǎn)流變儀研究了水凝膠的流變特性。如圖3D 所示，在1%～100%應變范圍內(nèi)， Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠對振蕩呈線性響應，并且G′高于G′′，表明此水凝膠為黏彈性固體。頻率掃描測試結果（圖3E）顯示， Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的黏度隨剪切速率的增加而明顯降低。借助掃描電鏡觀察水凝膠其內(nèi)部結構、形貌及孔徑大小（圖3F），此水凝膠為多孔網(wǎng)絡結構。TEM 圖顯示， Bi2S3-Au NCs 均勻分布在水凝膠中（圖3G）。以上結果均證明已成功制備具有熒光性能的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠。

2.3 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的光熱性能評價

考察了Bi2S3-Au NCs-CHI-C水凝膠在808 nm近紅外光照射下的光熱性能。如圖4所示，當Bi濃度達到4.0 μg/mL時， Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的溫度升高了14.8 ℃，而在相同條件下BSA-CHI-C 水凝膠的溫度僅升高了3.7 ℃， 表明所制備的多功能Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠具有良好的光熱性能。

2.4 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的抗菌性能評價

采用涂布平板法考察了水凝膠的光熱抗菌活性。如圖5 所示， Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠+NIR 組的瓊脂平板表面未出現(xiàn)明顯菌落，而對照組均出現(xiàn)了大量菌落，說明Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠具有較強的光熱殺菌活性。

2.5 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的細胞生物相容性和細胞水平光熱性能評價

水凝膠傷口敷料作為生物材料，應具備良好的生物相容性。細胞相容性是評價材料的生物相容性的主要方法之一。通過MTT 法評價了制備的水凝膠的細胞毒性。結果表明， Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠與B16F10 細胞共孵育24 h 后，細胞存活率均在90%以上，說明此水凝膠具有良好的細胞相容性（圖6A）。經(jīng)過NIR 光照后， Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠組細胞存活率明顯降低，說明Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠在NIR 照射下具有較強的殺死腫瘤細胞的能力（圖6B）。

2.6 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠活體評價

采用小鼠模型進一步評價了Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠促進傷口愈合的性能。Bi2S3-Au NCs-CHI-C水凝膠可以貼合于術后小鼠的傷口上（圖7A），并且顯示出較強的紅色熒光，通過監(jiān)測熒光強度可實時精確監(jiān)測其在傷口部位的填充情況（圖7B）。經(jīng)808 nm 近紅外光照射10 min 后， Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠（CBi=2 μg/mL）溫度能夠達到49.2 ℃（圖7C）。在近紅外光照射下，治療11 d 后， Bi2S3-Au NCs-CHI-C水凝膠組小鼠的傷口出現(xiàn)明顯收縮；14 d 后， 這一組小鼠傷口幾乎完全愈合，其它組小鼠傷口愈合效果較弱，甚至有腫瘤復發(fā)跡象（圖7D 和7E）。在治療期間，實驗組小鼠的體重平穩(wěn)增長，表明所制備的水凝膠沒有影響小鼠的正常生理機能（圖7F）。Hamp;E 染色結果顯示，對比其它組， Bi2S3-Au NCs-CHI-C+NIR 水凝膠治療組小鼠傷口處形成了較薄的完整表皮，并且沒有明顯的淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，說明所制備的水凝膠在近紅外光照射下具有較好的防止腫瘤復發(fā)及促進傷口愈合的功能（圖7G）。

3 結論

采用快速凝膠法制備了一種黏附能力強、光熱轉(zhuǎn)換效率高的的可注射熒光Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠，并將其用于黑色素瘤術后輔助治療。實驗結果表明，此水凝膠可以有效殺死殘留腫瘤細胞，防止術后傷口細菌感染，促進術后傷口快速愈合。本研究為實體腫瘤術后輔助治療提供了新方法。