[摘要] 目的 本研究旨在探究香芹酚水凝膠對牙周炎大鼠牙槽骨的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 以泊洛沙姆、羥丙基甲基纖維素為基質(zhì)，制備負(fù)載香芹酚的溫敏型水凝膠。SD大鼠經(jīng)結(jié)扎線法造模，隨機(jī)分為空白對照組、牙周炎組、空白水凝膠組及低、中、高劑量香芹酚水凝膠組，觀察各組大鼠牙周炎癥狀及牙槽骨CT 結(jié)構(gòu)；觀察肝、脾、腎及牙周組織變化；檢測血清中骨代謝指標(biāo)；Western blot 檢測骨保護(hù)素（OPG） 及核因子-κB （NF-κB） 通路蛋白表達(dá)；定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 檢測炎性因子水平。結(jié)果 香芹酚水凝膠具有良好緩釋性、生物相容性及細(xì)胞黏附性；香芹酚水凝膠組大鼠牙周炎癥狀明顯減輕，牙齦組織中OPG蛋白表達(dá)顯著增加（Plt;0.01），核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）、核因子-κB受體活化因子（RANK）、NF-κB蛋白水平及各炎癥因子水平大幅降低（Plt;0.01）。結(jié)論 香芹酚水凝膠可調(diào)節(jié)OPG、NF-κB通路，減少牙槽骨吸收，改善牙周炎癥。

[關(guān)鍵詞] 牙周炎； 香芹酚； 水凝膠； 骨保護(hù)素通路； 核因子-κB通路； 牙槽骨吸收

[中圖分類號] Q257 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2024.2024037

牙周炎是人類常發(fā)的一種慢性炎癥性、非傳染性的疾病，主要臨床表現(xiàn)為牙齦附著喪失、牙齦出血、牙周袋形成、牙槽骨缺失[1]，同時(shí)伴隨咀嚼紊亂、疼痛等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響人體健康[2]。有研究表明牙周炎與多種人類全身系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)，如心腦血管疾病[3]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4]、糖尿病[5]等。目前，臨床上多通過機(jī)械清創(chuàng)聯(lián)合抗生素治療牙周炎[6]，然而，頻繁使用抗生素類藥物，常會導(dǎo)致出現(xiàn)藥物殘留、耐藥菌及藥物不良反應(yīng)等問題[7-9]。因此，尋找一種具有低不良反應(yīng)、低耐藥性、低殘留的天然植物藥物作為抗生素的替代品，是人類牙周炎治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和臨床需求。

香芹酚（carvacrol） 是一類來源廣泛、價(jià)格低廉、安全可靠的藥用植物提取物[10-12]，具有廣譜抗菌、抗炎、抗氧化、低細(xì)胞毒性以及骨保護(hù)等作用[13-14]，已將其添加至漱口水、牙科封閉劑、水門汀、凝膠、甘油等藥物中，用來治療牙本質(zhì)敏感、牙周炎、牙髓炎等口腔常見疾病[15]。但由于其具有疏水性以及不穩(wěn)定性等特點(diǎn)[16]，限制了其藥物治療方面的應(yīng)用。因此，需要選擇合適的載藥系統(tǒng)負(fù)載香芹酚以改善其疏水性，提高穩(wěn)定性及生物活性。

溫敏型水凝膠作為一種具有親水性的三維網(wǎng)狀凝膠，因其良好的生物相容性、黏膜親和力性及生物降解性[17-19]，常被用作藥物緩釋載體，在生物醫(yī)學(xué)、組織工程等方面有著廣泛應(yīng)用。泊洛沙姆（poloxamer，PEO-PPO-PEO） 是一種溫敏型合成聚合物，常用來制備可注射水凝膠[20]。與其他常用的水凝膠基質(zhì)，如殼聚糖、透明質(zhì)酸等相比，泊洛沙姆水凝膠制作工藝簡單，只需混合交融即可，不需要對化學(xué)鍵進(jìn)行修飾或者改性，同時(shí)由于其獨(dú)特三嵌段結(jié)構(gòu)，使其具有一定的親油性[21]，能夠增加香芹酚的溶解性。但采用單一泊洛沙姆制備的水凝膠，普遍存在著穩(wěn)定性差、功能單一、相變溫度區(qū)間大等問題[22]。因此，常將泊洛沙姆407 （F127） 與泊洛沙姆188 （F68） 聯(lián)合使用，來提高膠凝溫度[23]。羥丙基甲基纖維素（hydroxypropylmethyl cellulose，HPMC） 作為懸浮劑不僅可以增加水凝膠體系的黏附性，還能升高膠凝溫度，延長水凝膠在室溫條件下的保存時(shí)間[24]。本研究選擇泊洛沙姆407 （F127）、188 （F68） 和HPMC作為基質(zhì)，制備負(fù)載香芹酚的溫敏型水凝膠，以實(shí)現(xiàn)局部特異性給藥。該給藥方式不僅可以避免因肝臟首過效應(yīng)而造成藥效減少、多次給藥或者增大藥量等問題，而且還能有助于維持和控制藥物釋放的時(shí)間和濃度[25]。

