摘要：梔子苷是藥食同源中藥梔子的主要有效成分，因具有抗炎、抗菌、降血糖、抗抑郁、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理活性而備受關(guān)注。然而，梔子苷在結(jié)腸癌（Colon cancer， CRC）細(xì)胞中的靶點(diǎn)和作用機(jī)制尚不明確。本文主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行梔子苷與CRC共同靶點(diǎn)的篩選，構(gòu)建梔子苷與CRC的靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，采用R語(yǔ)言包進(jìn)行生物功能（Gene Ontology， GO）和通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析，發(fā)現(xiàn)梔子苷發(fā)揮抗CRC作用與腫瘤細(xì)胞衰老密切相關(guān)。采用藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性（Drug affinity responsive target stability，DARTS）聯(lián)合質(zhì)譜探究梔子苷調(diào)控CRC細(xì)胞衰老的潛在作用靶點(diǎn)，并通過分子對(duì)接預(yù)測(cè)梔子苷與靶蛋白的具體結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)梔子苷能夠通過靶向結(jié)合脯氨酸異構(gòu)酶1A（FKBP prolyl isomerase 1A， FKBP1A）發(fā)揮抗CRC的作用。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)梔子苷可以顯著誘導(dǎo)CRC細(xì)胞衰老。研究結(jié)果表明梔子苷可能通過靶向結(jié)合FKBP1A從而誘導(dǎo)CRC細(xì)胞衰老，這為梔子苷用于CRC治療的研究和開發(fā)提供了理論依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞：梔子苷；結(jié)腸癌；細(xì)胞衰老；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；作用靶點(diǎn)；分子對(duì)接

中圖分類號(hào)：Q5；R97 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2395（2024）05-1097-11

0 引言

結(jié)腸癌（CRC）是全球最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高居第三，死亡率位列第二，約占所有惡性腫瘤相關(guān)死亡的10%［1］。近年來，我國(guó)CRC 的發(fā)病率和死亡率表現(xiàn)出明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危及患者生命健康。CRC 的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等，化療是普遍采用的基石治療策略。耐藥性和毒副作用嚴(yán)重限制了化療對(duì)CRC 的治療效果［2］。因此，亟需開發(fā)具有抗癌活性且毒副作用低的新型抗腫瘤藥物。天然產(chǎn)物以其資源豐富、明確的抗腫瘤活性、免疫調(diào)節(jié)活性、對(duì)正常組織低毒性以及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，成為抗腫瘤藥物開發(fā)的資源寶庫(kù)［3］。從天然產(chǎn)物中獲取安全有效的預(yù)防和治療腫瘤的活性成分已成為目前研究的熱點(diǎn)［4-5］。

