關鍵詞：奇楠；精油；抗炎；RAW264.7細胞；信號通路

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A

沉香是瑞香科沉香屬（Aquilaria）或擬沉香屬（Gyrinops）植物含有樹脂的芯材[1]，主要分布于印度、緬甸、老撾、越南、中國、柬埔寨、泰國等亞洲國家[2]。在我國，主要分布在廣東、海南、廣西、福建和臺灣等地區(qū)。沉香作為一種熱帶特色作物，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎、降糖等良好功效[3]。近年來，隨著沉香的市場需求增加，香農們從白木香天然林內選育出一類具有優(yōu)良特性的品系，該品系具有結香早、結香快、結香質量高等優(yōu)點，俗稱易結沉香，即為奇楠沉香。奇楠又稱伽南、伽楠、伽藍、棋楠等，英文名有Kanankoh、Kyara、Chi-Nan、Qi-Nan 等[4]，其價格是普通沉香的上百甚至上千倍。隨著奇楠人工培育技術逐漸成熟，奇楠沉香已初步形成產業(yè)[5]。奇楠沉香與普通沉香的主要區(qū)別在于其香氣更加持久綿長、質地較軟，油脂含量豐富，提取物得率及色酮含量比普通沉香更高[6]。張琳等[7]從奇楠沉香中分離的6-羥基-2-[2-（3-羥基-4-甲氧基苯）乙基]色酮能抑制由LPS 誘導RAW264.7 細胞產生NO 的作用，初步說明奇楠沉香具有抗炎活性。

奇楠沉香精油（Qi-Nan essential oil， QEO）作為奇楠沉香最重要的活性成分，具有多種生物活性，但目前針對QEO 的研究主要集中在成分分析鑒定和簡單活性評價。有研究團隊對從水蒸氣蒸餾法提取的QEO 進行成分分析，發(fā)現其倍半萜類化合物含量差異很大， 分別為76.31%[8] 和90.28%[9]，說明QEO 成分可能與品種、品質和種植地等因素有關。余珍[10]對3 種不同品種的QEO進行研究，發(fā)現QEO 的主要成分均為倍半萜類、2-（2-苯乙基）色酮類和簡單芳香族化合物，且具有抑制NO 產生的效果。此外，陳細欽等[11]對比了分別用水蒸氣蒸餾和超臨界萃取的普通沉香精油和QEO，結果表明超臨界萃取的精油抗氧化活性均強于水蒸氣蒸餾精油，并且QEO 對于LPS 誘導的RAW264.7 細胞存活率的抑制作用最佳，這可能是奇楠沉香中的色酮類成分含量遠高于普通沉香。在現有關于QEO 的研究中，已初步證實其具有抗炎活性，但鮮有對超臨界CO2 萃取法提取QEO的抗炎活性進行系統研究的報道。

本研究擬以超臨界CO萃取法提取的QEO作為研究對象，通過GC-MS 分析QEO揮發(fā)性成分，并對QEO的抗氧化活性進行評價。然后，采用生物信息學手段對QEO與炎癥相關的靶點、主要活性成分及相關的信號通路進行預測。最后利用LPS 誘導RAW264.7細胞建立炎癥模型驗證QEO的抗炎活性，以期為奇楠沉香產業(yè)的深入開發(fā)和高效利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 奇楠沉香木種植于廣東省茂名市茂南區(qū)山閣鎮(zhèn)黃杰村委會塘尾村（110°57′9.594″E， 21°42′47.5272″N）。小鼠巨噬細胞（RAW264.7）購自中國科學院細胞庫。DMEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、雙抗（ThermoFisherScientific Gibco ）、脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS）購自Sigma 公司；胎牛血清（FBS）購自Serana 公司；CCK-8 試劑盒、一氧化氮（NO）檢測試劑盒、活性氧（ROS）試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；P65、P-P65、P-IκB-α、IκB-α、β-Actin、二抗購自Santa Cruz 公司。

1.1.2 儀器與設備 氣相色譜質譜連用儀，日本島津公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，美國ThermoScientific 公司；酶標儀，美國BIO-TEX 公司；倒置熒光顯微鏡，日本Olympus 公司；電泳系統、電轉系統，美國Bio-Rad 公司；凝膠成像系統，中國Tanon 公司。