研究證明，骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB 受體活化因子配體（receptor activatorof NF-κB ligand，RANKL） /核因子-κB受體活化因子（receptor activator of NF- κB，RANK）信號通路及核因子-κB （nuclear transcription factor-κB，NF-κB） 信號通路在牙周炎的發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，不僅參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，還涉及骨吸收等關(guān)鍵過程[26-27]。然而，香芹酚對該通路的作用及機(jī)制，目前尚未有研究報(bào)道。為此，本研究擬通過構(gòu)建大鼠牙周炎動(dòng)物模型，觀察香芹酚水凝膠對大鼠牙槽骨缺損的修復(fù)效果，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

本實(shí)驗(yàn)過程中所涉及到的動(dòng)物飼養(yǎng)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過了東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會（SRM-11） 的認(rèn)可（編號：NEAUEC20230341）。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

由遼寧長生生物科技有限公司供應(yīng)SPF 級健康雌性SD 大鼠100 只，周齡約4 周，體重180～200 g，執(zhí)照編號為SCXK （遼） 2020-0001。將大鼠集中安置于光照、溫度、濕度均適宜的環(huán)境中飼養(yǎng)[28]，1 周之后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)挑選出15只大鼠作為對照組（control group，C），剩余作為模型組，用于構(gòu)建牙周炎模型。

1.2 主要藥物和試劑

香芹酚（純度99%，南京百慕達(dá)生物科技有限公司）；泊洛沙姆407 （F127）、188 （F68）、HPMC（Sigma Aldrich 公司，美國）；牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis， P. gingivalis， BNCC-353909，北納生物科技有限公司）；具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn). nucleatum，TS273-849，寧波泰斯拓生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；肌酐（creatinine，CRE）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvictransaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartatetransaminase，AST） 試劑盒（南京建成生物工程研究所）； 一抗OPG、RANKL、RANK、p-P65、p-IKBα、p-IKKα/β （沈陽萬類生物科技有限公司）；二抗β -actin （武漢塞維爾生物科技有限公司）；OPG、RANKL、RANK、白細(xì)胞介素（interleukin，IL） -1β、腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceralde‐hyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.3 主要儀器

恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）；電泳儀（上海天能科技有限公司）；轉(zhuǎn)膜儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；Western blot 全自動(dòng)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.4 方法

1.4.1 溫敏型水凝膠的制備

采用冷溶法制備溫敏型水凝膠[29-30]。稱取定量的F127、F68 和HPMC，溶于適量蒸餾水中，按照F127∶F68∶HPMC （體積比） =7∶1∶1.5 比例充分混勻，4 ℃冰箱過夜，充分溶脹后即可得空白水凝膠[24]。移液槍精密量取25、50、100 μL 香芹酚分別加入到10 mL 空白水凝膠中，充分混勻，得低、中、高劑量香芹酚水凝膠。

1.4.2 水凝膠性能表征測試

采用倒置法將空白水凝膠以及載藥水凝膠置于37 ℃恒溫水浴鍋中，測定其膠凝時(shí)間；pH 計(jì)檢測各水凝膠pH 值；選用各種型號的注射器測定各水凝膠的通針性；將膠凝好的水凝膠切割為1 mm×2 mm×5 mm 小塊，經(jīng)冷凍、噴金處理后，于場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察其空間結(jié)構(gòu)。

1.4.3 傅里葉紅外光譜（Fourier transform infraredspectrum，F(xiàn)TIR） 測定

成功制備空白水凝膠及載藥水凝膠，經(jīng)冷凍干燥后研磨成粉末，與溴化鉀粉末1∶120 混合，將其進(jìn)行壓片處理，制成樣品圓片放入傅里葉變換紅外光譜儀中進(jìn)行透射率測定，實(shí)驗(yàn)對3 種樣品的掃描范圍為400～4 000 cm?1，后續(xù)進(jìn)行紅外光譜分析。

