摘" 要：合成了一種同時含α， β-不飽和酮活性位點和SNAP-tagTM底物的香豆素母體探針香豆素-烯酮-苯甲氨基鳥嘌呤（CAKBG）.通過測試探針CAKBG的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)探針CAKBG在極性溶劑（例如， 甘油、乙二醇、水、DMSO）中有更長的吸收波長，且探針CAKBG對溶液的pH變化不敏感.此外，光譜實驗發(fā)現(xiàn)生物硫醇Cys和Hcy均能引起探針CAKBG的最大吸收波長發(fā)生藍移，且當(dāng)激發(fā)波長為405 nm時，Cys和Hcy均能導(dǎo)致探針CAKBG在487 nm處的熒光發(fā)射峰明顯增強.細胞成像結(jié)果表明，含有SNAP-tagTM底物的硫醇熒光探針CAKBG在活細胞中可以對Cys、Hcy進行熒光成像.綜上，SNAP-TagTM蛋白標簽技術(shù)有望今后在硫醇熒光探針的細胞成像中得到推廣應(yīng)用.

關(guān)鍵詞：α， β-不飽和酮；SNAP-TagTM底物；硫醇熒光探針；細胞成像

中圖分類號：O622.4""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：10001565（2024）05050409

DOI：10.3969/j.issn.10001565.2024.05.007

A thiol fluorescent probe containing SNAP-tagTM substrate

LIN Lixia1， GUO Chunqing1， WANG Libin1， ZHAO Zibiao1， XIONG Kangming2，3

（1. Department of Security， Shanxi Police College， Taiyuan 030401， China; 2. Key Laboratory of Nano-imaging and Drugloaded Preparation of Shanxi Province， Shanxi Bethune Hospital， Taiyuan 030032， China; 3. CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry， Dalian Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， Dalian 116023， China）

Abstract： A coumarin-based probe coumarin-alkene ketone-benzylaminoguanine （CAKBG） containing both α， β-unsaturated ketone and SNAP-tagTM substrate was synthesized. By testing the UV-Vis absorption spectra and fluorescence emission spectra of the probe CAKBG， the results show that the probe CAKBG has a longer absorption wavelength in polar solvents （ such as glycerol， ethylene glycol， water， DMSO）， and the probe CAKBG is not sensitive to the pH change of the solutions. In addition， spectral experiments show that both Cys and Hcy can cause a blue shift in the maximum absorption wavelength of the probe CAKBG， and when the excitation wavelength is 405 nm， both Cys and Hcy can cause the fluorescence emission peak of the probe CAKBG at 487 nm to be significantly enhanced. Cell imaging results show that the thiol fluorescent probe CAKBG containing SNAP-tagTM substrate can image Cys and Hcy in living cells. The above results indicate that SNAP-TagTM protein labeling technology is expected to be widely

收稿日期：20230615;修回日期：20230912

基金項目：

國家自然科學(xué)基金資助項目（22008232）；山西省基礎(chǔ)研究計劃青年科學(xué)研究項目（202203021212512）

第一作者：林利霞 （1991—），女，山西警察學(xué)院講師，博士，主要從事有機小分子的光譜性能研究.

E-mail：1552774577@qq.com

通信作者：熊康明 （1990—），男，山西白求恩醫(yī)院副研究員，博士，主要從事熒光探針的傳感識別研究.

E-mail：1187994460@qq.com

used in cell imaging of thiol fluorescent probes in the future.

Key words： α， β-unsaturated ketone; SNAP-TagTM substrate; thiol fluorescent probes; cell imaging

