摘要：為了了解承德地區(qū)西門塔爾肉牛腹瀉大腸桿菌流行情況及對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性情況，本試驗(yàn)2022—2023年從承德地區(qū)散養(yǎng)戶和規(guī)?；?chǎng)中采集不同日齡患有腹瀉病的西門塔爾肉牛的肛拭子樣品、糞便樣品及死亡肉牛肝臟病料樣品共計(jì)172份，對(duì)采集的病料樣品進(jìn)行大腸桿菌分離鑒定，并測(cè)定分離的大腸桿菌的致病性和常用藥物的耐藥性。結(jié)果顯示，從采集172份病料組織樣品中分離得到58株致病性大腸桿菌菌株，58株致病性大腸桿菌對(duì)青霉素、磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素等7種抗生素的耐藥率在44.8%以上，對(duì)其他6種抗生素具有不同程度的耐藥性。結(jié)果表明：該地區(qū)散養(yǎng)戶和規(guī)模化牛場(chǎng)中流行的大腸桿菌分離菌株具有致病性，對(duì)臨床中常用的抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。

關(guān)鍵詞：西門塔爾肉牛；大腸桿菌；致病性；耐藥性

相關(guān)研究表明，大腸桿菌（Escherichia coli）是動(dòng)物養(yǎng)殖過程常見的致病菌之一，該菌具有多種血清型和不同的類型，可以引起牛、羊、馬、雞、鴨、豬和兔等多種動(dòng)物和人類發(fā)病，該菌感染途徑比較廣泛，如消化道、呼吸道、污染的飼料和飲水及環(huán)境等多種途徑感染均可以感染多種動(dòng)物和人，引起動(dòng)物嚴(yán)重的腹瀉、腸炎、肺炎、腹膜炎等一系列的疾病，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致動(dòng)物死亡，給動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。研究表明，近幾年來(lái)在牛、羊等動(dòng)物中致病性大腸桿菌的分離率或檢出率逐年上升，該菌不僅可以引起牛、羊動(dòng)物的消化道感染，個(gè)別菌株可以引起牛羊的肺炎，以犢牛和羔羊較易感，可以引起急性死亡，死亡率較高，危害著我國(guó)牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展[3-4]。大腸桿菌病可以導(dǎo)致多牛的急性敗血癥和慢性感染（腸炎、腹瀉），急性敗血癥可致死亡，慢性感染可致使動(dòng)物精神萎靡、食欲減退等，嚴(yán)重影響生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能[5-6]。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明，臨床中分離的不同動(dòng)物源的致病性大腸桿菌，已經(jīng)對(duì)臨床中不同種類的抗菌藥物（β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮等）產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，且呈現(xiàn)多重耐藥性，且對(duì)臨床治療帶來(lái)一定的困難[7]。因此，在臨床中治療動(dòng)物巴氏桿菌病應(yīng)該根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果正確地選擇和合理使用抗菌藥物。本試驗(yàn)從承德地區(qū)散養(yǎng)戶和規(guī)?；?chǎng)中采集患有腹瀉病的西門塔爾肉牛的病料組織樣品172份進(jìn)行大腸桿菌鑒定，并檢查其致病性和耐藥性，為該地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)中西門塔爾肉牛大腸桿菌病的防控理論支撐。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

本試驗(yàn)2022—2023年從承德地區(qū)（隆化、圍場(chǎng)）散養(yǎng)戶和規(guī)模化牛場(chǎng)中不同日齡患有腹瀉病的西門塔爾肉牛的肛拭子樣品、糞便樣品及死亡肉牛肝臟病料樣品共計(jì)172份（表1）。

1.2細(xì)菌分離和培養(yǎng)

將采集的患?。ㄋ溃┪鏖T塔爾肉牛的病料組織（肛拭子、糞便及死亡肉牛肝臟）樣品用無(wú)菌PBS進(jìn)行處理，在超凈工作臺(tái)中按照1∶100比例分別劃線接種于伊紅-亞甲藍(lán)培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)12～18 h后，挑取典型帶金屬光色單個(gè)菌落接種于鑒別培養(yǎng)基上（大腸桿菌顯色培養(yǎng)基）培養(yǎng)12～18 h后，挑取典型淺綠色單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察分離菌株的形態(tài)學(xué)。

1.3 細(xì)菌生化試驗(yàn)

對(duì)臨床分離的菌株接種營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，參照細(xì)菌生化顯色全套試劑盒說明書，對(duì)臨床中分離的每一株菌株進(jìn)行生化特性鑒定。

1.4 細(xì)菌PCR鑒定

取1.3中分離培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期分離菌株的菌液進(jìn)行編號(hào)，以水煮法提取基因組DNA為模板，參考文獻(xiàn)反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，用細(xì)菌16S rRNA通用引物（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）進(jìn)行PCR檢測(cè)[7]，取檢測(cè)陽(yáng)性的分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物送測(cè)序分析，測(cè)序分析結(jié)果，參照同源性≥97%進(jìn)行判定[7]。