1.2 方法

1.2.1 精油提取和純化 奇楠沉香木粉碎后過80 目篩，準確稱取100 g 放入萃取罐。設置萃取條件為30 MPa，45 ℃，二氧化碳流量為20 L/h，萃取4 h。然后將萃取物放入專用的分子蒸餾中進行分離純化，并收集餾出物，即獲得QEO。

1.2.2 成分分析 將QEO 溶解于正己烷中，使用0.22 μm 尼龍膜過濾，備用。采用HP-5 彈性石英毛細管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），進樣量為1 μL。分別設置流速（1.0 mL/min）、分流比（30∶1）、進樣溫度（250 ℃）和傳輸線溫度（280 ℃）。起始溫度120 ℃，3 min，然后以3 ℃/min 升至180 ℃，再以10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min。EI 電離70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍為35～600 m/z。

1.2.3 DPPH 自由基清除能力 將QEO 溶液與DPPH 的甲醇溶液混合，常溫避光反應30 min，測定517 nm 處的吸光值，記為A。等量的無水乙醇和DPPH 的甲醇溶液混合作為空白反應體系，并測得吸光值，記為A。以維生素C（Vc）作為陽性對照。DPPH 的清除能力按以下公式計算：

1.2.4 總抗氧化能力 將FRAP 工作液與QEO充分混勻，室溫避光反應10 min，蒸餾水調零，于593 nm 處測其吸光值，VC 作為陽性對照。以FeSO 溶液作為標準品繪制標準曲線，總抗氧化能力值以Fe²⁺含量表示，單位為μmol/mL。

1.2.5 生物信息學分析 在PubChem 網站檢索QEO 的成分Smlies，然后將Smlies 導入SwissTarget Prediction 數據庫，使用Uniprot 數據庫校正靶點。以inflammation 為關鍵詞，在GeneCards、Disgenet、OMIM 數據庫檢索，結果采用Venny2.1.0 構建韋恩圖，獲取QEO 與炎癥的交集靶點。將交集靶點導入String 數據庫，保存蛋白交互信息文件。使用Cytoscape 3.9.1 軟件構建藥物成分靶點網絡圖和蛋白質互作網絡圖（protein-proteininteraction， PPI）。通過David 數據庫對交集靶點進行KEGG 和GO 富集分析，并使用微生信平臺對結果進行可視化。

1.2.6 細胞培養(yǎng) RAW264.7 細胞采用DMEM完全培養(yǎng)基（10% FBS 和1%雙抗）于37 ℃、5%CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.7 細胞活力測定 試驗組分別加入不同濃度的QEO（1、10、20、50 μg/mL），空白組加入等體積的DMEM 培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。使用CCK-8 法檢測QEO 對細胞毒性的影響：棄除培養(yǎng)液，加入CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱中孵育30 min，采用酶標儀在450 nm 波長下測定每孔吸光值，計算細胞的活力。

1.2.8 NO 含量測定 試驗組加入不同濃度的QEO（1、10、20 μg/mL），培養(yǎng)2 h，無QEO 為空白組（COG）；然后加入終濃度為1 μg/mL 的LPS 刺激24 h，COG 中加入LPS 處理為模型組（MOG）。取上清液并依次加入NO 含量檢測試劑，測定540 nm 處的吸光值，根據NO 標準曲線計算濃度。

1.2.9 NO 熒光強度測定 如1.2.8 處理細胞后，吸取并棄除培養(yǎng)基，加入濃度為5 μmol/L 的DAFFMDA，37 ℃孵育30 min 后，用PBS清洗3次。利用倒置熒光顯微鏡拍照并記錄細胞熒光強度。

1.2.10 活性氧（ROS）含量測定 如1.2.8 處理細胞后， 吸取并棄除培養(yǎng)基。加入濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA 工作液，37 ℃避光孵育30 min 后，用PBS 清洗3 次。利用倒置熒光顯微鏡拍照并記錄細胞熒光強度。

1.2.11 ELISA 檢測炎癥因子含量 細胞處理同1.2.8。使用ELISA 試劑盒對培養(yǎng)基中炎癥因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）含量進行檢測。

1.2.12 Western blot 檢測蛋白表達水平 細胞處理同1.2.8。使用細胞刮收集細胞后加入裂解液在冰上進行快速裂解，然后進行4 ℃、13000g高速離心，吸取上清備用。調整蛋白濃度后進行變性即獲得蛋白樣品。然后通過電泳和轉膜將目標蛋白轉移至NC膜上，并采用常溫封閉（1 h）、一抗（4 ℃過夜）和二抗（常溫，1 h）孵育得到目標蛋白條帶。最后采用化學發(fā)光系統進行圖像采集。

