關(guān)鍵詞：梨火疫病菌；庫爾勒香梨；疫木枝條；白星花金龜；腐解菌；資源化利用

中圖分類號：S436.612.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）10-2393-08 doi：10.11654/jaes.2024-0454

梨在我國是僅次于柑橘與蘋果的第三大栽培水果[1]，庫爾勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yu）是新疆地區(qū)的特色林果作物，多年來產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)民增收發(fā)揮了重要作用[2]。2023年庫爾勒市香梨種植面積為2.75萬hm2，產(chǎn)量達(dá)30萬t。然而，近年來梨火疫病[3]已成為制約庫爾勒香梨產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展的突出問題。梨火疫病是重大檢疫性病害，由全球十大植物病原細(xì)菌之一的解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）侵染導(dǎo)致，其侵染過程較為復(fù)雜[4]，傳播迅速且寄主廣泛[5]，造成梨樹枝條變黑枯萎，嚴(yán)重感染造成整個樹體死亡。同時，染疫死樹及修剪的病枝是重要的病菌攜帶者和傳染源，造成疫病的進(jìn)一步傳播。目前，國內(nèi)外梨火疫病防治一般采用春雷霉素、噻霉酮、春雷·噻唑鋅等防治，或?qū)σ吣局l進(jìn)行集中燒毀處理[6]。長時間使用化學(xué)農(nóng)藥存在產(chǎn)生抗性菌株的風(fēng)險；疫木枝干焚燒會污染大氣環(huán)境，近年來受到生態(tài)環(huán)境部門的管控。因此，尋找更加環(huán)保、有效的疫木廢棄物處理方式迫在眉睫[7]。

近年來，通過昆蟲的生物轉(zhuǎn)化將農(nóng)林廢棄物進(jìn)行無害化處理和資源化利用，為解決上述難題提供了新的技術(shù)路徑。白星花金龜（Protaetia brevitarsis）在自然界中主要取食腐敗的秸稈、雜草以及畜禽排泄物等物質(zhì)[8]，多年來關(guān)于白星花金龜?shù)难芯恐攸c圍繞其生物學(xué)特征、蟲害發(fā)生規(guī)律及防治等方面[9-11]，因為對生態(tài)環(huán)境保護(hù)的要求及白星花金龜特殊的生物學(xué)特性，白星花金龜逐漸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)廢棄物生物轉(zhuǎn)化。多項研究證實，在微生物腐解后，白星花金龜幼蟲能將富含纖維的秸稈類物料高效地轉(zhuǎn)化成高蛋白的昆蟲蟲體及富含腐殖質(zhì)與養(yǎng)分的蟲砂[12-15]；Zhang等[16]的研究指出，白星花金龜可以有效轉(zhuǎn)化發(fā)酵后的棉稈和棉纖維等有機(jī)物料；楊誠等[17]的研究表明，玉米秸稈發(fā)酵處理25 d 后，白星花金龜幼蟲對其轉(zhuǎn)化率可達(dá)63.82%±30.90%，利用率為17.51%±8.50%。

目前，有關(guān)白星花金龜生物轉(zhuǎn)化梨火疫病疫木的研究尚未見報道。因此，本試驗通過篩選高效腐解菌酵化香梨疫木枝條廢棄物，探析微生物與白星花金龜幼蟲聯(lián)合對香梨疫木枝條轉(zhuǎn)化的影響，以期在有效控制梨火疫病傳播源的同時高效利用香梨疫木枝條，破解香梨疫木枝條無害化處理的難題，為實現(xiàn)林果疫木無害化處理及資源化利用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試香梨疫木枝條采自新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，供試牛糞取自巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研究基地周邊養(yǎng)殖戶，供試腐解菌劑經(jīng)篩選后，試驗所用菌劑如表1所示。

1.2 試驗處理

1.2.1 腐解菌發(fā)酵試驗

將香梨疫木枝條粉碎。采用三因素五水平正交試驗設(shè)計，3個因素為腐解菌劑種類、牛糞添加比例、酵化時間，每個因素設(shè)置5個水平。腐解菌劑種類設(shè)置LK、LL、RW、VT、EM 5個水平，牛糞添加比例設(shè)置10%、20%、30%、40%、50% 5 個水平，酵化時間設(shè)置10、15、20、25 d 和30 d 5 個水平，將其按正交表L₂₅（5⁶）安排設(shè)計（表2）；不添加腐解菌劑和牛糞，酵化時間分別為0、10、15、20、25、30 d作為對照處理。