1.4.4 水凝膠藥物緩釋測定

配制體積分?jǐn)?shù)分別為0、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25 %、1.5%、1.75%、2% 的香芹酚溶液，在276 nm波長下檢測不同體積分?jǐn)?shù)香芹酚的光密度（optical density，OD） 值，得到線性回歸方程。無菌環(huán)境下取1 mL 低、中、高劑量香芹酚水凝膠分別置于盛有9 mL 40%乙醇的離心管中，一式3份，于37 ℃恒溫?fù)u床中以80 r/min 連續(xù)孵育。在0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h 時(shí)，取出1 mL 的40%乙醇作為樣本，再向管中加入等體積40%乙醇，以維持恒定的液體總體積。用酶標(biāo)儀在香芹酚最大吸收波長處測定OD值。用回歸方程計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)40%乙醇中香芹酚的含量及累積釋放率。繪制香芹酚累積釋放曲線。

1.4.5 水凝膠體外降解測定

無菌環(huán)境下取1 mL 低、中、高劑量香芹酚水凝膠分別置于盛有9 mL 40%乙醇的離心管中，一式3 份，于37 ℃恒溫?fù)u床中以80 r/min 連續(xù)孵育。在0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h 時(shí)，倒出離心管中全部液體，用濾紙擦干凈表面水分后進(jìn)行稱重，比較實(shí)驗(yàn)前后3 組水凝膠的重量損失。重量損失百分比= （培養(yǎng)前重量?培養(yǎng)后重量） /培養(yǎng)前重量×100%。

1.4.6 藥物釋放動(dòng)力學(xué)

采用Origin 2021 對各組香芹酚水凝膠體外降解和藥物釋放數(shù)據(jù)根據(jù)零級、一級和Higuchi 方程進(jìn)行擬合，用于評估藥物釋放方式。

1.4.7 細(xì)菌培養(yǎng)及水凝膠的抑菌性

將P. gingivalis 和F. nucleatum接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)2～4 d，挑取單菌落至無菌的PBS 中制作菌懸液。用麥?zhǔn)勘葷岱ù_定菌液濃度，用無菌PBS 將菌液進(jìn)行梯度稀釋，最終濃度調(diào)整為108 CFU/mL，4 ℃?zhèn)溆?。?00 μL菌液，涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上，無菌牛津杯放置于平板表面，各加入200 μL 的空白水凝膠以及低、中、高劑量香芹酚水凝膠，經(jīng)37 ℃無氧環(huán)境培養(yǎng)72 h 后觀察其抗菌結(jié)果，并采用0.02 mm游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑[31]。

1.4.8 水凝膠細(xì)胞相容性及黏附性檢測

采用CCK-8 及結(jié)晶紫染色法檢測細(xì)胞相容性及黏附性[32-33]。將一定量膠凝之前的空白水凝膠及載藥水凝膠涂覆至12 板孔1/2 的底面上，37 ℃培養(yǎng)箱凝膠0.5 h，待完全凝膠之后，每孔接種6×105的成骨貼壁細(xì)胞ros1728，5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h。一份用于添加CCK-8 試劑繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀測定OD值，計(jì)算水凝膠表面黏附的活細(xì)胞數(shù)量；另一份用于結(jié)晶紫染色，觀察水凝膠表面黏附的活細(xì)胞。

1.4.9 大鼠牙周炎模型的構(gòu)造與藥物干預(yù)

實(shí)驗(yàn)前對模型組大鼠空腹稱重，麻醉后，將其仰臥位固定大鼠于實(shí)驗(yàn)臺，探針分離雙側(cè)上頜第一磨牙形成人造牙周袋，開口器打開大鼠口腔，暴露雙側(cè)上頜磨牙，使用直徑0.2 mm的正畸鋼絲結(jié)扎雙側(cè)第一磨牙頸部，齦溝內(nèi)接種P. gingivalis和F. nucleatum混合菌液20 μL，每周2 次，同時(shí)飼喂10%的蔗糖水，誘導(dǎo)牙周炎模型形成。每周檢查結(jié)扎絲線2 次，若有松脫應(yīng)及時(shí)重新結(jié)扎。結(jié)扎時(shí)間為4 周，以牙齦紅腫、探診出血及牙周袋形成作為牙周炎主要臨床癥狀[34]。隨后挑選出75 只造模成功的大鼠，隨機(jī)分為5 組，分別為牙周炎組（periodontitis group，P 組）、空白水凝膠組（blankhydrogel group，B 組）、低劑量香芹酚水凝膠組（low dose carvacrol hydrogel group，L 組）、中劑量香芹酚水凝膠組（medium dose carvacrol hydrogelgroup，M組）、高劑量香芹酚水凝膠組（high dosecarvacrol hydrogel group，H 組），每組15 只SD大鼠。結(jié)扎4 周后去除正畸鋼絲，除對照組外，其他5 組分別在頰側(cè)和腭側(cè)牙周袋內(nèi)注射相對應(yīng)藥物50 μL，確保藥物注滿牙周袋并溢出。每周2 次，共給藥4 周。