梔子是茜草科梔子屬灌木植物，其果實(shí)是一種重要的藥食同源的中藥，具有護(hù)肝、利膽、降壓、鎮(zhèn)靜、降糖等功效［6］。梔子苷（Geniposide）是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，是梔子的主要生物活性成分之一［6］。在中國(guó)藥典中，梔子苷已被確定為梔子原藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)。梔子苷具有抗炎、降血糖、抗菌、抗抑郁、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［7］。近年來?xiàng)d子苷的抗腫瘤作用引起了人們的極大興趣。梔子苷具有安全性好、生物利用度高及較好的抗腫瘤活性。研究表明，梔子苷對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，其作用機(jī)制涉及抑制細(xì)胞增殖［8］、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［9］、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥［10］等多個(gè)環(huán)節(jié)。潰瘍性結(jié)腸炎是一種特發(fā)性炎癥性腸病，與CRC 的罹患風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)［11］。研究表明，梔子苷在體內(nèi)外通過抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和腸道黏膜損傷從而發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用［11］。梔子苷通過下調(diào)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、人單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）以及程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（PD-1）的表達(dá)從而顯著抑制小鼠原位結(jié)腸癌的生長(zhǎng)［12］。然而，梔子苷在CRC 細(xì)胞中的胞內(nèi)靶點(diǎn)和潛在作用機(jī)制仍不明確。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了梔子苷用于CRC 治療的信號(hào)通路、靶點(diǎn)和分子機(jī)制，采用藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性（DARTS）聯(lián)合質(zhì)譜初步確定梔子苷發(fā)揮抗CRC 作用的具體胞內(nèi)靶點(diǎn)，結(jié)合分子對(duì)接手段分析梔子苷與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相互作用位點(diǎn)，利用DepMap 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CRC 細(xì)胞中該關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因依賴性，并通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)梔子苷對(duì)CRC 細(xì)胞衰老的影響。本研究結(jié)果不僅為探索梔子苷的深度利用及結(jié)腸癌的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)提供依據(jù)，也為以梔子苷為基礎(chǔ)的抗結(jié)腸癌藥物的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。梔子苷購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）、蛋白酶K、快速銀染試劑盒、BCA（BicinchoninicAcid Assay）蛋白濃度測(cè)定試劑盒和細(xì)胞衰老β - 半乳糖苷酶染色試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。組織細(xì)胞固定液購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司。EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（中國(guó)，國(guó)華）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)，Eppendorf）；電子天平（美國(guó)，Ohaus）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)，Thermo）；倒置熒光顯微鏡（日本，Nikon）；小型冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)，Eppendorf）；細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)（中國(guó)，力申）；酶標(biāo)儀（美國(guó)，BioTek）。

1.3 梔子苷作用靶點(diǎn)的獲取

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacol?ogy Database and Analysis Platform， TCMSP）、Swiss Target 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得梔子苷的分子式和相關(guān)分子信息，通過Super-PRED、Swiss Target Pre?diction、SEA （Similarity Ensemble Approach） 、TargetNet、PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索梔子苷的潛在作用靶點(diǎn)，并利用UniProt 將蛋白與基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.4 CRC相應(yīng)靶基因的獲取

通過DisGeNET、Genecards、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）檢索人類結(jié)腸癌的靶基因，刪除重復(fù)數(shù)據(jù)，獲得與CRC 相關(guān)的靶基因。

1.5 梔子苷與CRC靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的建立

將梔子苷靶點(diǎn)與結(jié)腸癌靶點(diǎn)映射取交集，繪制韋恩圖，運(yùn)用Cytoscape 3.10.0 軟件進(jìn)行處理，建立梔子苷與結(jié)腸癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將交集靶點(diǎn)運(yùn)用String 11.0、Cytoscape3.10.0 軟件繪制進(jìn)行分析，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型。使用cytoHubba 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊凸?jié)點(diǎn)中心性分析，以連通度為指標(biāo)篩選中心蛋白互作，剔除邊緣蛋白，繪制PPI 關(guān)系圖。

1.7 靶點(diǎn)通路及基因依賴性分析

用可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（the Databasefor Annotation，Visualization and Integrated Discov?ery， DAVID）在線分析工具，將上述篩選得到的共同靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能（GO）和通路（KEGG）的富集分析。設(shè)定閾值Plt;0.05，獲得與梔子苷的抗CRC 作用相關(guān)的信號(hào)通路，采用pathview包將分析結(jié)果進(jìn)行可視化。運(yùn)用DepMap 在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲得結(jié)腸癌細(xì)胞系的基因依賴性。

1.8 DARTS

將HCT-8 細(xì)胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度約為90%，收集細(xì)胞置于冰上進(jìn)行裂解提取總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量蛋白濃度。將總蛋白調(diào)整至6 μg/μL，將總蛋白等體積均分至2 個(gè)艾本德（Eppendorf，EP）管中，分別加入等體積的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline， PBS）和梔子苷，梔子苷終濃度為10 μmol/L，搖床上室溫孵育1 h。加入終濃度為10 μg/mL 蛋白酶K，室溫孵育10 min。加入5×loading buffer，100 ℃ 加熱5min。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide GelElectrophoresis， SDS-PAGE）后，采用快速銀染試劑盒進(jìn)行銀染，顯現(xiàn)出清晰條帶后，終止顯色并加入超純水保存。將銀染膠條寄至上海拜譜生物公司進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatography Coupled to Tan?dem Mass Spectrometry， LC-MS/MS）分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲得的差異蛋白并進(jìn)行GO 富集分析。

