關(guān)鍵詞：金釵石斛；幼苗；ITS 擴(kuò)增子測(cè)序；菌根真菌；種群重建

中圖分類號(hào)：S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

蘭科（Orchidaceae）是被子植物中物種數(shù)量較為豐富的類群之一，全世界約有870 屬29 524種[1]，我國(guó)約有181 屬1708 種[2]。蘭科植物的生存和繁衍依賴于專性的共生真菌和傳粉昆蟲[3-4]，因此更容易受到氣候變化和人為采集的影響[5-6]。目前所有野生蘭科植物均列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES），并嚴(yán)禁在國(guó)際上交易流通[7]。蘭花中不乏有一些具有重要觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值的種類，如石斛屬（Dendrobium）、開唇蘭屬（Anoectochilus）、獨(dú)蒜蘭屬（Pleione）等。蘭科植物不僅是植物多樣性保護(hù)的旗艦類群，也是科學(xué)研究的熱點(diǎn)類群。

蘭科植物的種子大多細(xì)若粉塵，缺乏胚乳儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)，需要共生真菌為其提供碳源、氮源、水和無(wú)機(jī)鹽等才能成功萌發(fā)[8-9]。共生真菌的菌絲在種子萌發(fā)形成的原球莖基部細(xì)胞中或成年植株的根皮層細(xì)胞內(nèi)部會(huì)纏繞形成菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu)（peloton），這是蘭科菌根的典型特征[10]。蘭科植物在生命伊始就與共生真菌建立了特殊的營(yíng)養(yǎng)作用關(guān)系，二者無(wú)論是在生理上還是生態(tài)上均存在密切的聯(lián)系。與蘭科植物共生的典型真菌類群俗稱“ 蘭科絲核菌” 包括： 蠟殼耳科（ Sebacinaceae）、無(wú)孢蠟殼科（Serendipitaceae）、膠膜菌科（Tulasnellaceae）和角擔(dān)菌科（Ceratobasidiaceae）等[10]。此外，一些外生菌根真菌和腐生真菌也可以作為蘭科植物的共生真菌而存在[11]。蘭科植物在整個(gè)生活史中總是部分或完全依賴共生真菌獲取必要的營(yíng)養(yǎng)，因此探究蘭科植物與共生真菌關(guān)系的穩(wěn)定性及其變化規(guī)律，對(duì)蘭花的人工栽培和野外回歸具有重要意義。

多數(shù)蘭科植物從種子至成年植株的發(fā)育過程中，需要先經(jīng)歷依賴真菌獲取營(yíng)養(yǎng)的異養(yǎng)階段，然后才逐步開始光合自養(yǎng)。由于營(yíng)養(yǎng)需求的轉(zhuǎn)變，共生真菌類群可能會(huì)發(fā)生變化。VENTRE 等[12]綜合分析了蘭科菌根真菌種類隨宿主發(fā)育的轉(zhuǎn)變模式包括：不轉(zhuǎn)變、嵌套性增加或減少、部分替換以及完全替換4 種類型。某些蘭科植物終生偏好于某一特定真菌類群，如杏黃兜蘭（Paphiopedilumarmeniacum）從幼苗到開花的發(fā)育過程中，僅有膠膜菌科真菌是優(yōu)勢(shì)類群[13]；歐洲對(duì)葉蘭（Neottia ovata）從原球莖到成年植株階段的主要真菌類群均為無(wú)孢蠟殼科[14]。共生真菌在蘭花生命歷程中發(fā)生轉(zhuǎn)變也是常見的模式，藥用植物天麻（Gastrodia elata）種子的萌發(fā)依賴紫萁小菇（Mycena osmundicola），而原球莖后續(xù)發(fā)育需要與蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）共生[15]。同樣在地生蘭和附生蘭中發(fā)現(xiàn)了真菌類群轉(zhuǎn)變，杜鵑蘭（Cremastra appendiculata）在原球莖階段的優(yōu)勢(shì)真菌屬于鬼傘科（Psathyrellaceae），在成年后增加了角擔(dān)菌科和蠟殼耳目（Sebacinales）[16]；而風(fēng)蘭（Vanda falcata）的種子萌發(fā)由角擔(dān)菌科真菌誘導(dǎo)，成年植株還與膠膜菌科真菌共生[17]。由此可見，蘭科植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的共生真菌轉(zhuǎn)變模式不盡相同，對(duì)于特定的蘭花物種往往需要野外驗(yàn)證，才能深入了解其自然狀態(tài)下對(duì)共生真菌的真實(shí)需求。