小分子生物硫醇主要包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和還原型谷胱甘肽（GSH）.在生命體中，它們的濃度異常與多種疾病密切相關(guān)［1-3］.因此，監(jiān)測生物體內(nèi)小分子生物硫醇濃度的變化非常有意義.目前檢測生物硫醇的方法有高效液相色譜法［4］、分光光度法［5］、伏安法［6］、質(zhì)譜法［7］以及熒光探針法［8］等，其中熒光探針法相比其他檢測方法具有靈敏度高、特異性強等特點，從而受到越來越多科研工作者的關(guān)注.目前為止，雖然已報道了大量熒光探針用于細胞內(nèi)硫醇的檢測［9-13］，但對于其中絕大多數(shù)的硫醇熒光探針來說，由于它們不含有靶向特定細胞器的基團，直接導(dǎo)致探針在多種細胞器中廣泛分布，不利于細胞內(nèi)硫醇的精準定位成像.目前有些科研工作者也開發(fā)出了一些通過引入能夠靶向特定細胞器的基團到硫醇熒光探針分子中［14-16］，從而實現(xiàn)細胞內(nèi)硫醇的精準定位成像，但是目前這種方法所構(gòu)建出來的硫醇熒光探針仍然存在問題，例如：探針靶向到細胞器之后不能長時間停留，繼而發(fā)生部分探針逃逸，造成細胞內(nèi)其他位置的熒光背景較強.因此，開發(fā)出能夠穩(wěn)定靶向特定細胞器的探針成為當(dāng)前硫醇熒光探針研究的新熱點.

SNAP-TagTM作為蛋白標簽技術(shù)中最常用的一種，具有高度的自標記特異性、穩(wěn)定性及配體的多樣性.SNAP-tagTM蛋白所帶的活性巰基位點通過與熒光探針結(jié)構(gòu)中具有側(cè)鏈苯甲基基團的苯甲基鳥嘌呤反應(yīng)之后，可以將探針的熒光團綁定到SNAP-tagTM蛋白上，并且釋放出的苯甲基鳥嘌呤在生物體內(nèi)十分穩(wěn)定，沒有其他蛋白質(zhì)會與其反應(yīng)，因此自標記是高度特異的.此外，SNAP-tagTM自標記形成的硫醚鍵具有高度的穩(wěn)定性.通過SNAP-TagTM蛋白標簽技術(shù)將硫醇熒光探針綁定到特定細胞器膜的表面，有望解決探針從細胞器中逃逸而導(dǎo)致細胞內(nèi)其他位置熒光背景強的問題.

考慮到香豆素母體具有良好的生物相容性，有較強的穩(wěn)定熒光發(fā)射和良好的結(jié)構(gòu)靈活性，本研究工作合成出了一種同時含α，β-不飽和酮活性位點和SNAP-tagTM底物的香豆素母體熒光探針香豆素-烯酮-苯甲氨基鳥嘌呤（CAKBG），并初步探究含有硫醇反應(yīng)位點的熒光探針攜帶上SNAP-tagTM底物之后，是否還能夠在體外及體內(nèi)識別檢測生物硫醇，進而為SNAP-tagTM蛋白標簽技術(shù)在硫醇熒光探針中的推廣應(yīng)用，提供相關(guān)實驗依據(jù).

1" 實驗部分

1.1" 儀器和試劑

1.1.1" 儀器

Agilent Cary 60紫外-可見分光光度計（安捷倫科技（中國）有限公司）；Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計（安捷倫科技（中國）有限公司）；400MHz BrukerAvance核磁共振波譜儀（布魯克公司）；HP1100LC/MSD質(zhì)譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）；安道爾活細胞共聚焦成像平臺（安道爾科技有限公司）.

1.1.2" 試劑

1-甲基吡啶烷、2-氨基-6氯嘌呤、三氟乙酸乙酯、對羧基苯甲醛（北京伊諾凱科技有限公司）；1-羥基苯并三唑、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（上海阿達瑪斯試劑有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺、無水碳酸鈉、乙腈、四氫呋喃（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；4-氰基苯甲醛、叔丁醇鉀（百靈威科技有限公司）；氫化鋁鋰（薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；各種氨基酸（Sigma-Aldrich有限公司）.

1.2" 測量方法

用DMSO配制濃度為2 mmol/L的探針CAKBG儲備液.用去離子水制備相應(yīng)的分析物（HPO2-4、SO2-4、Cl-、NO-3、CO2-3、L-Asp、L-Ala、L-Arg、L-Trp、L-Met、L-Thr、L-Gly、L-Ile、L-Cys、DL-Hcy、L-GSH、Ca2+、Mg2+、Zn2+、K+、Na+）儲備液，使其濃度為20 mmol/L.將上述這些儲備溶液進一步稀釋至所需的濃度以進行相應(yīng)的實驗.測試溶液的制備如下：將適當(dāng)濃度的探針CAKBG溶液，或適當(dāng)濃度的探針CAKBG與分析物混合溶液加入石英比色皿中，用DMSO或PBS （10 mmol/L） 將相應(yīng)的溶液稀釋至2 mL.光譜數(shù)據(jù)在室溫下被記錄.