1.4.10 牙周指標(biāo)檢測

末次藥物干預(yù)后，檢測大鼠牙周相關(guān)指標(biāo)，邀請東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科實(shí)驗(yàn)室及東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院5 名臨床經(jīng)驗(yàn)豐富教師共同參與評定。

牙齦出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）：取第一磨牙近中頰、頰側(cè)、遠(yuǎn)中頰3 個(gè)區(qū)域[35]，牙周探針沿著齦溝插入牙周袋，在3 個(gè)區(qū)域輕刮后取出， 觀察出血情況[36]， 并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[37]，0 分，牙齦健康，無炎癥及出血；1 分，牙齦輕度腫脹，色澤加深，檢查無出血；2 分，牙齦腫脹，探診時(shí)齦下有點(diǎn)狀出血；3 分，探診后有出血，沿著齦緣蔓延；4 分，探診后有出血，溢出齦溝；5 分，牙齦嚴(yán)重潰爛，有自發(fā)性出血。

牙周袋深度（pocket depth，PD）：用帶刻度的牙周探針測量3 個(gè)區(qū)域齦緣至牙周袋底部的距離，始終保持針尖緊貼牙面，并與牙長軸平行[35]。

1.4.11 牙槽骨影像學(xué)檢查

每組挑選2 只大鼠，將其上頜牙槽骨標(biāo)本進(jìn)行固定處理，隨后進(jìn)行 Micro-CT 掃描。掃描參數(shù)為：射線管電流200 μA，電壓85 kV，掃描整個(gè)物體，掃描分辨率10.153 741 μm，曝光時(shí)間384 ms，掃描角度180°。使用三維重建軟件NRecon （軟件版本V1.7.4.2，Bruker 公司，德國） 對原始圖像進(jìn)行重建，CT Analyser 分析牙槽骨吸收情況。

1.4.12 水凝膠體內(nèi)生物相容性檢測

牙周指標(biāo)測定后， 于各組大鼠心臟采血約3 mL，靜置0.5 h 后離心獲取血清，試劑盒檢測血清中CRE、ALT 和AST 的含量，驗(yàn)證各組大鼠肝腎功能是否異常，剩余血清?80 ℃保存?zhèn)溆谩ｋS后處死各組大鼠，分離獲取肝臟、腎臟、脾臟，固定于4%甲醛中，24 h 后，浸蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE） 染色，顯微鏡觀察各組臟器有無病理改變。

1.4.13 牙周組織學(xué)染色

分離大鼠上頜牙周組織，用4%甲醛固定2 h后，流水沖洗24 h，10%的EDTA脫鈣液中脫鈣8周，乙醇梯度脫水后，進(jìn)行石蠟常規(guī)包埋，厚度調(diào)至5 μm，連續(xù)切片。脫蠟、脫水處理后，進(jìn)行HE 和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acidphosphatase，TRAP） 染色，通過顯微鏡觀察、圖像收集并分析。

1.4.14 血清中骨代謝相關(guān)指標(biāo)檢測

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA） 試劑盒檢測各組大鼠血清中骨鈣素（osteocalcin，OCN）、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP） 以及TRACP5b 的水平。

1.4.15 Western blot 檢測牙齦組織中目的蛋白的表達(dá)

處死各組大鼠， 取其上頜雙側(cè)第一磨牙約1 mm牙齦組織，置于?80 ℃冰柜保存?zhèn)溆肹38]。取出一部分牙齦組織于玻璃研磨器中，按比例加入適量的高效裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF） 以及磷酸酶抑制劑，在冰盒上充分碾磨，離心取上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定，隨后加入適量的PBS及Buffer，使其濃度為3 μg/μL，100 ℃ 水浴10 min 后，樣品于?80 ℃保存。配膠，點(diǎn)樣，每孔加入7 μL樣品，經(jīng)電泳分離蛋白后，將其轉(zhuǎn)至NC膜上，封閉液封閉，一抗、二抗孵育，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL） 液顯色， 發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并保存圖片[39]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image J 軟件進(jìn)行分析，最終以目的蛋白條帶/內(nèi)參條帶灰度值來表示各目的蛋白的表達(dá)水平。