1.3數據處理

每次試驗重復3次以上，各組數據以平均值±標準差的形式表示，使用Origin 2021和Prism 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 奇楠沉香精油揮發(fā)性成分分析

采用GC-MS方法對QEO揮發(fā)性成分進行分析，得到總離子流色譜圖（圖1）。結果如表1 所示，從QEO 中鑒定出37種成分，其主要的化合物類別為色酮類（50.08%）、倍半萜類（26.28%）、芳香族化合物（12.59%）（圖2）。通過峰面積歸一化法測定相對百分含量前5 位從高到低依次為2-（2-苯乙基）-色酮（50.08%）、石竹素（8.45%）、綠葉烷（6.46%）、欖香醇（3.88%）、2-烯丙基-6-甲基苯酚（2.78%）。其中，相對含量最高的成分為2-（2-苯乙基）-色酮，說明其為QEO 的主要揮發(fā)性成分。此外，研究發(fā)現從白木香中分離出的2-（2-苯乙基）-色酮[12]及其衍生物[13]能夠顯著抑制LPS 誘導RAW264.7 細胞NO 的過量產生，表明其具有良好的抗炎活性。

2.2 奇楠沉香精油抗氧化活性的測定

本研究測試1～50 mg/mL 濃度范圍內QEO 清除DPPH 自由基的能力。從圖3A 可以看出QEO對DPPH 自由基清除能力隨著QEO濃度增大逐漸增強，在濃度為1 mg/mL 時，QEO 清除率為51.98%。此外，可明顯看出QEO 清除DPPH 自由基的能力在20 mg/mL 時達到最大值，說明QEO在1～50 mg/mL 范圍具有一定的清除DPPH 自由基的能力。如圖3B 所示，QEO 總抗氧化能力的結果以每毫升含有的Fe²⁺含量表示。FeSO 標準曲線回歸方程為y=4.8772x+0.001，R²=0.9998，說明線性良好，可用于抗氧化能力的計算。在1～10 mg/mL濃度范圍內，隨著QEO 濃度增大，Fe²⁺含量逐漸增加，表示QEO 的還原力也逐漸增強，說明QEO的總抗氧化能力與濃度存在一定的量效關系。

2.3奇楠沉香精油生物信息學分析

通過數據庫篩選得到QEO活性成分靶點有594 個，炎癥靶點15394個，QEO 與炎癥的交集靶點共有553個（圖4）。圖5A 為QEO 活性成分交集靶點網絡圖，根據degree值的大小，排名前15 的關鍵活性成分為紫蘇醇、欖香醇、α-古巴烯-11-醇、1，3-雙-（2-環(huán)丙基，2-甲基環(huán)丙基）-丁-2-烯-1-酮、異香橙烯環(huán)氧化物、石竹素、1b，5，5，6a-四甲基-八氫-1-氧雜環(huán)丙烷并[a]茚-6-酮、異香葉醇、順式-（Z）-α-雙沒藥烯環(huán)氧化物、纈草提取物、α-甜沒藥醇、氧雜環(huán)十四烷-4，11-二炔、除蟲菊酯、2-（2-苯乙基）色酮、2-甲基-3-（苯磺?；┘谆?2-環(huán)戊烯-1-酮。從圖5A 中可看出QEO發(fā)揮抗炎活性時具有多成分、多靶點的作用特點。如圖5B所示，QEO 發(fā)揮抗炎活性的關鍵靶點主要包括SRC、MAPK1、AKT、HSP90AA1、PI3K3CA 等。在David 數據庫中對QEO作用炎癥的553 個交集靶蛋白進行GO 注釋分析和KEGG 信號通路富集分析。如圖6A 所示，QEO發(fā)揮抗炎活性可能與細胞質膜上的靶點、以及蛋白磷酸化和ATP 結合等作用環(huán)節(jié)有關。KEGG富集分析得到186 條信號通路，以P 值作為富集程度顯著性標準，取排名前20 條通路建立氣泡圖。如圖6B 所示，QEO作用炎癥反應較顯著的通路主要有NF-κB、MAPK和PI3K-Akt 等炎癥信號通路，以上結果說明QEO可能是通過上述信號通路發(fā)揮抗炎作用。因此，本研究在生物信息學的基礎上重點考察QEO對NF-κB信號通路的調控作用。