各處理物料干質(zhì)量總量為120 kg，將物料含水量調(diào)節(jié)至65%±5%，按照表1中的量添加腐解菌劑；用鐵鍬進(jìn)行翻堆、充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，裝入塑料袋包裹后扎滿孔，好氧發(fā)酵（堆體高度70 cm），發(fā)酵過程中每天測量堆體溫度，測量位置為堆體表面中心垂直下方30 cm處；發(fā)酵過程中每5 d翻堆一次，翻堆至第25天后靜置，在第30 天采用5點取樣法取垂直堆體表面下方20～30 cm處濕樣3 kg備用。

1.2.2 白星花金龜轉(zhuǎn)化發(fā)酵產(chǎn)物效率評價試驗

以白星花金龜3齡幼蟲（3齡期15日齡）作為供試蟲源，塑料盒（38 cm×50 cm×14 cm）作為養(yǎng)殖盒，每個養(yǎng)殖盒放20頭3齡幼蟲，測定幼蟲質(zhì)量，每個處理取鮮物料500 g，開展連續(xù)12 d的轉(zhuǎn)化試驗，各處理均重復(fù)5次，每隔3 d觀察每個處理的物料狀態(tài)并拍照。在第13 天將香梨枝條上層混合物取出，隨后將下層的物料過分離篩（38 cm×50 cm×13.5 cm，底孔徑1.0cm×0.8 cm，側(cè)孔徑0.8 cm×0.8 cm），篩出蟲砂和渣土；然后將取出的上層枝條放入分離篩上的剩余混合殘留物中，活的幼蟲蟲體自行鉆入剩余混合殘留物中；隨后取出香梨枝條混合物，用分離篩篩出剩余混合物中的幼蟲，測定幼蟲數(shù)量及蟲體質(zhì)量；用烘箱烘干混合物及蟲砂后進(jìn)行人工篩分，測定各個處理的香梨枝條質(zhì)量、蟲砂量、渣土量，計算蟲體取食量、蟲體質(zhì)量增量、蟲體轉(zhuǎn)化率、蟲砂轉(zhuǎn)化率、蟲砂收獲系數(shù)、有機(jī)物料量（質(zhì)量均以干質(zhì)量計，g），并檢測幼蟲腸道、體表及蟲砂是否帶有梨火疫病菌，通過綜合比較幼蟲轉(zhuǎn)化力數(shù)據(jù)篩選最優(yōu)技術(shù)參數(shù)。

蟲體質(zhì)量增量=取食后蟲體質(zhì)量-初始蟲體質(zhì)量

取食量=取食前總干質(zhì)量-香梨枝條質(zhì)量-殘渣質(zhì)量

蟲體轉(zhuǎn)化率=蟲體質(zhì)量增量（/ 取食量-蟲砂質(zhì)量）×100%

蟲砂收獲系數(shù)=蟲砂質(zhì)量/總干質(zhì)量

飼料利用率=（總飼料量-剩余飼料量）/總飼料量×100%

蟲砂轉(zhuǎn)化率=蟲砂量（/ 取食量-蟲體質(zhì)量增量）×100%

1.3 梨火疫病菌RPA-LFD檢測

腐解菌發(fā)酵試驗后，采用安普未來生物科技有限公司的DNA 恒溫快速擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行梨火疫病菌RPA-LFD檢測，主要步驟如下：

（1）樣品準(zhǔn)備

取各處理樣品200～300 mg放入裝有500 μL無菌去離子水的滅菌離心管中，利用無菌玻棒搗碎，然后靜置3～5 min備用；以未發(fā)病的香梨枝條為陰性對照，以梨火疫病菌懸浮液（OD600約為0.02）作為陽性對照。

（2）RPA擴(kuò)增

將儲存于冷藏盒內(nèi)的試劑盒所需組分振蕩3～5下，放置在離心管板架上。依次向每個干粉反應(yīng)管中加入不同發(fā)酵時間對照的試劑A buffer、上游引物（10 μmol·L^-1）、下游引物（10 μmol·L^-1）、探針（10μmol·L^-1）和ddH₂O。分別將上述各樣品浸出液2 μL加入反應(yīng)管。向每個反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)加入2.5 μLB buffer，上下顛倒甩動反應(yīng)管8～10次，充分混勻。將混勻后的反應(yīng)液快速離心至反應(yīng)管底部，立即放入金屬浴39 ℃孵育15 min，將反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物于冰上靜置3 min。以梨火疫病菌的基因組DNA 為陽性對照，以無菌去離子水作為陰性對照。梨火疫病菌RPA反應(yīng)體系如表3所示。

