關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；蘋果樹腐爛病菌；抗性基因；抑菌活性成分

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）是革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界的水體、土壤、空氣、植物根系、植株表面和動物腸道等［1-3］。近年來，國內(nèi)外有關(guān)貝萊斯芽孢桿菌的研究主要集中在其拮抗病原菌、促進植物生長［4，5］、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、積累防御酶［6］及其抑菌活性物質(zhì)［7，8］等方面。作為一種新型生防細菌，貝萊斯芽孢桿菌對腐爛?。?］、炭疽?。?0］、白粉?。?1］等均能發(fā)揮生物防治作用，其菌株FZB42、83和QST713已經(jīng)實現(xiàn)商品化［12，13］。在植物與病原菌互作過程中，芽孢桿菌能誘導(dǎo)植物與抗病相關(guān)的防衛(wèi)基因的表達，使寄主表現(xiàn)出抗病性。研究發(fā)現(xiàn)植物病程相關(guān)蛋白（PRs）合成基因PR-1、PR-2、PR4等基因調(diào)控PR蛋白表達的NPR1基因、植物保衛(wèi)素合成基因PDF等，這些基因合成的抗病物質(zhì)可以阻止病原菌的進一步侵入以及病害的傳播［14］。例如植物根際促生菌（plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR）能夠通過提高這些防衛(wèi)基因表達量誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，增強植物免疫，是各種PGPR用來保護植物抵御廣泛的病原體的重要機制之一［15］。芽孢桿菌除了能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性外，還能通過直接分泌水解酶和次生代謝產(chǎn)物來抑制病原菌［16］。本研究采用的貝萊斯芽孢桿菌SY01菌株，由塔里木大學綠色防控實驗室從環(huán)塔里木盆地周邊健康的蘋果樹皮組織分離獲得，已被證明具有廣泛的抗真菌活性，其發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌也具有較強的抑制作用［17］，但其對蘋果樹抗性基因的誘導(dǎo)表達和主要抑菌活性成分還有待于進一步研究。

本研究以貝萊斯芽孢桿菌SY01為試材，采用熒光定量PCR檢測貝萊斯芽孢桿菌SY01對蘋果樹關(guān)鍵抗性基因表達量變化的影響，并對菌株SY01抗菌脂肽粗提物進行穩(wěn)定性測定；采用脂肽類抑菌成分合成基因的擴增比對和UPLCTripleTOF-MS/MS相結(jié)合，分析菌株SY01的抑菌活性成分，為揭示其誘導(dǎo)蘋果樹抗性基因表達，明確該菌株的脂肽類抑菌物質(zhì)成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）SY01和蘋果樹腐爛病菌（Valsamailvar.pyri）SW5均由塔里木大學綠色防控實驗室提供。

1.2 貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備

將活化后的貝萊斯芽孢桿菌SY01挑取單菌落接種于盛有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，36℃、200rpm培養(yǎng)24h得到種子液。按3%的接種量將種子液接種于優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基（9.8g/L蔗糖、10g/L黃豆粉、7.3g/LNaCl）為發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)離心噴霧干燥后獲得固體發(fā)酵產(chǎn)物，于研缽中研磨至粉末狀備用。

1.3 蘋果枝條抗性相關(guān)基因表達量的RT-PCR檢測

為了檢測貝萊斯芽孢桿菌SY01對蘋果樹關(guān)鍵抗性基因表達量的變化，選用MdEF-1a為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR擴增植物抗病相關(guān)基因MdPDF1、MdNPR1、MdPR1、MdPR2、MdPR4（引物序列信息見表1），檢測它們在蘋果枝條中的表達水平［14］。

選取1-2年生粗細相近的健康蘋果枝條裁剪至15cm長，置于濃度1%次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水沖洗3遍，晾干后石蠟兩端封口。使用5mm打孔器在枝條中間部位打孔進行接種試驗，將枝條水平置于鋪有潤濕濾紙的托盤上，每處理重復(fù)5次。試驗共設(shè)置3個處理，C1：接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的蘋果樹腐爛病菌SW5；C2：接種貝萊斯芽孢桿菌SY01無菌發(fā)酵濾液100μL，30min后重復(fù)接種1次；C3：清水對照。分別在接種后0h、24h、48h、72h、96h從發(fā)?。ń臃N）部位開始往上2cm采集樣品，液氮速凍，-80℃冰箱保存。