2.4 奇楠沉香精油對RAW264.7細胞活力的影響

如圖7 所示，將1、10、20、50 μg/mL QEO作用于RAW264.7 細胞24 h 后對細胞存活率進行檢測。與COG 相比，在QEO 濃度為50 μg/mL時，細胞存活率為43.24%，顯示出極顯著毒性。當QEO 濃度在1～20 μg/mL 濃度范圍內，細胞活力與COG 相比均無明顯差異。因此，選取1、10、20 μg/mL 濃度的QEO 進行后續(xù)試驗。

2.5 奇楠沉香精油對RAW264.7細胞NO含量的影響

根據說明書，以NaNO作為標準溶液繪制NO 標準曲線，回歸方程為y=0.0082x?0.007，R²=0.9996，說明在此濃度范圍內線性良好，可用于NO含量的計算。如圖8 所示，LPS 使對照組中的NO含量顯著升高到COG的5倍，說明LPS能顯著刺激RAW264.7 細胞產生炎癥反應，而1、10、20 μg/mL QEO處理組能夠極顯著地抑制NO的過量產生（P<0.001），且呈濃度依賴性。

2.6奇楠沉香精油對RAW264.7細胞NO熒光強度的影響

如圖9 所示，與空白組相比，LPS導致細胞中熒光強度顯著增強（P<0.001），表示LPS刺激使得細胞中的NO含量顯著增加。而加入QEO的處理組，隨著QEO濃度的增加，其熒光強度逐漸減弱。說明LPS能夠刺激RAW264.7細胞產生明顯的炎癥反應，而QEO處理使得這種炎癥反應有所緩解。

2.7奇楠沉香精油對RAW264.7細胞ROS水平的影響

在LPS誘導的炎癥過程中，細胞可能會受到刺激產生過量的ROS，導致ROS 和抗氧化劑之間的失衡，誘發(fā)免疫功能紊亂[14]。細胞中ROS 的熒光強度如圖10 所示，和COG 相比，LPS 刺激RAW264.7 細胞產生了大量的ROS。但經過1、10、20 μg/mL QEO 處理后，細胞內ROS 的含量呈濃度依賴性極顯著降低（P<0.001），其中20 μg/mLQEO處理組的熒光水平與COG 基本一致。

2.8 奇楠沉香精油對RAW264.7細胞炎癥因子的影響

RAW264.7細胞被激活時，炎癥因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）會過度釋放，這將使炎癥反應進一步加重甚至失控，最終導致機體炎性病理損傷[15]。如圖11 所示，與COG相比，MOG 中的TNF-α、IL-6 和IL-1β 經過LPS 刺激后，其含量均極顯著增加（P<0.001），而在1、10、20 μg/mL的QEO 預處理的試驗組，TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量隨著QEO濃度的增加呈極顯著降低（P<0.001），說明QEO 能夠劑量依賴性地抑制LPS 誘導RAW264.7 細胞炎癥因子的過度產生。結果表明QEO 可以顯著抑制由LPS 刺激導致的RAW264.7細胞的炎癥反應。

2.9 奇楠沉香精油對RAW264.7細胞NF-κB信號通路的影響

為了進一步研究QEO發(fā)揮抗炎活性的作用機制，通過蛋白免疫印跡實驗對NF-κB 信號通路進行研究。如圖12 所示，當RAW264.7 細胞被LPS刺激后，P-P65和P-IκB-α蛋白的表達極顯著增加（P<0.001）。然而，經過QEO的預處理能極顯著下調細胞中P-P65 和P-IκB-α蛋白的表達（P<0.001），并且隨著QEO 的增加，其磷酸化蛋白的表達水平逐漸下降，說明QEO 對于P65 和IκB-α 蛋白磷酸化的抑制具有顯著效果，能夠抑制NF-κB 通路的激活，進而發(fā)揮良好的抗炎活性作用。