1.3" 探針CAKBG的制備與表征

探針的合成需要通過多步反應(yīng)得到，具體合成路線如圖1所示.

1.3.1" 苯甲氨基鳥嘌呤（BG）的合成及表征

苯甲氨基鳥嘌呤的合成方法見參考文獻［17-18］，其表征數(shù)據(jù)：1H NMR （400 MHz， DMSO-d6）：δ 7.82 （s， 1H）， 7.44 （d， J=7.4 Hz， 2H）， 7.35 （d，J=6.4 Hz， 2H）， 6.28 （s， 2H）， 5.45 （s， 2H）， 3.74 （s， 2H）.

1.3.2" 香豆素-烯酮（CAK）的合成及表征

將化合物香豆素-酮（CK）（0.259 1 g， 1.0 mmol）、對羧基苯甲醛（0.165 1 g， 1.1 mmol）溶于5 mL乙醇和5 mL乙腈的混合溶劑中，加入100 μL哌啶回流48 h.隨后將反應(yīng)液的溶劑減壓旋蒸除去，粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜分離提純 （洗脫劑為二氯甲烷-乙酸乙酯，體積比3∶1），最終可得到0.143 8 g的橙紅色固體化合物CAK（產(chǎn)率36.8%）.化合物香豆素-烯酮的表征數(shù)據(jù)：1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 8.62 （s， 1H）， 8.05 （d， J=15.8 Hz， 1H）， 7.99 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.82 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.72 （d， J=3.8 Hz， 1H）， 7.69 （d， J=2.9 Hz， 1H）， 6.83 （dd， J=9.0， 2.1 Hz， 1H）， 6.62 （d， J=1.9 Hz， 1H）， 3.51 （q， J=6.9 Hz， 4H）， 1.15 （t， J=7.0 Hz， 6H）； 13C NMR （400 MHz， DMSO-d6）δ 185.89、167.42、160.42、158.78、153.62、149.07、140.85、139.32、132.95、130.35、128.82、127.58、115.71、110.79、108.42、96.41、44.97、12.84. HRMS m/z： ［M+H］+ calculated for C23H22NO+5： 392.1493; measured： 392.1488.

1.3.3" CAKBG的合成及表征

將CAK（0.078 3 g， 0.2 mmol）、BG（0.054 0 g， 0.2 mmol）、1-羥基苯并三唑（0.027 0 g， 0.2 mmol）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（0.038 3 g， 0.2 mmol）溶于無水N，N-二甲基甲酰胺 （2 mL）中，滴加三乙胺（0.040 5 g， 0.4 mmol）后在室溫下攪拌48 h，隨后減壓旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜提純（洗脫劑為二氯甲烷-甲醇，體積比50∶1），可得到0.0361 g的橙黃色固體化合物CAKBG （產(chǎn)率28.1%）.化合物CAKBG的表征數(shù)據(jù)：1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 12.42 （s， 1H）， 9.13 （t， J=5.9 Hz， 1H）， 8.61 （s， 1H）， 8.03 （d， J=15.8 Hz， 1H）， 7.96 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.81 （d， J=8.4 Hz， 3H）， 7.71 （d， J=4.7 Hz， 1H）， 7.68 （d， J=1.6 Hz， 1H）， 7.47 （d， J=8.1 Hz， 2H）， 7.35 （d， J=8.1 Hz， 2H）， 6.82 （dd， J=9.0， 2.1 Hz， 1H）， 6.61 （d， J=1.9 Hz， 1H）， 6.26 （s， 2H）， 5.46 （s， 2H）， 4.50 （d， J=5.7 Hz， 2H）， 3.50 （q， J=6.8 Hz， 4H）， 1.15 （t， J=7.0 Hz， 6H）; 13C NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 185.95、166.05、160.40、160.07、158.76、153.57、151.03、149.06、149.01、141.11、139.87、138.00、135.97、135.73、132.91、129.03、128.72、128.39、127.78、127.01、115.81、110.76、108.41、96.41、67.02、44.95、42.99、12.84. HRMS m/z： ［M+H］+ calculated for C36H34N7O+5： 644.2616; measured： 644.2599.