依賴有效的促萌發(fā)真菌對(duì)蘭科植物進(jìn)行野外種苗擴(kuò)繁是瀕危物種恢復(fù)的有效手段。目前基于種子和共生真菌的人工擴(kuò)繁主要集中在地生蘭，JIANG 等[18] 針對(duì)藥用植物手參（ Gymnadeniaconopsea）的野外原地共生萌發(fā)試驗(yàn)證實(shí)了角擔(dān)菌屬（Ceratobasidium）GS2 菌株能夠在自然條件下促使手參種子成功萌發(fā)并形成幼苗；對(duì)于具有觀賞價(jià)值的紋蝶蘭（Anacamptis papilionacea），膠膜菌科AP1 菌株能夠有效促進(jìn)其種子在原地條件發(fā)育為幼苗[19]。本實(shí)驗(yàn)室前期也利用一株蠟殼耳科JC-01 菌株對(duì)瀕危附生蘭金釵石斛（Dendrobiumnobile）開展了適宜自然生境下的原地共生萌發(fā)，成功建立了人工種群[20]。然而，這些在自然條件下形成的人工幼苗，其根系真菌的變化模式有待進(jìn)一步探究，這將有助于理解個(gè)體在發(fā)育過程中對(duì)共生真菌的動(dòng)態(tài)需求以及共生真菌對(duì)人工種群維持和變化的影響。

石斛（D. nobile Lindl.），又稱金釵石斛，是石斛屬多年生附生草本植物，因干燥后形態(tài)酷似我國(guó)古代婦女的發(fā)釵而得名[21]。作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，金釵石斛被《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）所收錄。金釵石斛莖中富含石斛堿、多糖和酚類等有機(jī)化合物等，經(jīng)藥理研究證明有降血糖血脂、抗氧化衰老以及抗腫瘤等功能[22]。然而，對(duì)金釵石斛的過度利用以及自身繁殖率低等原因?qū)е乱吧Y源瀕危[23]，我國(guó)2021 年頒布的《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》將其列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。本研究所用的金釵石斛幼苗基于“種子-真菌混合播種技術(shù)”在茶樹上獲得種苗，并在采集根系的基礎(chǔ)上對(duì)比人工擴(kuò)繁的幼苗與自然形成的幼苗在共生真菌群落組成和多樣性方面的差異，同時(shí)也對(duì)人工幼苗種群的共生真菌的菌群轉(zhuǎn)變模式進(jìn)行探究，以期為金釵石斛的種苗繁育和人工種群生態(tài)恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

利用種子原地共生萌發(fā)技術(shù)，于2023年4月在云南省勐臘縣象明鄉(xiāng)茶園（22°13′N，101°20′E，海拔約為1500 m）播種獲得金釵石斛人工幼苗，播種方法參照本實(shí)驗(yàn)室已有的成熟技術(shù)[24]進(jìn)行，利用2 株膠膜菌科真菌（編號(hào)為FDL-01、JC-03）、2 株蠟殼耳科真菌（編號(hào)為JC-01、YB-01）和4株無(wú)孢蠟殼科真菌（編號(hào)為L(zhǎng)P-01、RJC-131、YB-03 和YDLXB）作為真菌處理組，不添加真菌的作為空白對(duì)照組（CK）。于當(dāng)年8 月、9 月和10 月分別采集真菌處理組120d（4 月齡）、150d（5 月齡）、180d（6 月齡）及CK 的幼苗根樣，每個(gè)處理采集3個(gè)重復(fù)樣本。將收集的根系樣本分裝至無(wú)菌采樣袋中并做好標(biāo)記，置于生物樣品采樣箱中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