（3）LFD檢測

取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入到190 μL無菌去離子水中，混勻后插入側(cè)流層析試紙條（沃伯博生物有限公司），浸泡3 min。

（4）Zeller培養(yǎng)基平板計數(shù)

將檢測為陽性的樣品取含香梨枝條10 g，用玻璃珠鋪滿500 mL錐形瓶的底部，加入100 mL 0.1%吐溫80無菌水振蕩30 min，每個處理分別稀釋至10⁴倍，每個梯度4個重復(fù)，取各樣品100 μL在Zeller改良培養(yǎng)基[18]上涂板，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，菌落計數(shù)，計算帶菌量。

每克樣品中菌落形成單位=同一稀釋度3次重復(fù)的平均數(shù)×10n×10，n 為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 23.0軟件對正交結(jié)果進(jìn)行有重復(fù)觀察值無交互作用的三因素五水平方差分析。對CK組和3個因素分別進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），并利用Tukey 多重比較分析法（Plt;0.05）評估不同處理之間的差異。采用Microsoft Excel 2013 軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐解菌添加對發(fā)酵過程中堆體溫度的影響

整體來看，試驗過程中添加腐解菌劑和不同比例牛糞可以提高物料發(fā)酵溫度，各處理溫度均呈現(xiàn)先急速上升、后隨著翻堆呈現(xiàn)波動性下降的趨勢，各處理堆體溫度均高于同一天的平均氣溫，均超過55 ℃并維持3 d以上（表4）。

1 d后，添加RW菌劑和VT菌劑的物料發(fā)酵溫度顯著低于添加EM菌劑的物料發(fā)酵溫度。以每隔5 d為一個發(fā)酵周期，腐解菌劑對物料發(fā)酵溫度的影響并未達(dá)到顯著差異的水平，整體趨勢比較平緩。前15 d以EM腐解菌劑溫度最高。LK腐解菌劑前期溫度較低，15 d 以后溫度逐漸升高，20～30 d 時均為最高。RW腐解菌劑持續(xù)保持最低溫度狀態(tài)。CK組前期溫度較高，后期溫度逐漸降低。對于牛糞添加比例，前10 d溫度最高的牛糞配比為20%，溫度較低的牛糞配比為50%，15 d以后所見趨勢相反。

2.2 發(fā)酵對梨火疫病菌的影響

采用RPA-LFD方法對梨火疫病菌進(jìn)行檢測，發(fā)酵前香梨疫木枝條平均帶菌量為5.2×10⁶ cfu·g^-1，經(jīng)過發(fā)酵后，在各處理中均未檢測出梨火疫病菌。在發(fā)酵過程中，各發(fā)酵堆的溫度均達(dá)到55 ℃且能維持3d，持續(xù)高溫可將香梨疫木枝條中所攜帶的梨火疫病病菌殺死，這與前人測定的梨火疫病病菌在45 ℃下處理10 min可使其完全致死的結(jié)果一致。同時，白星花金龜幼蟲轉(zhuǎn)化后其腸道、體表及蟲砂中也均未檢測出梨火疫病菌?？梢?，攜帶梨火疫病菌的香梨枝條發(fā)酵后再經(jīng)過白星花金龜3齡幼蟲過腹轉(zhuǎn)化后進(jìn)行還田已無傳播梨火疫病病菌的風(fēng)險。該方法有利于解決新疆地區(qū)庫爾勒香梨疫木枝條傳播病菌、處理困難的問題，為香梨疫木枝條的綠色資源化回收利用提供了可行性方案。

2.3 白星花金龜轉(zhuǎn)化香梨枝條混合物物料形態(tài)變化

香梨疫木枝條生物轉(zhuǎn)化過程見圖1。將堆放到田間的疫木枝條粉碎后添加不同比例的牛糞、不同種類的腐解菌劑，在不同發(fā)酵時間發(fā)酵后，經(jīng)白星花金龜幼蟲過腹轉(zhuǎn)化，可產(chǎn)生富含豐富養(yǎng)分的蟲砂及高蛋白的蟲體。在物料轉(zhuǎn)化第3天時，各處理物料均呈現(xiàn)初始混合態(tài)，且各個處理間尚未出現(xiàn)明顯差異。轉(zhuǎn)化到第6天時，香梨枝條已呈現(xiàn)被進(jìn)食痕跡，下方已出現(xiàn)少量蟲砂。轉(zhuǎn)化試驗至第9 天時，大量雜質(zhì)浮上物料頂部，形成明顯的分層現(xiàn)象。第12天取食結(jié)束時，蟲砂呈現(xiàn)出高純度狀態(tài)，下層蟲砂與上層雜質(zhì)之間出現(xiàn)明顯分層。從整體物料形態(tài)觀察可見，菌蟲復(fù)合技術(shù)對香梨枝條轉(zhuǎn)化具有直觀影響。