使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取樹皮總RNA，1.5%的瓊脂糖凝膠檢測RNA質(zhì)量，合格后使用FastKingcDNA合成試劑盒對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA產(chǎn)物3倍稀釋后作為模板，選MdEF1-α為內(nèi)參基因，按照擴增程序?qū)?個基因的表達水平進行測定，PCR反應(yīng)體系為：SYBRqPCRMix10μL，PrimerF/R各0.8μL，cDNA1μL，ddH2O7.4μL，總體積為20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。每反應(yīng)3個重復(fù)，由RT-PCR儀生成Ct值及其標準誤。反應(yīng)結(jié)束后分析融解曲線和熒光Ct值的變化曲線，參照相對定量的2-ΔΔCt法計算不同處理、時間點樣品目標基因?qū)?nèi)參的相對表達量。

1.4 不同有機溶劑萃取的抗菌脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌抑菌作用測定

采用生長速率法測定不同有機溶劑萃取后的抗菌脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用。以甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯為萃取溶劑，稱取30g發(fā)酵產(chǎn)物于250mL錐形瓶中，分別加入250mL不同有機溶劑進行萃取，置于超聲波清洗機中超聲5min以加速產(chǎn)物溶解，4℃靜置過夜，4000rpm離心10min，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機溶劑蒸干，定量0.01MPBS緩沖液（pH=7.2-7.4）溶解，0.22μm濾膜過濾備用，即為菌株SY01抗菌脂肽粗提物［7］。以只接種蘋果樹腐爛病菌菌餅為空白對照，每處理3次重復(fù)，28℃培養(yǎng)，待對照皿內(nèi)腐爛病菌菌絲長滿后，用十字交叉法測量處理組菌絲直徑，計算抑菌率。

1.5 菌株SY01抗菌脂肽粗提物生物學特性研究

采用生長速率法測定不同處理條件下貝萊斯芽孢桿菌抗菌脂肽粗提物的穩(wěn)定性。溫度：將抗菌脂肽粗提物分別置于不同溫度（-20℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃）下水浴加熱30min，待各處理液恢復(fù)至室溫，以未經(jīng)溫度處理的抗菌脂肽粗提物為對照，無菌水為空白對照，測定其抑菌率。自然光和紫外線：將抗菌脂肽粗提物分別置于自然光和紫外燈下，分別照射1h、3h、5h、7h、9h，以未經(jīng)自然光或紫外線燈照射處理的抗菌脂肽粗提物為對照，無菌水為空白對照，測定其抑菌率。酸堿度：將抗菌脂肽粗提物用1mol/LHCl溶液或1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH分別至1、3、5、7、9、11，4℃靜置12h后，緩慢調(diào)回各處理pH至原始數(shù)值pH=7.2，以未處理的抗菌脂肽粗提物為對照，無菌水為空白對照，測定抗菌脂肽粗提物的抑菌率。

1.6 菌株SY01抑菌活性物質(zhì)的初步分析

1.6.1 菌株SY01脂肽類抑菌物質(zhì)合成基因的擴增和比對 取出斜面保藏的菌株SY01，三區(qū)劃線法接種于LB培養(yǎng)基平板上，30℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中，36℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，取菌液1mL，10000rpm離心5min，棄上清液，用細菌DNA提取試劑盒提取菌株SY01的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用表2中的10對引物分別對貝萊斯芽孢桿菌SY01進行PCR擴增。反應(yīng)體系（20μL）：1μLDNA模板，正反引物各1μL，10μLSYBRPremixExTag，ddH2O7μL。擴增條件：95℃5min；95℃10s，60℃30s，72℃20s，共40個循環(huán)；95℃15s，60℃60s，95℃15s。