1.4.16 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reversetranscription polymerase chain reaction，qRT-PCR） 檢測牙齦組織中OPG、RANKL、RANK及炎癥因子相對表達(dá)量

TRIZOL 法提取牙齦組織RNA，超微量分光光度儀測其濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄為cDNA。以內(nèi)參GAPDH 作為對照，采用qRT-PCR 技術(shù)，檢測大鼠牙齦組織中OPG信號通路以及炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6 的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)程序設(shè)定為：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共40 個(gè)重復(fù)，在72 ℃下檢測信號[40]。每個(gè)樣本重復(fù)6 次，以各樣本Ct 值作為基礎(chǔ)，計(jì)算2?ΔΔCt值。各引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 9.5.1 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并繪制圖表。計(jì)量資料統(tǒng)一采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，使用單因子變異數(shù)對不同組間的差異進(jìn)行分析，并利用Tukey 檢驗(yàn)法對組內(nèi)的差異進(jìn)行進(jìn)一步的比較[41]。Plt;0.05 為具有顯著性差異，Plt;0.01 為具有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 溫敏型水凝膠的合成及表征結(jié)果

經(jīng)物理混合方法制得空白水凝膠以及各組香芹酚水凝膠（圖1），4 ℃狀態(tài)下空白水凝膠呈現(xiàn)清澈透明狀，各組香芹酚水凝膠呈現(xiàn)乳白色。

在37 ℃水浴條件下，空白水凝膠與各組香芹酚水凝膠的膠凝時(shí)間均為150 s，其pH 值為6.4～6.5，選用不同型號的注射針頭，將水凝膠從針管推出，順暢無阻力，說明通針性良好。場發(fā)射掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，水凝膠均具有相同的多孔結(jié)構(gòu)，且孔隙相通（圖2）。在載藥水凝膠中還可見儲存在孔隙中的香芹酚藥物（紅色圈內(nèi)），表明該水凝膠能夠很好地負(fù)載香芹酚，且有利于藥物順利進(jìn)出。

2.2 FTIR測定結(jié)果

根據(jù)被測樣品紅外光譜中吸收峰的形狀、位置和強(qiáng)度，可以得到該物質(zhì)官能團(tuán)信息。如圖3 所示，a 為香芹酚紅外光譜圖，3 200～3 664 cm?1 為OH基團(tuán)的吸收峰，3 100～2 790 cm?1為CH3基團(tuán)的吸收峰。b 為香芹酚水凝膠的紅外光譜圖，3 000～3 664 cm?1 為OH 基團(tuán)的吸收峰，與c 的空白水凝膠的紅外光譜圖極其相似，這是因?yàn)榭瞻姿z的含量遠(yuǎn)高于香芹酚，導(dǎo)致香芹酚的紅外吸收峰被遮蓋；另一方面，b 的OH 基團(tuán)的出峰位置（3 391 cm?1） 與c （3 420 cm?1） 相比出現(xiàn)右移，表明有香芹酚OH基團(tuán)的引入[42]。此外，b 與c 相比，峰的強(qiáng)度也出現(xiàn)不同的變化，這可能是因?yàn)橄闱鄯优c空白水凝膠之間相互作用，出現(xiàn)了氫鍵或者范德華力[43]。

2.3 體外藥物緩釋及水凝膠降解結(jié)果

在不同濃度香芹酚水凝膠中香芹酚的釋放均是先快后慢，在48 h 內(nèi)均能緩慢釋放藥物，且累計(jì)釋放率均可達(dá)到80%，在48 h 后，各組水凝膠的釋放率達(dá)到平臺期；水凝膠的降解也伴隨著藥物的釋放，由此可推測香芹酚是通過溶蝕機(jī)制進(jìn)行釋放的（圖4）。

2.4 藥物緩釋動(dòng)力學(xué)結(jié)果

采用Origin 2021 對香芹酚水凝膠體外降解和藥物釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。如果藥物釋放數(shù)據(jù)擬合為零級模型或一級模型，則其釋放機(jī)制主要為溶蝕機(jī)制；若擬合符合Higuchi 模型，其釋放機(jī)制則為擴(kuò)散機(jī)制[44]。由表2 可見，R2 最大的為一級模型，表明藥物釋放機(jī)制為溶蝕機(jī)制。

2.5 細(xì)菌培養(yǎng)及抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組香芹酚水凝膠對P.gingivalis、F. nucleatum 均有抑菌性，隨香芹酚濃度的增加，其抑菌圈直徑明顯增大，顯現(xiàn)出更強(qiáng)抑菌作用（圖5）。