1.9 分子對(duì)接

從 PubChem 獲取配體分子的 2D 結(jié)構(gòu)，下載sdf 格式文件，使用OpenBabel-3.1.1 軟件轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank， PDB）格式文件。蛋白質(zhì)的PDB 文件可從AlphaFoldProtein Structure Database 中搜索UniProt ID 獲取。在AutoDock Tools-1.5.7 軟件中對(duì)小分子和蛋白去水、加氫。隨后設(shè)置參數(shù)和對(duì)接配體，分析配體與蛋白質(zhì)受體之間的親和力。選擇低結(jié)合能結(jié)果導(dǎo)出為pdbqt 文件。在pymol中打開結(jié)果文件，將氫鍵可視化，標(biāo)注具體對(duì)接位點(diǎn)。

1.10 EdU實(shí)驗(yàn)

將HCT-8 細(xì)胞接種于12 孔板中，待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至50% 融合度時(shí)，采用不同濃度梔子苷處理細(xì)胞24 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入1 mL 的50 μmol/L EdU 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用PBS清洗三次。每孔加入400 μL 的組織細(xì)胞固定液，室溫孵育30 min。吸棄固定液后，每孔加入400 μL 的2 mg/mL 甘氨酸，并于室溫?fù)u床孵育5 min 后，吸棄甘氨酸溶液。每孔加入800 μL的體積分?jǐn)?shù)為0.5% Triton X-100 進(jìn)行通透，PBS清洗三次后，加入EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒的800 μL 染色工作液，于室溫脫色搖床避光孵育30 min。PBS 清洗三次后，采用熒光顯微鏡觀察并保存圖像。

1.11 β-半乳糖苷酶染色

將HCT-8 細(xì)胞鋪入6 孔板中，待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至70% 融合度時(shí)，采用不同濃度梔子苷處理細(xì)胞24 h。棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗三次，加入1 mL 組織細(xì)胞固定液固定10 min。吸棄固定液，用PBS 清洗三次。每孔加入500 μL 的細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測(cè)液，進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色，使用保鮮膜包裹6 孔板，置于37 ℃無CO2 的培養(yǎng)箱中過夜孵育。PBS 清洗三次后，于顯微鏡下觀察并保存圖像。

1.12 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析，用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 梔子苷和CRC共同靶點(diǎn)的篩選

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Target 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取梔子苷的分子式、作用靶點(diǎn)和CRC 靶點(diǎn)等相關(guān)信息，我們分別檢索到728 個(gè)梔子苷的作用靶點(diǎn)和20 716 個(gè)CRC 的靶點(diǎn)。通過Venny 網(wǎng)站分析處理?xiàng)d子苷和CRC 的共同作用的靶點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)308 個(gè)基因是梔子苷和CRC 的交集靶基因（圖1）。

2.2 交集基因的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

蛋白質(zhì)相互作用（PPI）和多蛋白復(fù)合物在所有生物體的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著核心作用。在人類中，PPI 和多蛋白復(fù)合物的失調(diào)與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PPI 包括參與轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞間黏附和通訊、蛋白質(zhì)合成和降解、細(xì)胞周期控制等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用以及多蛋白復(fù)合物等［13］。因此，對(duì)細(xì)胞的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)研究，可以更好地理解細(xì)胞信號(hào)通路。