1.6.2 脂肽類粗提物的初步分析 采用UPLCTripleTOF-MS/MS鑒定甲醇有機萃取液的成分［18］。分離色譜柱型號為C18色譜柱。色譜分離條件：柱溫40℃，流速0.3mL·min-1，進樣量4μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化（ESI+）源；霧電壓（IS）5kV；噴霧氣（GS1）50psi；輔助加熱氣（GS2）50psi；輔助加熱氣溫度350℃；TOFMS掃描質(zhì)合比范圍：m/z200-400；采集模式：飛行時間全掃描質(zhì)譜和二級質(zhì)譜（TOFMSIDAMS-MS）模式；TOFMS觸發(fā)二級掃描范圍：m/z500-2000；去簇電壓（DP）100V；MS-MS碰撞能量（CE）Rollingcollisionenergy。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin2022制圖，SPSS27.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測

將提取的總RNA進行質(zhì)量與含量的檢測，其RNA濃度均較高，并且A260/280值均在1.8-2.1之間，將濃度、純度合格的RNA使用1.5％瓊脂糖凝膠進行檢測，電泳圖結(jié)果顯示28s和18s條帶清晰完整（圖１），可用于后續(xù)試驗。

2.2 蘋果抗性相關(guān)基因的熒光定量PCR分析

如圖2所示，5種蘋果樹抗性相關(guān)基因表達量在貝萊斯芽孢桿菌SY01和蘋果樹腐爛病菌SW5的誘導(dǎo)下，除MdPR1基因外，其余4種抗性基因均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且SY01的誘導(dǎo)表達量大于SW5。不同抗性基因誘導(dǎo)表達的峰值時間存在差異，MdNPR1、MdPDF1、MdPR2、MdPR4分別在24、72、72和48h達到峰值，而MdPR1在0-96h呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)的趨勢。

2.3 抗菌脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果

由圖3可知，3種有機溶劑萃取菌株SY01發(fā)

酵產(chǎn)物后的抗菌脂肽粗提物均對蘋果樹腐爛病菌具有一定抑菌效果，其中以甲醇為有機溶劑的抗菌脂肽粗提物抑菌效果最好，抑菌率達到72.16%，其次為二氯甲烷，二者無顯著性差異，乙酸乙酯的抑制效果最差，與其它處理存在顯著性差異（Plt;0.05）。

2.4 菌株SY01萃取液中抑菌活性物質(zhì)生物學特性研究

以甲醇為有機溶劑對菌株SY01發(fā)酵產(chǎn)物萃取后的抗菌脂肽粗提物進行生物學特性研究（見圖4）。由圖4A可知，菌株SY01抗菌脂肽粗提物最適溫度范圍為20～40℃，當溫度在20℃時，抑菌活性最大，隨后呈下降的趨勢，當溫度達到100℃時，抑菌率為0%。由圖4B和4C可知，在沒有自然光和紫外線的照射下，菌株SY01抗菌脂肽粗提物抑菌率最大，且隨著自然光和紫外線照射時間的延長，抑菌活性逐漸減小，當照射時間的延長至11h時，其抑菌率最小。由圖4D可知，菌株SY01抗菌脂肽粗提物在pH為7時，對蘋果樹腐爛病菌的抑菌率最高，為70%，其次為pH為5和9，兩者之間無顯著差異（Plt;0.05）。

2.5 菌株SY01脂肽類抑菌活性物質(zhì)鑒定

2.5.1 菌株SY01脂肽類抑菌活性物質(zhì)合成基因的擴增和比對 菌株SY01脂肽類抑菌活性物質(zhì)合成基因的擴增和比對結(jié)果顯示（表3），在其基因組中能檢測到ItuA、ItuB、ItuC、ItuD、SrfA、SrfAB、FenD、yndJ、ysnE這9種與抑菌活性物質(zhì)合成相關(guān)的基因，由此初步推斷出菌株SY01可通過產(chǎn)生Iturin、Surfactin、Fengycin等抗菌次級代謝產(chǎn)物抑制菌株SW5的生長。