2.4 三因素對白星花金龜轉(zhuǎn)化香梨枝條的影響

由表5可知，在腐解菌劑對白星花金龜3齡幼蟲轉(zhuǎn)化影響方面，LK菌劑處理白星花金龜幼蟲的取食量、質(zhì)量增量、蟲砂量和蟲砂轉(zhuǎn)化率、物料利用率及蟲體轉(zhuǎn)化率均顯著高于其他菌劑；LL菌劑表現(xiàn)良好，除LK 菌劑外，LL菌劑處理白星花金龜幼蟲質(zhì)量增量、蟲體轉(zhuǎn)化率均顯著高于其他菌劑。在牛糞添加比例對白星花金龜3齡幼蟲轉(zhuǎn)化影響方面，牛糞添加比例為40%時，幼蟲取食量、質(zhì)量增量、蟲砂量、蟲砂轉(zhuǎn)化率、物料利用率、蟲體轉(zhuǎn)化率均顯著高于牛糞其他添加比例；牛糞添加比例介于30%～50%時，蟲砂量、取食量、物料利用率顯著增加。在酵化時間對白星花金龜3齡幼蟲轉(zhuǎn)化率影響方面，酵化25 d時幼蟲質(zhì)量增量、蟲體轉(zhuǎn)化率、蟲砂轉(zhuǎn)化率和蟲砂量均顯著增加；取食量、物料利用率為酵化30 d最佳，但與酵化25 d時差異不顯著；綜合比較各項指標(biāo)，酵化時間以25 d為最佳。

在不同篩選指標(biāo)下，明確菌劑、牛糞添加比例和酵化時間的最優(yōu)組合。以取食量為篩選指標(biāo)，LK菌劑、牛糞添加配比40%和酵化30 d為最優(yōu)組合；以蟲砂量為篩選指標(biāo)，LK菌劑、牛糞添加配比40%和酵化25 d為最優(yōu)組合；以質(zhì)量增量為篩選指標(biāo)，LK菌劑、牛糞添加配比40% 和酵化25 d為最優(yōu)組合；以蟲砂轉(zhuǎn)化率為篩選指標(biāo)，LK菌劑、牛糞添加比例40%和酵化25 d為最優(yōu)組合；以蟲體轉(zhuǎn)化率為篩選指標(biāo)，LK菌劑、牛糞添加比例40%和酵化25 d為最優(yōu)組合；以物料利用率為篩選指標(biāo)，LK菌劑、牛糞添加比例40%和酵化30 d為最優(yōu)組合。綜合各項指標(biāo)分析，同時考慮盡可能減少牛糞添加比例、酵化時間及物料處理成本，LK菌劑、牛糞添加比例40%和酵化25 d為三因素最佳組合。

由表6可知，白星花金龜3齡幼蟲對不同發(fā)酵時間下香梨枝條的轉(zhuǎn)化率差異顯著。酵化25 d后，幼蟲在取食量、蟲砂量、質(zhì)量增量、飼料利用率及蟲體轉(zhuǎn)化率等指標(biāo)上均顯著高于其他處理，蟲砂轉(zhuǎn)化率在發(fā)酵25 d和30 d時差異并不顯著，綜合對比各項指標(biāo)，發(fā)酵25 d為香梨枝條最佳發(fā)酵時間。

3 討論

根據(jù)《糞便無害化衛(wèi)生要求》（GB 7959—2012），連續(xù)3 d最高堆肥堆溫達(dá)到55 ℃以上，可殺死堆體內(nèi)大部分病原體。本試驗采用腐解菌+牛糞+白星花金龜幼蟲聯(lián)合生物轉(zhuǎn)化香梨枝條廢棄物，酵化后各處理均未檢測出梨火疫病菌，符合無害化要求。添加一定量外源菌劑在堆肥中，可加快堆體溫度升高，促進(jìn)有機(jī)物分解，延長高溫持續(xù)時間[19]。喬如陸等[20]發(fā)現(xiàn)，在堆肥中添加外源菌劑可加速堆肥升溫速度。何宙陽等[21]的研究也證實，添加復(fù)合菌劑能夠有效提高堆肥溫度、縮短堆肥周期、提高腐熟度。在本試驗的酵化香梨枝條+混合物試驗過程中，添加5種腐解菌劑的處理均表現(xiàn)為3 d發(fā)酵溫度超過55 ℃，這一結(jié)果證實了前人的研究結(jié)論。發(fā)酵溫度高低可以反映出腐解菌等微生物活動的強(qiáng)弱，在本試驗從酵化第25天開始，物料發(fā)酵溫度開始逐漸下降，酵化活動減少，物料發(fā)酵隨著時間的推移基本完成。Bernal 等[22]的研究也證實，微生物代謝活動隨著堆體中可降解物質(zhì)的消耗而逐漸減弱，同時發(fā)酵堆溫度也逐漸下降。