2.6 水凝膠細(xì)胞相容性及黏附性檢測結(jié)果

采用結(jié)晶紫染色觀察各組水凝膠對細(xì)胞黏附性，結(jié)果顯示均具有良好的黏附性（圖6 左）。采用CCK-8 法檢測黏附細(xì)胞的數(shù)量，根據(jù)測得的OD值計(jì)算活細(xì)胞相對黏附率，設(shè)定空白對照組的細(xì)胞黏附率為100%。與空白對照組相比，B、L、M、H組黏附的活細(xì)胞數(shù)量均在90%以上，表明各組水凝膠對成骨細(xì)胞均具有良好的細(xì)胞相容性，且隨著藥物濃度的增加，其活細(xì)胞黏附率也呈現(xiàn)正比例增長（圖6 右）。

2.7 牙周指標(biāo)檢測結(jié)果

與C 組相比，P 組大鼠的SBI 和PD 均顯著性增加（Plt;0.01），證明牙周炎模型構(gòu)造成功。與P組相比，B 組大鼠的SBI 和PD 無明顯變化（Pgt;0.05）；L、M組大鼠的SBI 和PD均有所降低（Plt;0.05）；H 組大鼠的SBI 和PD 顯著降低（Plt;0.01）（表3）。

2.8 牙槽骨影像學(xué)檢查結(jié)果

如圖7 所示，相比于C 組，P 和B 組牙槽骨有相對明顯的吸收，第一、二磨牙牙根暴露面積顯著增多，上頜感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）的牙槽骨骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N） 和骨小梁厚度（Tb.Th） 顯著低于C組，而骨表面積/骨體積（BS/BV）、骨小梁分離度（Tb.Sp） 顯著高于C組，表明牙周炎模型構(gòu)造成功。而隨著香芹酚濃度的增加，L、M、H組大鼠牙槽骨有不同程度的再生，其中H組效果最為明顯。

2.9 水凝膠體內(nèi)生物安全性檢測結(jié)果

各組大鼠血清CRE、ALT 和AST 含量無明顯差異（圖8）；HE 染色結(jié)果顯示各組大鼠各臟器細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤（圖9）。結(jié)果均證明水凝膠對大鼠機(jī)體無毒性作用。

2.10 牙周組織學(xué)染色結(jié)果分析

HE 染色顯示P 組和B 組大鼠牙齦乳頭消失，牙齦上皮潰瘍糜爛，結(jié)合上皮向根方增殖、遷移，形成深牙周袋，牙齦固有層炎癥細(xì)胞廣泛浸潤，上皮釘突增生，牙槽骨吸收明顯，導(dǎo)致牙槽嵴頂顯著下移；L 組大鼠的HE 染色結(jié)果與B 組無明顯差別；M、H組大鼠的牙齦上皮結(jié)構(gòu)遭到破壞，但與牙周炎相比，炎性細(xì)胞浸潤顯著減少，牙槽嵴頂明顯上移。TRAP 染色結(jié)果顯示，C組沒有明顯的破骨細(xì)胞形成，P 組和B組則顯示出大量活躍的破骨細(xì)胞（黑色圓圈所示），而L、M、H 組破骨細(xì)胞依次減少（圖10）。

2.11 骨代謝相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果

P、B組大鼠血清中OCN、ALP、TRACP5b 水平與C 組相比差異極顯著（Plt;0.01），經(jīng)載藥水凝膠治療后，L、M、H組大鼠血清中破骨相關(guān)指標(biāo)TRACP5b 含量逐漸降低， 成骨相關(guān)指標(biāo)OCN、ALP 水平依次升高，其中H 組大鼠效果最為顯著（圖11）。

2.12 Western blot 結(jié)果分析

與C組相比，P 組大鼠牙齦組織中通路相關(guān)蛋白OPG 表達(dá)量顯著性降低（Plt;0.01），RANKL、RANK、p-P65、p-IKBα、p-IKKα/β 表達(dá)量均明顯增加（Plt;0.01）；與P 組相比，B 組大鼠牙齦組織中通路相關(guān)蛋白OPG、RANKL、RANK、p-P65、p-IKBα、p-IKKα/β 表達(dá)量無明顯變化（Pgt;0.05）；L 組大鼠牙齦組織通路相關(guān)蛋白OPG 表達(dá)量均有所增加（Plt;0.05），RANKL、RANK、p-P65、p-IKKα/β 蛋白表達(dá)量均降低（Plt;0.05），p-IKBα 蛋白表達(dá)量顯著性降低（Plt;0.01）；M及H組大鼠牙齦組織通路相關(guān)蛋白OPG表達(dá)量均顯著性增加（Plt;0.01）， RANKL、RANK、p-P65、p-IKBα、p-IKKα/β 蛋白表達(dá)量均顯著降低（Plt;0.01）（圖12）。