3 討論

目前有關沉香的研究不斷加深，沉香功效也得到了更多發(fā)掘和利用。QEO作為奇楠沉香最重要的活性成分，開發(fā)價值巨大。本研究從QEO中共鑒定出37 種成分，其主要的化合物類別為色酮類、倍半萜類和芳香族化合物， 含量分別為50.08%、26.28%和12.59%。大量研究發(fā)現從沉香中分離出的色酮類[16]和倍半萜類[17]化合物具有較好的抗炎作用，能夠減輕炎癥損傷。此外，YANG 等[18]對野生和人工栽培的奇楠沉香進行成分比較，發(fā)現其中的色酮類含量明顯不同，分別為72.43%和95.61%，本研究結果與此也有較大差異，這可能與奇楠沉香的種植地、結香方式不同有關。通過體外抗氧化活性試驗發(fā)現，QEO在1～50 mg/mL濃度范圍的DPPH自由基清除率和總抗氧化能力隨著濃度的增加而上升，結果表明QEO 具有較好的抗氧化活性。研究發(fā)現大多數的抗氧化劑的有效成分均具有抗炎特性[19]，綜合以上分析表明QEO 在抗炎方面具有巨大的潛力。

本研究基于上述結果，采用生物信息學方法預測分析QEO的抗炎作用機制。篩選出QEO 與炎癥交集靶點553個，通過拓撲分析得到的成分-靶點網絡圖可以看出QEO中的核心成分類型為倍半萜類化合物和2-（2-苯乙基）色酮，這些結果提示QEO具有多組分、多靶點的作用特點。GO 和KEGG 富集分析結果表明QEO主要通過細胞質膜、細胞質、樹突等細胞組分參與基因表達的調控，主要涉及蛋白磷酸化、炎癥反應、細胞增殖的正向調節(jié)等生物過程， 且發(fā)揮抗炎活性與NF-κB、MAPK、PI3K-Akt 等信號通路有關。其中，NF-κB 是一條經典的與炎癥密切相關的信號通路。在炎癥過程中，NF-κB 通路能夠激活iNOS，iNOS是一種重要的功能酶，可以促使細胞分泌大量的NO[20]。為了進一步明確QEO在發(fā)揮抗炎活性過程中與NF-κB 信號通路的相關性，研究使用RAW264.7 細胞的炎癥模型進行驗證。研究發(fā)現QEO在1～20 μg/mL 濃度范圍對LPS 刺激的RAW264.7 細胞NO 具有極顯著的抑制作用。為了驗證上述結果，本研究對NO 熒光水平進行分析，發(fā)現QEO 在20 μg/mL 時能夠顯著降低細胞內的NO水平，表現出良好的抗炎活性。

此外，研究表明ROS會在細胞受到刺激后大量產生并激活NF-κB 信號通路，促進炎癥相關基因的轉錄和表達[21]。為了進一步深入探究QEO的抗炎活性，本研究對RAW264.7 細胞中的ROS水平進行檢測，結果發(fā)現QEO處理顯著抑制了細胞氧化應激水平，減少了ROS 的表達量。NO水平的升高可以促使RAW264.7細胞分泌促炎因子TNF-α，而TNF-α 又可以調節(jié)IL-6 和IL-1β 細胞因子級聯反應，使細胞損傷級聯效應放大，加重炎癥損傷[22]。因此，抑制炎癥因子的過度釋放是一種有效的抗炎方式。本研究發(fā)現QEO能夠顯著降低TNF-α、IL-6和IL-1β 等炎癥因子的含量，且呈濃度依賴性。此前高小力等[23]的研究表明白木香精油能夠顯著抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞模型中炎癥細胞因子IL-1β 和IL-6 的產生和釋放，這與本研究中的QEO 發(fā)揮抗炎效果的方式一致。此外，本研究發(fā)現QEO 能夠下調P65 和IκB-α蛋白的磷酸化水平，表示QEO具有使P65 和IκB-α的活化受到抑制的作用，說明QEO 能夠通過抑制NF-κB 信號通路的激活，從而表現出良好的抗炎活性作用。

4結論

綜上所述，QEO 的揮發(fā)性成分有2-（2-苯乙基）色酮、石竹素、綠葉烷、欖香醇、2-烯丙基-6-甲基苯酚等，且具有一定的抗氧化能力。生物信息學預測QEO 與炎癥共有553 個交集靶點，且QEO發(fā)揮抗炎活性與MAPK、NF-κB、PI3K-Akt 等信號通路有關。此外，本研究揭示了QEO 能夠顯著抑制由LPS 誘導的過量ROS 的產生，抑制NF-κB信號通路的激活，進而抑制NO、TNF-α、IL-6 和IL-1β 的大量產生，從而發(fā)揮抗炎活性的作用機制。本研究通過揮發(fā)性成分分析和分子細胞生物學的方法對QEO 的抗炎活性進行了闡釋，為進一步開發(fā)和高效利用奇楠沉香資源提供理論基礎。