直播茶園所在的象明鄉(xiāng)是典型熱帶季風(fēng)氣候區(qū)， 年平均溫度21.9 ℃ ， 年降雨量為1500～1900 mm，森林覆蓋率達(dá)到64.96%，主要植被類型為熱帶雨林、亞熱帶常綠闊葉林、落葉闊葉林等[25]。茶園中的主要樹種是普洱茶（Camelliasinensis var. assamica），周圍伴有一定的遮蔭喬木。茶園溫暖、濕潤(rùn)以及一定遮蔭的生態(tài)條件適于金釵石斛種子的野外共生萌發(fā)。

1.2 方法

1.2.1 根樣處理參考 PANDEY 等[26]的方法對(duì)金釵石斛幼苗根樣進(jìn)行處理，先用流水清洗干凈根上附著的苔蘚等雜質(zhì)，然后用無(wú)菌濾紙吸干水分。隨后用75%乙醇消毒1 min，再用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為3%的次氯酸鈉溶液消毒30 s，重復(fù)75%乙醇消毒1 min，最后用無(wú)菌純水清洗5 次。消毒的根樣用無(wú)菌濾紙吸干水分后，刮去根被。將處理的根樣放入無(wú)菌離心管并編號(hào)，置于液氮中速凍，于–80 ℃冰箱低溫保存。

1.2.2 真菌總 DNA的提取和rDNA-ITS 擴(kuò)增子測(cè)序 金釵石斛幼苗根樣品經(jīng)冷鏈運(yùn)輸至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行真菌總DNA 的提取和rDNA-ITS 擴(kuò)增子測(cè)序。以真菌核糖體DNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2 序列為目標(biāo)，用蘭科菌根真菌特異性引物ITS3（5?–GCATCGATGAAGAACGCAGC–3?）和ITS4OF（5?–GTTACTAGGGGAATCCTTGTT–3?），并添加特異性標(biāo)簽序列（AAGCACTG）對(duì)ITS2 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[27]?；厥蘸蟮腜CR 產(chǎn)物進(jìn)行定量與測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建，對(duì)質(zhì)量合格的文庫(kù)，在NovaSeq-PE250（Illumina，USA）平臺(tái)上進(jìn)行2×250 bp 的雙端測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)得到的下機(jī)原始序列文件，首先利用QIIME2 軟件（ Quantitative Insights Into MicrobialEcology， v2023-7， http：//qiime.org/）的cutadapt 插件去除序列的引物片段，然后在R 軟件中用DADA 2 方法對(duì)序列進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)量過濾、去噪、拼接和去嵌合體等質(zhì)控步驟，將序列以100%相似度聚類，得到ASVs（amplicon sequence variants）特征序列，去除序列總數(shù)僅為1 的ASVs 后得到ASVs 特征表。使用QIIME 2 軟件以最低樣本量的95%對(duì)各樣本進(jìn)行抽平，預(yù)測(cè)同一測(cè)序深度下觀測(cè)到的ASVs 數(shù)量及其相對(duì)豐度，計(jì)算α 多樣性指數(shù)并繪制稀疏曲線；使用R 軟件中的Venndiagram 包繪制不同樣本間的Venn 圖，分析不同分組間獨(dú)有和共有的ASVs 數(shù)量； 基于真菌UNITE 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用QIIME 2 軟件的classifysklearn插件對(duì)每個(gè)ASVs 特征序列進(jìn)行物種注釋，繪制物種堆積柱狀圖；使用R 軟件中的vegan包和ggplot2 包分別計(jì)算Bray-Curtis 距離和繪制主坐標(biāo)分析圖，結(jié)合ANOSIM 相似性分析，分析樣本間群落結(jié)構(gòu)的差異。

不同播種方式比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，不同齡期比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金釵石斛幼苗根樣測(cè)序結(jié)果