1.4" 細胞培養(yǎng)和成像

將HeLa細胞培養(yǎng)在含有體積分數(shù)10％胎牛血清（FBS，Hyclone）的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM，Gibco）中，并置于37 ℃、體積分數(shù)為5％CO2和95％空氣混合的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).在進行成像實驗之前，將HeLa細胞接種到細胞培養(yǎng)皿的底部，孵育上1～2 d，然后將細胞用于進一步的實驗.

將培養(yǎng)好的HeLa細胞分別用1 mL DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別往空白組和實驗組中加入終濃度為1.0 μmol/L的探針CAKBG，于37 ℃、體積分數(shù)為5％CO2和95％空氣混合的培養(yǎng)箱中孵育1 h.隨后空白組繼續(xù)孵育30 min，之后直接進行細胞成像；實驗組分別加入60.0 μmol/L的Cys或Hcy繼續(xù)孵育30 min，之后直接進行細胞成像.細胞成像通過安道爾活細胞共聚焦成像平臺獲得.在405 nm的激發(fā)光源下，選擇417～470 nm處的波段作為輸出的藍色信號通道；在488 nm的激發(fā)光源下，選擇500～550 nm處的波段作為輸出的綠色信號通道.

2" 結(jié)果與討論

2.1" 探針CAKBG的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜

2.1.1" 探針CAKBG在不同極性溶劑中的光譜情況

通過紫外-可見吸收光譜法和熒光發(fā)射光譜法探究了CAKBG探針在不同溶劑中的光譜情況.如圖2a所示，探針CAKBG在極性溶劑（甘油、乙二醇、水、DMSO）中會有更長的吸收波長，在弱極性溶劑（乙酸乙酯、1，4-二氧六環(huán)）中會有更短的吸收波長.隨后測試了探針CAKBG在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜.如圖2b所示，當(dāng)激發(fā)波長為405 nm時，探針CAKBG在大部分溶劑中的最大發(fā)射波長為497～550 nm，此時以綠色熒光為主.如圖2c所示，當(dāng)激發(fā)波長為488 nm時，探針CAKBG在大部分溶劑中的最大發(fā)射波長為556～605 nm，此時以黃綠色熒光為主.

a. 5 μmol/L的探針CAKBG在不同溶劑中的紫外-可見光譜；b. 5 μmol/L的探針CAKBG在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜（λex=405 nm， slit： 10 nm/10 nm）；c. 5 μmol/L的探針CAKBG在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜（λex=488 nm， slit： 10 nm/10 nm）

2.1.2" 探針CAKBG在不同pH溶液中的光譜情況

研究了探針CAKBG在不同pH溶液中的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜.從圖3中可知，探針CAKBG在不同的pH溶液中，吸收波長移動變化的并不明顯，主要是引起很小的吸收強度變化.探針CAKBG在激發(fā)波長為405 nm或488 nm時，在不同pH溶液中僅僅引起熒光強度的變化，基本上對其發(fā)射波長的移動沒有影響.由此可見，探針CAKBG對溶液的pH變化不敏感.

a. 5 μmol/L的探針CAKBG在不同pH溶液中的紫外-可見吸收光譜；b. 5 μmol/L的探針CAKBG在不同pH溶液中的熒光發(fā)射光譜（λex=405 nm， slit： 10 nm/10 nm;）；c. 5 μmol/L的探針CAKBG在不同pH溶液中的熒光發(fā)射光譜（λex=488 nm， slit： 10 nm/10 nm）