將農(nóng)業(yè)廢物轉(zhuǎn)化為可食用蛋白質(zhì)的人工飼養(yǎng)昆蟲已被部分學(xué)者認(rèn)可[23]，白星花金龜幼蟲的蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低，是優(yōu)質(zhì)的新型可持續(xù)蛋白質(zhì)[24]。田小燕等[25]對玉米秸稈進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，在酵化預(yù)處理下，白星花金龜幼蟲可以將有機(jī)物料高效轉(zhuǎn)化為高價值的昆蟲蟲體。楊誠等[17]的研究表明，白星花金龜?shù)挠紫x能夠較好地轉(zhuǎn)化玉米秸稈，經(jīng)過25 d的發(fā)酵后，白星花金龜對玉米秸稈的轉(zhuǎn)化效率達(dá)63.82%，飼料利用率為17.51%，將牛糞添加到秸稈中能夠明顯提升白星花金龜幼蟲的取食效率。白星花金龜具有繁殖力強(qiáng)、易飼養(yǎng)及幼蟲食腐性等特征，在轉(zhuǎn)化農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物方面發(fā)揮了重要作用。本試驗通過物理方法將香梨疫木枝條粉碎后，通過添加菌劑和一定比例的牛糞，顯著改善了白星花金龜幼蟲取食效果。其中，以添加LK菌劑、牛糞添加40%、發(fā)酵25 d為最佳蟲菌復(fù)合生物轉(zhuǎn)化梨火疫病疫木參數(shù)，且各處理蟲砂中均未檢測到梨火疫病菌，該方法不僅高效轉(zhuǎn)化了梨樹疫木枝條，而且阻斷了病菌的進(jìn)一步傳播擴(kuò)散。張廣杰[12]的研究也證實，對棉花黃萎病帶菌棉稈和根茬飼料進(jìn)行酵化5 d以上，經(jīng)過白星花金龜轉(zhuǎn)化后蟲砂中未檢測出棉花黃萎病微菌核，酵化棉稈對白星花金龜幼蟲的質(zhì)量累計增加量影響顯著；酵化25 d后，白星花金龜幼蟲每取食飼料100 g可轉(zhuǎn)化3齡蟲體3.06g，產(chǎn)生蟲糞70.92 g。同時，白星花金龜3齡幼蟲干物質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂肪和氨基酸總量分別為49.90%、15.42%和38.90%，可作為高蛋白源用于畜禽以及特種經(jīng)濟(jì)動物飼喂[26]。

4 結(jié)論

（1）在牛糞香梨枝條和菌劑混合物料發(fā)酵過程中，各處理發(fā)酵溫度均高于同天平均氣溫，其中EM菌劑腐解效果最好，LK菌劑次之。各處理中均未檢測到梨火疫病菌，表明酵化過程中的高溫有助于去除梨火疫病菌。

（2）在白星花金龜取食試驗中，白星花金龜3齡幼蟲在發(fā)酵物料中均能正常生長，經(jīng)白星花金龜過腹轉(zhuǎn)化12 d 后，幼蟲質(zhì)量增量最高可達(dá)8.38 g，蟲砂量最高可達(dá)83.55 g，蟲砂轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)94.26%。綜合考慮減少牛糞添加比例、酵化時間及物料處理成本，白星花金龜幼蟲最佳取食組合方案為LK菌劑、添加40%的牛糞及酵化25 d，且白星花金龜轉(zhuǎn)化產(chǎn)物蟲體和蟲砂中均未檢測出梨火疫病菌。

（3）蟲菌復(fù)合技術(shù)在實現(xiàn)香梨疫木枝條資源化利用的同時，從根源上阻斷了疫木枝條傳播梨火疫病菌的途徑，達(dá)到了綠色環(huán)保、生態(tài)循環(huán)的效果。