基于Illumina NovaSeq-PE250高通量測(cè)序結(jié)果，不同金釵石斛幼苗根樣品中的序列長(zhǎng)度主要分布在350～400 bp 之間，共獲得1029977條高質(zhì)量的ITS2序列，金釵石斛4 月齡、5 月齡、6月齡和CK 根中分別獲得287969、232556、274084、235368條有效序列（圖1）。各樣品的ASVs 曲線隨著測(cè)序深度的增加而趨于平緩，覆蓋度接近100%，表明本次測(cè)序量達(dá)到飽和狀態(tài)，能夠全面覆蓋幼苗根系的真菌類群。

通過剔除非真菌序列、嵌合體和singleton 序列等質(zhì)控步驟并結(jié)合聚類分析，共得到876 個(gè)真菌ASVs。真菌處理組的金釵石斛幼苗根系的真菌ASVs 為686 個(gè)，多于CK（264個(gè)），二者共有80 個(gè)真菌ASVs（圖2A）。金釵石斛4月齡、5月齡和6 月齡幼苗根系的真菌ASVs 總量和獨(dú)特的真菌ASVs 數(shù)量隨齡期的增長(zhǎng)而增加，不同月齡幼苗根系的真菌ASVs 總數(shù)分別為134、262和399個(gè)，三者共有29個(gè)真菌ASVs。金釵石斛6月齡幼苗根系獨(dú)特的真菌數(shù)量最多，達(dá)335 個(gè)ASVs（圖2B）。

2.2金釵石斛幼苗根系真菌多樣性

對(duì)于不同處理的金釵石斛幼苗根樣，真菌處理組的菌群豐度指數(shù)Chao1 指數(shù)（109.69±45.23）高于CK（102.98±42.27），即真菌處理組幼苗根系的物種數(shù)目多于CK；而真菌處理組的菌群多樣性指數(shù)Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均低于CK，真菌處理組與CK 間3 個(gè)多樣性指數(shù)均無(wú)顯著差異。在不同齡期的金釵石斛幼苗根系中，6月齡幼苗的Chao1 指數(shù)（156.45±22.35）顯著高于4月齡幼苗（66.17±3.49）和5 月齡幼苗（106.45±2.23），6 月齡幼苗的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)同樣也高于其他齡期，但無(wú)顯著性差異（表1）。

基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析對(duì)不同處理的金釵石斛幼苗根系真菌群落組成信息進(jìn)行降維和排序后投射于二維平面上，結(jié)果顯示真菌處理組和CK 各聚為一類（圖3A）。根據(jù)樣本點(diǎn)的分布情況，真菌處理組各樣本點(diǎn)比CK 更加聚集，結(jié)合ANOSIM 非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果，雖然兩組間菌落組成差異較大（R²=0.778），但并無(wú)顯著差異。而在不同齡期的幼苗樣品中，4 月齡、5 月齡和6 月齡也各聚為一類，其中6月齡樣本點(diǎn)的分布比其他月齡更加分散（圖3B）。對(duì)不同齡期幼苗根系真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行ANOSIM 檢驗(yàn)表明，金釵石斛幼苗不同齡期之間的根系真菌群落組成具有一定差異（R²=0.424），且差異顯著（P=0.005）。

2.3 金釵石斛幼苗根系真菌物種組成

2.3.1 不同直播方式 從真菌處理組和CK 的幼苗根樣品中獲得870 個(gè)真菌ASVs，隸屬于2 門11 綱28 目46 科56 屬，兩組之間根系真菌群落的種類組成和相對(duì)豐度有一定差異。在門水平，真菌處理組和CK 的根系真菌均由擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門（Ascomycota）組成，兩類真菌的相對(duì)豐度類似，擔(dān)子菌門分別為83.29%和83.93%，子囊菌門分別為16.71%和16.07%（圖4A）。