2.13 qRT-PCR結(jié)果分析

與C組相比，P 組和B組大鼠牙齦組織中信號通路關(guān)鍵因子RANKL、RANK及炎癥因子IL-1β、TNF- α、IL-6 的mRNA 表達(dá)均顯著性升高（Plt;0.01），而OPG 的mRNA 表達(dá)降低極為顯著（Plt;0.01）；與P 組相比，L組大鼠牙齦組織中RANKL、RANK、IL-1β 的mRNA表達(dá)水平均有所減少（Plt;0.05），而OPG 及炎癥因子TNF-α、IL-6 的mRNA表達(dá)沒有明顯變化（Pgt;0.05）；M、H 兩組大鼠牙齦組織中信號通路關(guān)鍵因子RANKL、RANK 的mRNA 表達(dá)均降低， 差異極為顯著（Plt;0.01），OPG mRNA表達(dá)水平有著極其顯著性的增加（Plt;0.01），其中M組大鼠牙齦組織中炎癥因子TNF-α、IL-6 的mRNA 表達(dá)僅降低（Plt;0.05），而IL-1β 的mRNA水平明顯下降（Plt;0.01）；但H組大鼠牙齦組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平均有明顯的降低（Plt;0.01）（圖13）。

3 討論

目前牙周炎的治療包括去除菌斑牙石的機(jī)械療法以及藥物治療。而藥物治療主要是使用抗生素，如甲硝唑，通過口服給藥來達(dá)到治療牙周炎的目的。但由于肝臟的首過效應(yīng)，使得藥物進(jìn)入齦溝液的濃度大幅度降低，起不到良好的治療效果。因此，為提高藥效，往往會加大藥物濃度或者增加給藥次數(shù)，但最終會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)肝腎損傷、全身性過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)。此外，過量應(yīng)用抗生素還會導(dǎo)致藥物殘留，細(xì)菌耐藥性等問題[45]。因此，當(dāng)前需要研發(fā)出一種新型的天然藥物制劑，以替代抗生素在人類牙周炎中的使用。

香芹酚作為多種天然植物的提取物，具有廣譜抗菌、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)，是近年來抗生素類藥物替代物的研究熱點(diǎn)之一[46]。Maquera-Huacho等[47]測定香芹酚對P. gingivalis 和F. nucleatum 的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）、最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC） 分別為0.007%和0.002%，表明香芹酚在抑制口腔細(xì)菌方面效果較好，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Ciandrini 等[48]通過采用MIC、MBC 和生物膜抑菌濃度（biofilm inhibitory concentration，BIC） 評價(jià)結(jié)果同樣證明了香芹酚對口腔病原體具有抑制性，并且能夠抑制細(xì)菌生物膜的形成。此外，關(guān)于香芹酚的毒性與安全性，美國食品和藥品管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA） 早已認(rèn)證了香芹酚的安全性[49]。Horváthová 等[50]的研究結(jié)果證實(shí)香芹酚不僅與細(xì)胞毒性作用和DNA損傷作用無關(guān)，而且能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的DNA損傷水平。此外，張子晗等[46]也研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚不僅對MC3T3-E1 細(xì)胞無明顯的毒性作用，而且能夠上調(diào)Runx2 和OPG 等相關(guān)成骨基因的表達(dá)，具有骨保護(hù)作用，可用于牙槽骨等骨組織的保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)通過HE 和TRAP 染色、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和骨代謝相關(guān)指標(biāo)檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了香芹酚不僅對成骨細(xì)胞無明顯毒性作用，而且可以減少破骨細(xì)胞的生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和牙槽骨的再生。