2.5.2 菌株SY01脂肽類抑菌活性物質(zhì)分析 將菌株SY01發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)甲醇萃取后的有機萃取液進行MALDI-TOF-MS測定［19］，對其結(jié)果初步分析（表4），發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1029.1963、1043.2271、1057.2953、1071.3290、1085.1463，分子量相差14Da，即一個亞甲基CH2的同系物系列，推測為IturinA（C13-C17）；質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1030.1928、1044.2222、1058.2528、1072.3083、1086.3240，推測為IturinB（C13-C17）；質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1043.2271、1057.2953、1071.3290、1085.1463，推測為Mycosubtilin（C14-C17）；質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1031.1937、1045.2054、1059.2909、1073.3088，推測為BacillomycinD（C14-C17）；質(zhì)譜峰［M+H+］質(zhì)荷比為1057.2953、1071.3290、1085.1463，推測為BacillomycinF（C14-C17）；質(zhì)譜峰［M+Na+］質(zhì)荷比為1043.2271、1057.2953、1071.3290、1085.1463，推測為BacillomycinL（C14-C17）；質(zhì)譜峰［M+Na+］質(zhì)荷比為1030.1928、1044.2058、1058.2928、1072.3083，推測為SurfactinA（C13-C16）或SurfactinB（C14-C16）或SurfactinC（C13-C16）；質(zhì)譜峰［M+Na+］質(zhì)荷比為1457.4104，推測為C14FengycinA；［M+H+］質(zhì)荷比為1449.3798，推測為C15FengycinA，［M+H+］質(zhì)荷比為1519.4116，推測為C18FengycinB。通過離子響應(yīng)強度發(fā)現(xiàn)，抑菌活性物質(zhì)中的Fengycin含量較少，Iturin和Surfactin含量相對較多。

3 討論

研究顯示芽孢桿菌可以通過提高植物的防御酶活性，誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（PR蛋白）的產(chǎn)生，造成細胞程序性死亡、胼胝質(zhì)沉積、活性氧爆發(fā)等機制來保護植物免受病原菌的侵害［20］。MdPR1參與調(diào)控水楊酸（SA）和乙烯（ET）信號通路，MdPR2和MdPR4具有β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性；MdPDF1和MdPDF2參與合成植物保衛(wèi)素，進行自身防御反應(yīng)；MdNPR1基因參與調(diào)控PR蛋白表達，這些基因合成的抗病物質(zhì)可以阻止病原菌的進一步侵入以及病害的傳播［14］。本研究采用熒光定量PCR驗證貝萊斯芽孢桿菌SY01和蘋果樹腐爛病菌SW5對蘋果樹抗性相關(guān)基因誘導(dǎo)的可持續(xù)性，結(jié)果表明與接種SW5的枝條相比，經(jīng)菌株SY01處理后，MdPDF1、MdNPR1、MdPR1、MdPR2、MdPR4這5個基因的表達顯著上調(diào)。蘋果樹腐爛病菌雖然能夠在入侵初期誘導(dǎo)寄主抗性相關(guān)基因的表達，但隨其持續(xù)的侵染，寄主抗性相關(guān)基因被抑制表達，而貝萊斯芽孢桿菌SY01可以持續(xù)誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的表達來抵抗病原微生物的侵襲。陳作［21］等的研究結(jié)果顯示經(jīng)貝萊斯芽孢桿菌ZW10-af處理后，OsPR1a、OsLYP6、OsPR5等參與水楊酸通路相關(guān)防御基因表達量上調(diào)，有助于增強宿主對病原菌的抗性。