在綱水平，真菌的主要綱（相對(duì)豐度大于1%）包括： 傘菌綱（ Agaricomycetes ） 、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）和錘舌菌綱（Leotiomycetes）。傘菌綱是真菌處理組和CK 的優(yōu)勢(shì)綱，相對(duì)豐度分別達(dá)80.04%和83.75%。其余各綱的相對(duì)豐度均低于10%，其中糞殼菌綱在真菌處理組的相對(duì)豐度較高，達(dá)9.15%，而座囊菌綱在CK 的豐度達(dá)7.80%（圖4B）。

在目水平，主要類群（相對(duì)豐度大于2%）有：蠟殼耳目、雞油菌目（Cantharellales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、Conioscyphales、刺盾炱目（Chaetothyriales）、曲霉目（Eurotiales）和銀耳目（Tremellales）。蠟殼耳目是真菌處理組和CK的優(yōu)勢(shì)目，相對(duì)豐度分別為79.71%和67.52%。對(duì)于真菌處理組而言，其余各目的相對(duì)豐度均低于5%，而在CK 中，雞油菌目和格孢腔菌目的相對(duì)豐度分別為16.22%和6.74%（圖4C）。

在科水平，主要類群（相對(duì)豐度大于2%）包括： 無(wú)孢蠟殼科、蠟殼耳科、膠膜菌科、Conioscyphaceae、Herpotrichiellaceae 和大皰擔(dān)子科（Bulleribasidiaceae）。無(wú)孢蠟殼科是真菌處理組和CK 的優(yōu)勢(shì)科，相對(duì)豐度分別達(dá)57.52%和55.55%。蠟殼耳科在兩組中的相對(duì)豐度占比均較高，分別為22.19%和11.98%。膠膜菌科僅出現(xiàn)在CK 中，相對(duì)豐度達(dá)16.22%。其余各科的相對(duì)豐度在兩組中均低于5%（圖4D）。

在屬水平，真菌的主要屬（相對(duì)豐度大于2%）有： 無(wú)孢蠟殼屬（ Serendipita ） 、蠟殼耳屬（Sebacina）、膠膜菌屬（Tulasnella）、Conioscypha、Pyrenochaetopsis、Hannaella 和Medicopsis。無(wú)孢蠟殼屬和蠟殼耳屬是真菌處理組的優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)豐度分別達(dá)57.52%和22.19%，而CK 的優(yōu)勢(shì)屬不僅包括無(wú)孢蠟殼屬和蠟殼耳屬，還包括膠膜菌屬，相對(duì)豐度分別為55.55%、11.98%和16.22%。其余各屬的相對(duì)豐度均低于5%（圖4E）。此外，針對(duì)相對(duì)豐度大于5%的不同真菌屬進(jìn)行組間差異分析，結(jié)果顯示無(wú)孢蠟殼屬在兩組間的差異不大，而真菌處理組的蠟殼耳屬相對(duì)豐度比CK 高10.21%。膠膜菌屬僅出現(xiàn)在CK，相對(duì)豐度比蠟殼耳屬高4.24%，是CK 幼苗根系的優(yōu)勢(shì)屬之一（圖4F）。

2.3.2 不同齡期 從真菌處理組不同齡期幼苗根樣品中獲得686 個(gè)真菌ASVs，隸屬于2 門11 綱28 目46 科56 屬，不同齡期幼苗根系真菌群落的種類組成和相對(duì)豐度有一定差異。在門水平，各齡期幼苗根系真菌均由擔(dān)子菌科和子囊菌科組成，隨著培養(yǎng)齡期的增加，擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度逐漸下降，而子囊菌門則逐漸增加（圖5A）。

在綱水平，傘菌綱（97.62%）是4 月齡幼苗的主要真菌類群，其相對(duì)豐度隨幼苗齡期的增長(zhǎng)而減少，其余綱的相對(duì)豐度均小于1%；5月齡幼苗根中的糞殼菌綱、散囊菌綱和銀耳綱的相對(duì)豐度比4 月齡分別增加至3.56%、4.35%和7.93%；6月齡幼苗根中的糞殼菌綱和散囊菌綱的相對(duì)豐度則分別增至23.38%和9.09%，而銀耳綱的相對(duì)豐度降至0.72%（圖5B）。