根據(jù)靶基因的節(jié)點(diǎn)連通度（degree 值）為篩選指標(biāo)，通過String 數(shù)據(jù)庫(kù)，將共同靶點(diǎn)生成PPI網(wǎng)絡(luò)；導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)一步構(gòu)建篩選得到的50 個(gè)節(jié)點(diǎn)的可視化交互網(wǎng)絡(luò)（圖2）。節(jié)點(diǎn)的顏色表示它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中的重要性，顏色越深代表著基因越重要。因此，分析結(jié)果表明梔子苷在CRC 中的潛在靶點(diǎn)可能與抗凋亡蛋白BCL2、腫瘤壞死因子TNF、蛋白激酶AKT1 等有關(guān)。

2. 3 GO和KEGG富集分析

采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步富集分析了梔子苷與CRC 交集的308 個(gè)潛在靶點(diǎn)，進(jìn)行GO和KEGG 富集分析。以Plt;0.05 為篩選條件，運(yùn)用R 軟件對(duì)生物學(xué)途徑（BP）和分子功能（MF）基因富集數(shù)排名前5 的條目繪制氣泡圖。GO分析結(jié)果顯示，梔子苷的抗CRC 作用主要涉及離子平衡調(diào)控、衰老、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、一氧化氮合成酶調(diào)控活性、凋亡信號(hào)通路、脂肪酶激活、蛋白激酶活性以及分子功能調(diào)控等方面（圖3）。

將KEGG 富集分析得到的134 條通路按照腫瘤調(diào)控途徑進(jìn)行排序，繪制前8 條通路的條形圖（圖4）。KEGG 富集通路分析結(jié)果顯示，梔子苷的抗CRC 的作用靶點(diǎn)主要涉及腫瘤中心碳代謝通路、腫瘤生成相關(guān)受體激活、p53 信號(hào)通路、化療耐藥、細(xì)胞周期、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O（Fork?head Box O， FOXO）信號(hào)通路、活性氧以及細(xì)胞衰老等途徑。這些結(jié)果表明梔子苷的抗CRC 作用與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。因此，本研究主要聚焦梔子苷對(duì)CRC 細(xì)胞衰老的影響。

2.4 DARTS 實(shí)驗(yàn)明確梔子苷在CRC 細(xì)胞中的潛在作用靶點(diǎn)

藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性（DARTS）是一種鑒定和研究蛋白質(zhì)與小分子相互作用的方法，主要的優(yōu)勢(shì)是不需要對(duì)小分子進(jìn)行任何結(jié)構(gòu)修飾即可鑒定出小分子的靶點(diǎn)［14］。DARTS的原理為小分子與靶蛋白結(jié)合時(shí)會(huì)穩(wěn)定靶蛋白的結(jié)構(gòu)，使其對(duì)蛋白酶產(chǎn)生耐受，通過檢測(cè)靶蛋白的穩(wěn)定性變化從而揭示細(xì)胞中的藥物分子與靶標(biāo)的相互作用［14］。為了探究梔子苷的抗腫瘤機(jī)制，我們采用了DARTS 策略來鑒定梔子苷在CRC 細(xì)胞中的靶蛋白（圖5（a））。通過SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)梔子苷作用于CRC細(xì)胞的靶蛋白，將電泳后的凝膠進(jìn)行銀染處理（圖5（b））。對(duì)照組和加藥組的蛋白條帶進(jìn)行酶解后，通過LC-MS/MS 分析、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析，獲得84 個(gè)差異蛋白。鑒于FKBP 脯氨酸異構(gòu)酶1A（FKBP1A）在腫瘤中高表達(dá)且與細(xì)胞衰老密切相關(guān)［15-16］，因此，選取了FKBP1A 作為梔子苷在CRC 細(xì)胞中的潛在靶點(diǎn)。