1.5 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)

取1.3中培養(yǎng)菌株菌液，調(diào)整菌液濃度為107～8CFU/mL，每1株分離菌株為攻毒組，通過灌胃攻毒方法攻毒2只小鼠（0.25 mL/只），對(duì)照組2只小鼠通過同樣的方法給予等量的無(wú)菌的PBS。攻毒組和對(duì)照組的小白鼠攻毒后，觀察攻毒組和對(duì)照組的小白鼠發(fā)病和死亡情況。

1.6 藥敏試驗(yàn)

取1.3中分離培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期分離菌株的菌液（107～8CFU/mL），在無(wú)菌條件下均勻涂布在90 mm普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，貼上藥敏紙片后37 ℃條件下培養(yǎng)12～18 h后，測(cè)量抑菌圈濃度，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2013年推薦藥敏試驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果判斷，分析其耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離和培養(yǎng)

從172份病料樣品中（肛拭子、糞便死亡肉牛肝臟）分離得到菌株，在伊紅-亞甲藍(lán)培養(yǎng)基（帶金屬光色的菌落）和大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（藍(lán)色的菌落）分別長(zhǎng)出典型的菌落，革蘭氏染色可見典型的桿狀陰性菌形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，細(xì)菌生化顯色全套試劑盒判定結(jié)果與大腸桿菌的生化特性一致。通過統(tǒng)計(jì)，從172份病料組織中分離得到89株菌株，初步鑒定為大腸桿菌。

2.2 細(xì)菌PCR鑒定

以水煮法提取89株分離菌株的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示， 89株菌株均擴(kuò)增出大約為1 429 bp目的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示，89株分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)的大腸菌比，其同源性均大于98.9%，均可以判定為大腸桿菌。

2.3動(dòng)物攻毒試驗(yàn)

攻毒組的小鼠在攻毒后2～3 d出現(xiàn)不同程度的發(fā)病情況，如精神沉郁、采食量減少、扎頓和腹瀉等，個(gè)別攻毒小鼠攻毒后出現(xiàn)急性死亡。剖檢死亡的小鼠取肝臟組織分離得到大腸桿菌。致病性試驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組未見臨床癥狀和死亡情況。通過致病性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)58株可引起小鼠死亡的致病性大腸桿菌。

2.4藥敏試驗(yàn)

臨床分離菌株的藥敏試驗(yàn)顯示， 臨床分離的58株西門塔爾肉牛源致病性大腸桿菌對(duì)對(duì)青霉素、磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素等7種抗生素的耐藥率在44.8% ～100%之間；對(duì)頭孢噻呋、頭孢喹肟、恩諾沙星等6種抗菌藥耐藥率在10.3%～31.0%之間。

3 討論

大腸桿菌為危害多種動(dòng)物常見的病原菌之一，該菌具有多種血清型，廣泛存在養(yǎng)殖環(huán)境中，可以通過多種途徑（飼料、飲水、墊料等）=可以感染多種動(dòng)物、野生動(dòng)物和人類，在一定條件下該菌可以通過多種途徑在不同動(dòng)物之間及動(dòng)物與人類之間相互傳播，對(duì)人和動(dòng)物的危害較大[8]。相關(guān)研究表明，大腸桿正常情況下不會(huì)發(fā)病，當(dāng)外界環(huán)境或者有應(yīng)激因素時(shí)，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體出現(xiàn)不同程度的抵抗力下降時(shí)，可以引起牛嚴(yán)重的敗血癥、腹瀉、腸炎、脫水等一系列的臨床癥狀，甚至引起急性死亡[9]。本試驗(yàn)研究表明，從采集的172份患腹瀉病西門塔爾肉牛病料組織中分離得到58株對(duì)小鼠具有致病性的大腸桿菌菌株，說明大腸桿菌可能是西門塔爾肉牛腹瀉病的主要病原菌之一，在該地區(qū)肉牛場(chǎng)中廣泛流行，可能存在潛在的威脅，應(yīng)該注意防控。目前，由于大腸桿菌血清型眾多，且疫苗效果不理想，抗生素成為防治該病的主要措施，隨著抗生素的濫用，導(dǎo)致其嚴(yán)重耐藥性問題[10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，臨床分離=致病性大腸桿菌對(duì)常用抗生素的產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性。說明該地區(qū)分離的致病性大腸桿菌耐藥性嚴(yán)重。因此，應(yīng)該引起重視，合理使用抗菌藥物，減少耐藥性產(chǎn)生和定期對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行消毒，并進(jìn)行采取綜合性防控。本研究為該地區(qū)散養(yǎng)戶和規(guī)?；?chǎng)中西門塔爾肉牛大腸桿菌病的防控提供研究基礎(chǔ)?！?/p>

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