在目水平，4月齡幼苗根系的主要目是蠟殼耳目（相對(duì)豐度為97.61%），其余目的相對(duì)豐度均小于1%。除蠟殼耳目外，5月齡幼苗根中相對(duì)豐度較高的真菌類群為銀耳目（7.94%），但6月齡幼苗根中的銀耳目相對(duì)豐度卻降為0.72%，而Conioscyphales 和曲霉目的相對(duì)豐度則分別增至12.65%和7.12%（圖5C）。

在科水平，無(wú)孢蠟殼科和蠟殼耳科是4 月齡幼苗根系的主要真菌類群， 相對(duì)豐度分別為76.55%和21.06%，其余真菌科的相對(duì)豐度低于1%。5 月齡幼苗的主要真菌科為無(wú)孢蠟殼科、蠟殼耳科和大皰擔(dān)子科，而6 月齡幼苗的主要真菌科基于上一階段還增加了發(fā)菌科（Trichocomaceae，5.70%）和毛殼科（Chaetomiaceae， 4.49%）（圖5D）。

在屬水平，無(wú)孢蠟殼屬和蠟殼耳屬占據(jù)4 月齡幼苗根系主要地位，總體相對(duì)豐度高達(dá)97.61%。5 月齡幼苗根系的主要真菌類群在4 月齡幼苗的基礎(chǔ)上增加了Hannaella （ 6.75% ） 和曲霉屬（Aspergillus， 3.11%），而6 月齡幼苗根中優(yōu)勢(shì)真菌轉(zhuǎn)變?yōu)镃onioscypha （ 12.65%） 、籃狀菌屬（Talaromyces， 5.71%）和Arcopilus（4.15%）（圖5E）。此外，針對(duì)相對(duì)豐度大于5%的真菌屬進(jìn)行組間差異分析，結(jié)果顯示無(wú)孢蠟殼屬?gòu)? 齡期幼苗轉(zhuǎn)變成5 齡期幼苗過程中相對(duì)豐度減少了28.11%，而在后續(xù)發(fā)育中趨于穩(wěn)定；蠟殼耳屬?gòu)? 月齡到6 月齡的相對(duì)豐度呈先增后降的趨勢(shì)；Hannaella 是5 月齡幼苗的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)真菌，相對(duì)豐度達(dá)6.75%，該真菌類群在其他齡期幼苗根中的相對(duì)豐度小于1%；Conioscypha 和籃狀菌屬的相對(duì)豐度隨幼苗的生長(zhǎng)而增加，在6 月齡幼苗中的相對(duì)豐度分別達(dá)到12.65%和5.71%（圖5F）。

3討論

本研究表明金釵石斛種子原地共生萌發(fā)不同處理方式形成的幼苗根系在真菌群落組成和相對(duì)豐度方面具有一定差異，真菌處理組和CK 的優(yōu)勢(shì)真菌類群有重疊，但CK 能夠招募到環(huán)境中的膠膜菌科真菌并作為優(yōu)勢(shì)類群而存在。不同齡期幼苗根系的菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，真菌的豐富度和多樣性隨幼苗生長(zhǎng)而增加，典型蘭科共生真菌的相對(duì)豐度隨著月齡的增加而下降，同時(shí)非共生真菌的占比增加，且種類和豐度具有齡期特異性。