生防菌具有良好的穩(wěn)定性是其開發(fā)為生物制劑并被推廣使用的必備條件之一［22］。采用生長速率法對菌株SY01抗菌脂肽粗提物進行穩(wěn)定性測定，結(jié)果表明以甲醇為有機溶劑萃取的抗菌脂肽粗提物在-20℃到60℃范圍內(nèi)有較好熱穩(wěn)定性，以及自然光和紫外線穩(wěn)定性；適宜pH值為5-9，當pH為強酸強堿時，活性物質(zhì)抑菌率顯著下降。婁向弟［23］等通過抑菌試驗對貝萊斯芽孢桿菌PJP10的抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性進行測定，發(fā)現(xiàn)菌株在85℃以內(nèi)具有良好的熱穩(wěn)定性，趙欣［24］等的研究結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌HRH317對自然光和紫外線不敏感；趙雅［25］等發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌HN-Q-8不耐強酸強堿，最適pH為4.0-10.0。

貝萊斯芽孢桿菌主要通過合成次級代謝產(chǎn)物包括細菌素、抑菌蛋白、脂肽類物質(zhì)和聚酮化合物等實現(xiàn)對病原菌的抑制作用［26］。近年來，隨著對芽孢桿菌脂肽合成基因的深入研究，設(shè)計出了多對特異引物以通過PCR方法檢測菌株是否具有合成脂肽的基因［27］。不同芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)有所不同，為明確其主要抑菌活性成分，更好的利用菌株SY01發(fā)酵液中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，通過UPLC-TripleTOF-MS/MS在甲醇萃取有機相中檢測到多種抑菌活性物質(zhì)，其中豐度最高的是伊枯草菌素和表面活性素。合成基因的擴增和比對與UPLC-TripleTOF-MS/MS推測結(jié)果一致，均表明菌株SY01可通過產(chǎn)生伊枯草菌素、表面活性素、豐原素等抗菌次級代謝產(chǎn)物抑制菌株SW5的生長。本實驗室前期對菌株SY01基因組進行預(yù)測，菌株中含有表面活性素（surfactin）、大環(huán)內(nèi)酯（macrolactin）、桿菌烯（bacillaene）、豐原素（fengycin）、地非西丁（difficidin）、桿菌巴塞素（bacillibactin）、溶桿菌素（bacilysin）、丁苷菌素（butirosin）、萜類（terpenes）和羊毛硫肽類化合物（lantipeptide）等次級代謝產(chǎn)物［17］。申云鑫［28］等發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌SH-1471具有srfA、fenB、ituA、ituD、bymA等抗生素合成基因；張曉云［29］通過UPLC-TripleTOF-MS/MS證明貝萊斯芽孢桿菌HMB28521菌株可以產(chǎn)生伊枯草菌素（iturin）、豐產(chǎn)素（fengycin）和表面活性素（surfactin），抑菌試驗證明iturin和fengycin是該菌株產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)，二者能夠顯著抑制多主棒孢霉的生長，并且造成菌絲畸形。

4 結(jié)論

本研究對貝萊斯芽孢桿菌SY01誘導(dǎo)寄主抗性機理和抑菌活性物質(zhì)進行初步分析，結(jié)果表明蘋果樹腐爛病菌SW5雖然能夠在入侵初期誘導(dǎo)寄主抗性基因的表達，但隨著其持續(xù)的侵染，寄主抗性基因被抑制表達，而貝萊斯芽孢桿菌SY01可以持續(xù)誘導(dǎo)蘋果樹抗性相關(guān)基因的表達；抑菌活性物質(zhì)的最佳萃取溶劑為甲醇；以甲醇為有機溶劑萃取的抗菌脂肽粗提物在-20℃到60℃范圍內(nèi)有較好熱穩(wěn)定性，以及自然光和紫外線穩(wěn)定性；適宜pH值為5-9，不耐強酸和強堿；脂肽類抑菌物質(zhì)合成基因的擴增和比對與UPLC-TripleTOF-MS/MS的推測結(jié)果一致，均表明菌株SY01可通過產(chǎn)生Iturin、Surfactin、Fengycin等抗菌次級代謝產(chǎn)物抑制蘋果樹腐爛病菌SW5的生長，為揭示其誘導(dǎo)蘋果樹抗性基因表達、明確該菌株脂肽類抑菌物質(zhì)成分提供了理論依據(jù)。