2.1.3" 探針CAKBG在不同分析物溶液中的光譜情況

為了探究探針CAKBG在溶液中是否對一些陰離子、陽離子或氨基酸有響應(yīng)，在2 mL 的DMSO溶液中分別測試了5 μmol/L探針CAKBG加入500 μmol/L的不同分析物 （HPO2-4、SO2-4、Cl-、NO-3、CO2-3、L-Asp、L-Ala、L-Arg、L-Trp、L-Met、L-Thr、L-Gly、L-Ile、L-Cys、DL-Hcy、L-GSH、Ca2+、Mg2+、Zn2+、K+、Na+） 之后的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜.如圖4a所示，當(dāng)2 mL的DMSO溶液中分別加入5 μmol/L的探針CAKBG和500 μmol/L的不同分析物之后，觀察到Cys和Hcy引起了探針CAKBG的紫外-可見吸收光譜變化，其最大吸收波長均發(fā)生了藍移.相應(yīng)地從圖4b中可以看到，當(dāng)激發(fā)波長為405 nm時，Cys和Hcy引起了探針CAKBG熒光發(fā)射光譜的明顯變化，在487 nm處出現(xiàn)了很強的發(fā)射峰.由此可見，探針CAKBG對Cys和Hcy的熒光檢測具有較好的選擇性.

a. 在含5 μmol/L的探針CAKBG的2 mL DMSO溶液中，分別加入500 μmol/L的各種分析物之后的紫外-可見吸收光譜；b. 在含5 μmol/L的探針CAKBG的2 mL DMSO溶液中，分別加入500 μmol/L的各種分析物之后的熒光發(fā)射光譜（λex=405 nm， slit： 10 nm/10 nm）

2.1.4" 探針CAKBG溶液中加入Cys、Hcy、GSH后的光譜情況

由于探針CAKBG中含有α，β-不飽和酮結(jié)構(gòu)，因此該位置有可能作為親核加成反應(yīng)的識別位點.隨后，通過濃度依賴性的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，研究了探針CAKBG的DMSO溶液中分別加入Cys、Hcy、GSH后的光譜變化情況.圖5a顯示：添加Cys后的紫外-可見吸收光譜的變化.隨著體系中Cys濃度（0～1.7 mmol/L）的增加，探針CAKBG在467 nm處的吸收峰發(fā)生了藍移，并在445 nm處出現(xiàn)了1個新的吸收峰.圖5d顯示：添加Hcy后的紫外-可見吸收光譜的變化.隨著體系中Hcy濃度（0～2.2 mmol/L）的增加，探針CAKBG在467 nm處的吸收峰發(fā)生了藍移，并在445 nm處出現(xiàn)了1個新的吸收峰.圖5g顯示：添加GSH后的紫外-可見吸收光譜的變化.隨著體系中GSH濃度（0～2.0 mmol/L）的增加，探針CAKBG在467 nm處的吸收峰只發(fā)生了輕微的降低，這可能是由于GSH的空間位阻相對于Cys、Hcy來說更大，不利于親核加成反應(yīng)所導(dǎo)致的.圖5b顯示：探針CAKBG對Cys的熒光響應(yīng).選擇405 nm作為激發(fā)波長，隨著體系中Cys濃度（0～550 μmol/L）的增加，487 nm處出現(xiàn)了明顯的熒光發(fā)射峰.圖5c顯示：探針CAKBG對Cys的熒光響應(yīng).選擇488 nm作為激發(fā)波長，隨著體系中Cys濃度（0～550 μmol/L）的增加，572 nm處的熒光發(fā)射峰略微增強.圖5e顯示：探針CAKBG對Hcy的熒光響應(yīng).選擇405 nm作為激發(fā)波長，隨著體系中Hcy濃度（0～550 μmol/L）的增加，487 nm處出現(xiàn)了明顯的熒光發(fā)射峰.圖5f顯示：探針CAKBG對Hcy的熒光響應(yīng).選擇488 nm作為激發(fā)波長，隨著體系中Hcy濃度（0～550 μmol/L）的增加，572 nm處的熒光發(fā)射峰略微增強.圖5h顯示：探針CAKBG對GSH的熒光響應(yīng).選擇405 nm作為激發(fā)波長，隨著體系中GSH濃度（0～700 μmol/L）的增加，482 nm處出現(xiàn)了較弱的熒光發(fā)射峰.圖5i顯示：探針CAKBG對GSH的熒光響應(yīng).選擇488 nm作為激發(fā)波長，隨著體系中GSH濃度（0～700 μmol/L）的增加，572 nm處的熒光發(fā)射峰略微增強.以上實驗表明，探針CAKBG對Cys、Hcy具有較好的熒光增強響應(yīng).同時也進一步表明含有硫醇反應(yīng)位點的熒光探針攜帶上SNAP-tagTM底物之后，在體外仍然可以識別檢測生物硫醇.