金釵石斛原地共生萌發(fā)形成的幼苗和自然條件（CK）形成的幼苗中，二者的真菌ASVs 數(shù)量雖然差別較大，但真菌群落的豐富度和多樣性無(wú)顯著差異，表明在同質(zhì)的環(huán)境下，金釵石斛幼苗偏好性地選擇相似的共生真菌作為主要類群，如蠟殼耳目。某些蘭科植物也表現(xiàn)出在相似的生境下選擇相同的真菌類群的現(xiàn)象。在大陸尺度上，分布于亞洲的不同手參種群偏好的共生真菌均屬于角擔(dān)菌科[28]；而生長(zhǎng)在同一個(gè)島嶼上的琉球石斛（D. okinawense）均傾向于選擇同一株膠膜菌科真菌TU11 作為主要共生菌[29]；分布于相似沼澤生境的5 個(gè)幽靈蘭（D. lindenii）種群，其根系的優(yōu)勢(shì)共生真菌均為角擔(dān)菌科真菌[30]。雖然蘭科共生真菌是廣泛分布的，但某些真菌在局部特殊生境中相對(duì)較高的豐度可能使同一環(huán)境內(nèi)的蘭花個(gè)體對(duì)共生真菌的選擇更加局限和集中。

在本研究中，金釵石斛幼苗根系真菌的多樣性和豐度隨著齡期的增長(zhǎng)而逐漸增加，同時(shí)獨(dú)特的ASVs 數(shù)量也隨之增加，從4 月齡幼苗的79 個(gè)ASVs 增加到6 月齡幼苗的355 個(gè)ASVs。當(dāng)幼苗逐漸適應(yīng)環(huán)境而存活下來，環(huán)境中的機(jī)會(huì)性真菌（opportunistic fungi）勢(shì)必會(huì)占據(jù)根中的一席之地。這一現(xiàn)象也常見于其他蘭花類群，如黃花白及（Bletilla ochracea）從生長(zhǎng)期到花期的發(fā)育過程中，真菌OTUs 從119 個(gè)增加到270 個(gè)[31]；在哥斯達(dá)黎加熱帶雨林共存的4 種附生蘭，從幼年階段到成年階段的發(fā)育過程中其根系的核心真菌類群會(huì)保留，同時(shí)增加了新的真菌類群[32]。但這種規(guī)律不能一概而論，對(duì)杏黃兜蘭生長(zhǎng)過程中的真菌組成研究表明，杏黃兜蘭從幼苗的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變到成年植株的生殖生長(zhǎng)期間，根系的真菌OTUs 數(shù)量從幼苗時(shí)期的126 個(gè)降至開花時(shí)期的67 個(gè)[13]；針對(duì)風(fēng)蘭的菌群變化的研究則顯示，幼苗和成年植株的真菌群落組成保持相對(duì)穩(wěn)定，子囊菌門占比超過一半，其次為擔(dān)子菌門，其中典型的蘭科共生菌僅占少部分[33]。不同生活型的蘭花在生長(zhǎng)期間復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)需求可能會(huì)導(dǎo)致真菌類群組成的變化，從而影響特定時(shí)期的真菌豐度差異。

在本研究的金釵石斛幼苗根系的真菌組成中，典型的蘭科植物共生真菌占據(jù)大部分，在真菌處理組種子原地共生萌發(fā)形成的幼苗中主要由無(wú)孢蠟殼屬和蠟殼耳屬組成，而在CK 組形成的幼苗中，膠膜菌屬同樣成為了優(yōu)勢(shì)真菌。金釵石斛的共生真菌種類豐富，早期從金釵石斛根中分離到角擔(dān)菌屬和蘭小菇（Mycena orchidicola），被認(rèn)為是潛在的共生真菌[34]，這已在鐵皮石斛（D.officinale）的種子共生萌發(fā)試驗(yàn)中得到證實(shí)[35]。本研究中，CK 的幼苗能夠招募到膠膜菌屬真菌，暗示周圍環(huán)境中有該真菌類群的存在和分布，但真菌處理組幼苗根系中該類群的相對(duì)豐度僅為0.02%，低于CK（16.22%），這可能是因?yàn)槿斯ぬ砑拥恼婢谝巴獠シN點(diǎn)建立了局部?jī)?yōu)勢(shì)并與環(huán)境中的真菌彼此具有拮抗作用，導(dǎo)致真菌處理組根系中膠膜菌科真菌的相對(duì)豐度極低。然而蘭科共生真菌之間的拮抗關(guān)系驗(yàn)證試驗(yàn)主要集中在實(shí)驗(yàn)室條件下，與單獨(dú)菌株的種子共生萌發(fā)相比，不同共生真菌的疊加培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致金釵石斛和紋蝶蘭的種子萌發(fā)率下降[36-37]，本研究結(jié)果也初步表明共生真菌的拮抗作用可能在金釵石斛種子原地共生萌發(fā)中存在。