由于香芹酚分子結(jié)構(gòu)中含有大量的疏水基團(tuán)，導(dǎo)致其難溶于水，嚴(yán)重限制了香芹酚進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的吸收和利用。而泊洛沙姆特殊的三嵌段結(jié)構(gòu)，使其具有相對親油性，能夠很好地與香芹酚相溶。本研究以F127、F68、HPMC作為水凝膠的主體成分，按照F127∶F68∶HPMC （體積比） =7∶1∶1.5 比例成功制得空白水凝膠及載藥水凝膠，結(jié)果顯示，當(dāng)其處于37 ℃環(huán)境時(shí)，可在150 s 內(nèi)發(fā)生從溶液到凝膠的相轉(zhuǎn)變，形成一種黏稠的半固體狀凝膠。并進(jìn)行了FTIR、藥物緩釋和降解實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)生物相容性實(shí)驗(yàn)以及給藥后大鼠各臟器HE 染色實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果顯示，香芹酚成功負(fù)載至水凝膠，且各組香芹酚水凝膠均能夠緩慢釋放藥物，累計(jì)釋放率均可達(dá)到80%；細(xì)胞結(jié)果顯示各組載藥水凝膠對細(xì)胞均無毒性作用且具有良好的細(xì)胞黏附性；HE 染色結(jié)果顯示大鼠臟器組織細(xì)胞形態(tài)均正常，結(jié)構(gòu)清晰，且并未觀察到有炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。結(jié)果表明香芹酚水凝膠具有良好的藥物緩釋及體內(nèi)外生物相容性，可用于后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

P. gingivalis 和F. nucleatum是牙周炎患者口腔中常見的致病菌[51]，其產(chǎn)生的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 是導(dǎo)致牙周炎形成的主要毒性物質(zhì)[52]。LPS 可與Toll 樣受體結(jié)合發(fā)出信號，激活NF-κB 促炎信號通路，誘導(dǎo)牙周組織發(fā)生炎癥[53]。在RANKL 調(diào)控破骨細(xì)胞生成的OPG信號通路中，NF-κB位于其下游[54]，NF-κB的活化可以促進(jìn)炎癥因子的合成，進(jìn)而促進(jìn)RANKL 的表達(dá)[55]。RANKL是一種關(guān)鍵的骨吸收刺激因子，能夠與破骨前體細(xì)胞膜上的RANK配體結(jié)合，進(jìn)而激活TRAF6，進(jìn)一步正向促進(jìn)NF-κB信號通路活化[56]，加劇促炎因子過度釋放，進(jìn)而增強(qiáng)RANKL的產(chǎn)生，促進(jìn)破骨細(xì)胞的募集和分化，最終導(dǎo)致牙槽骨的吸收[57]。而OPG 作為一種分泌蛋白，通過與RANKL 結(jié)合進(jìn)一步防止其與RANK 結(jié)合，從而保護(hù)牙槽骨免遭過度吸收[58]。因此，調(diào)控OPG 通路以及NF-κB的表達(dá)對于牙槽骨吸收和代謝至關(guān)重要。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P 組大鼠牙周組織中RANKL、RANK、p-P65、p-IκBα、p-IKKα/β 的蛋白水平顯著升高，RANKL、RANK、TNF- α、IL-6、IL-1βmRNA水平顯著增加，牙周組織中OPG的蛋白以及mRNA 水平顯著降低。經(jīng)載藥水凝膠治療4 周后，大鼠牙周炎臨床癥狀得到改善，P 組大鼠牙周組織中RANKL、RANK、p-P65、p-IκBα、p-IKKα/β 的蛋白水平顯著降低，RANKL、RANK、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 水平大幅降低，OPG的蛋白以及mRNA 水平顯著升高，且呈現(xiàn)出劑量依賴性，隨香芹酚濃度增高而效果更顯著。該研究結(jié)果表明香芹酚可通過上調(diào)OPG 表達(dá)，下調(diào)RANKL表達(dá)，調(diào)控OPG通路以及抑制NF-κB通路激活，進(jìn)而抑制牙周炎大鼠牙槽骨吸收，改善其臨床癥狀。

綜上所述，本研究成功制備香芹酚水凝膠，且具有良好的生物相容性及藥物緩釋性能；在牙周炎的保護(hù)機(jī)制方面，香芹酚水凝膠可以通過調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG通路，抑制NF-κB的活化，阻斷炎癥因子對RANKL 的誘導(dǎo)作用，減少RAN-KL 與RANK 的結(jié)合，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化，同時(shí)提高成骨相關(guān)蛋白OPG、OCN、ALP 含量，促進(jìn)牙槽骨再生，在牙周組織再生方面具有良好的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。但藥物對牙槽骨具體的保護(hù)作用機(jī)制方面研究尚淺，后續(xù)應(yīng)從更多角度設(shè)計(jì)并開展進(jìn)一步的研究。同時(shí)，還需設(shè)計(jì)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比，以便更好地驗(yàn)證研究結(jié)果的準(zhǔn)確性與科學(xué)性。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 杜冰）