在含5 μmol/L探針CAKBG的2 mL DMSO溶液中：a.加入0～1.7 mmol/L Cys的紫外-可見吸收光譜；b. 加入0～550 μmol/L Cys的熒光發(fā)射光譜（λex=405 nm， slit： 10 nm/10 nm）；c. 加入0～550 μmol/L Cys的熒光發(fā)射光譜（λex=488 nm， slit： 10 nm/10 nm）；d. 加入0～2.2 mmol/L Hcy的紫外-可見吸收光譜；e. 加入0～550 μmol/L Hcy的熒光發(fā)射光譜（λex=405 nm， slit： 10 nm/10 nm）；f. 加入0～550 μmol/L Hcy的熒光發(fā)射光譜（λex=488 nm， slit： 10 nm/10 nm）；g. 加入0～2.0 mmol/L GSH的紫外-可見吸收光譜；h. 加入0～700 μmol/L GSH的熒光發(fā)射光譜（λex=405 nm， slit： 10 nm/10 nm）；i. 加入0～700 μmol/L GSH的熒光發(fā)射光譜（λex=488 nm， slit： 10 nm/10 nm）

2.2" 探針CAKBG在活細胞中的成像

探針CAKBG在分子設(shè)計的時候，引入了含α，β-不飽和酮位點，可以與具有較強親核性的巰基官能團發(fā)生反應(yīng)，從而引起硫醇探針熒光的變化.在本實驗中，將1.0 μmol/L的探針CAKBG加入到HeLa細胞中，孵育1.5 h之后，通過安道爾活細胞共聚焦成像平臺進行熒光成像.如圖6a所示，探針CAKBG在藍色信號通道和綠色信號通道下出現(xiàn)微弱的熒光，這可能是由于探針CAKBG與細胞內(nèi)含量較少的Cys、Hcy反應(yīng)之后引起的熒光增強.為了進一步證實探針CAKBG能與細胞內(nèi)的Cys、Hcy反應(yīng)，分別將1.0 μmol/L的探針CAKBG加入到HeLa細胞中，孵育1 h之后，分別再加入60.0 μmol/L的Cys或Hcy繼續(xù)孵育30 min，隨后通過安道爾活細胞共聚焦成像平臺進行熒光成像.從圖6b和圖6c中可以看到，藍色信號通道和綠色信號通道中的熒光均有了明顯的增強，說明含有SNAP-tagTM底物的硫醇熒光探針CAKBG在活細胞中可以與Cys、Hcy發(fā)生反應(yīng)，進而對其進行熒光成像.

a. HeLa細胞中加入1.0 μmol/L的探針CAKBG，孵育1.5 h后在405 nm和488 nm激發(fā)光源下的熒光成像；b. HeLa細胞中加入1.0 μmol/L的探針CAKBG，孵育1 h后加入60.0 μmol/L的Cys，繼續(xù)孵育30 min后在405 nm和488 nm激發(fā)光源下的熒光成像；c. HeLa細胞中加入1.0 μmol/L的探針CAKBG，孵育1 h后加入60.0 μmol/L的Hcy，繼續(xù)孵育30 min后在405 nm和488 nm激發(fā)光源下的熒光成像

3" 結(jié)論

本研究合成了一種同時含α，β-不飽和酮活性位點和SNAP-tagTM底物的香豆素母體染料探針CAKBG.通過測試探針CAKBG的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)含SNAP-tagTM底物的探針CAKBG對Cys和Hcy具有較好的熒光增強響應(yīng).在隨后的細胞成像實驗中，證實了含有SNAP-tagTM底物的硫醇熒光探針CAKBG在活細胞中可以與Cys、Hcy發(fā)生反應(yīng)，進而對其進行熒光成像.因此，SNAP-TagTM蛋白標簽技術(shù)有望今后在硫醇熒光探針的細胞成像中得到推廣應(yīng)用，并有望解決探針從細胞器中逃逸而導(dǎo)致細胞內(nèi)其他位置熒光背景強的問題.盡管如此，探針CAKBG在細胞透膜、熒光量子產(chǎn)率等方面仍存在著一些不足之處，希望通過后期探針分子結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，獲得性能更好的含SNAP-tagTM底物的硫醇熒光探針.

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（責(zé)任編輯：梁俊紅）