金釵石斛幼苗根系真菌組成并非一成不變，隨著齡期的增長(zhǎng)（4 月齡至6 月齡），優(yōu)勢(shì)真菌的占比逐漸下降，而機(jī)會(huì)性真菌的相對(duì)豐度逐漸增加。在優(yōu)勢(shì)真菌屬中，無(wú)孢蠟殼屬的相對(duì)豐度先下降后趨于穩(wěn)定，而蠟殼耳屬的相對(duì)豐度則先增后降，這反映出金釵石斛幼苗隨著個(gè)體發(fā)育變化對(duì)共生真菌的偏好性發(fā)生了改變。這種偏好性變化可能與蘭科植物在不同生長(zhǎng)時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)需求有關(guān)，一項(xiàng)針對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)型鳥巢蘭屬（Neottiaspp.）蘭花的研究發(fā)現(xiàn)，能夠進(jìn)行光合作用的類群通常在發(fā)育早期與無(wú)孢蠟殼科真菌建立共生關(guān)系，而腐生的類群則經(jīng)常與蠟殼耳科真菌共生[14]。推測(cè)其原因可能是無(wú)孢蠟殼科真菌僅能夠支持蘭科植物早期真菌異養(yǎng)萌發(fā)時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)需求，在幼苗逐漸生根的過程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求逐漸增大，不足以支持后續(xù)的大量營(yíng)養(yǎng)需求[38]。而蠟殼耳科是腐生蘭[如鳥巢蘭（Neottia nidus-avis）]的主要共生真菌類群，因其同時(shí)具有形成外生菌根的能力，很可能從周圍樹木中獲取碳源，從而支持腐生蘭完成其生活史[39]，據(jù)此推測(cè)5 月齡幼苗根系中蠟殼耳屬真菌增加的原因是該類群具有更加高效的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)能力。此外，5 月齡幼苗根系特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬是Hannaella，據(jù)報(bào)道是禾本科（Poaceae）植物內(nèi)生酵母菌能夠產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸（IAA），促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，是潛在的金釵石斛內(nèi)生真菌資源[40]。6 月齡幼苗的優(yōu)勢(shì)真菌屬為Conioscypha 和籃狀菌屬，前者主要從沉水腐爛的木屑中分離得到[41]，可能是茶園環(huán)境中廣泛存在的機(jī)會(huì)性真菌；后者則是青霉菌屬（Penicillium）的有性世代，是典型的植物內(nèi)生真菌，在幫助幼苗抵抗病原微生物方面可能具有重要作用[42]。

本研究明確了金釵石斛人工形成的幼苗和自然形成的幼苗根系在共生真菌和內(nèi)生真菌的多樣性和真菌群落組成上的差異，以及不同齡期人工幼苗根系的共生真菌及內(nèi)生真菌相對(duì)豐度的變化模式。在后期有必要對(duì)金釵石斛幼苗根系中潛在的有功能性的共生真菌和內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和驗(yàn)證，將具有生態(tài)功能的菌株應(yīng)用到金釵石斛的野外回歸中，維持人工幼苗群落穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)該瀕危物種的生態(tài)恢復(fù)。

致謝 感謝云南省林業(yè)和草原科學(xué)院研究員蔣宏和深圳市蘭科植物保護(hù)和研究中心資源管理部副部長(zhǎng)孔德敏惠贈(zèng)金釵石斛種子。感謝曲靖師范學(xué)院Don NalinNilusha Wijayawardene 教授對(duì)英文摘要的修改。感謝普洱學(xué)院實(shí)習(xí)生龍?zhí)m和王汶倩以及租車師傅王玉明在野外直播試驗(yàn)中的幫助。