2.5 DepMap 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CRC 細(xì)胞中FKBP1A 的基因依賴性

DepMap 在線數(shù)據(jù)庫(kù)旨在系統(tǒng)地鑒定癌細(xì)胞生存所需基因并分析腫瘤對(duì)關(guān)鍵基因的依賴性，從而揭示與腫瘤脆弱性相關(guān)的潛在靶點(diǎn)［17］。通過對(duì)來自DepMap 數(shù)據(jù)集的CRISPR和siRNA 數(shù)據(jù)進(jìn)行了全面分析，重點(diǎn)聚焦FK?BP1A 在CRC 細(xì)胞中的基因依賴性。利用Dep?Map 數(shù)據(jù)庫(kù)提取了FKBP1A 的依賴性得分，-1分表示基因具有致死性，而0 分表示基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生存沒有明顯的影響。結(jié)果顯示，在DepMap 的CRISPR 和siRNA 數(shù)據(jù)集中FKBP1A發(fā)生顯著富集（圖6（a），（b）），表明了FKBP1A是CRC 細(xì)胞生存的必需基因，F(xiàn)KBP1A 可作為CRC 的潛在靶點(diǎn)。

2.6 梔子苷與FKBP1A的分子對(duì)接

研究表明，F(xiàn)KBP1A 在胃癌、結(jié)腸癌、頭頸鱗癌等多種腫瘤中高表達(dá)，已成為腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的重要因素［18］。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)KBP1A 與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、化療耐藥以及細(xì)胞衰老等過程密切相關(guān)［15-16 ， 18-19］。采用AutoDock 軟件將梔子苷與FKBP1A 靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示，梔子苷與FKBP1A 靶點(diǎn)之間具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可以與FKBP1A 的PRO-16、ARG-18、GLU-60 位點(diǎn)形成氫鍵（圖7）。這些結(jié)果表明，梔子苷可能通過與FKBP1A 的PRO-16、ARG-18、GLU-60 位點(diǎn)結(jié)合從而發(fā)揮抗CRC 的作用。

2.7 梔子苷誘導(dǎo)CRC細(xì)胞衰老

EdU 是一種胸腺嘧啶類似物，可以整合進(jìn)入正在合成的DNA 中，通過與染料反應(yīng)發(fā)出熒光，從而真實(shí)地反映細(xì)胞增殖的情況［3］。EdU結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，梔子苷處理組紅色熒光明顯減少，且梔子苷對(duì)CRC 細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度依賴性（圖8（a），（b））。研究表明，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA- β-gal）的陽(yáng)性染色可作為細(xì)胞衰老特異性的標(biāo)志物［20］。為了探究梔子苷是否影響CRC 細(xì)胞衰老，我們采用不同濃度梔子苷處理CRC 細(xì)胞24 h，并檢測(cè)對(duì)β - 半乳糖苷酶活性的影響。隨著梔子苷濃度的增加，HCT-8 細(xì)胞中SA- β-gal 陽(yáng)性染色的比例逐漸增大，這表明梔子苷能夠以濃度依賴性方式誘導(dǎo)CRC 細(xì)胞衰老（圖9（a），（b））。

3 討論

CRC 是一種致死率較高的癌癥之一，迫切需要開發(fā)新型、安全且更有效的抗腫瘤策略。天然產(chǎn)物已成為抗腫瘤新藥研發(fā)的重要資源?，F(xiàn)有文獻(xiàn)表明，天然產(chǎn)物及其衍生物占美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的癌癥治療藥物的近53% ［3］。梔子苷是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，是從梔子果實(shí)中提取的有效成分之一，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、降糖降脂、保肝、抗腫瘤等多種藥理活性［6］。然而，梔子苷在CRC 中的靶點(diǎn)和分子機(jī)制尚未明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興科學(xué)，它融合了系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物信息學(xué)，主要使用網(wǎng)絡(luò)成分分析來表征生物系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用，從而確定腫瘤治療中的協(xié)同效應(yīng)［21］。作為一種探索藥物與疾病關(guān)系的新策略，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)地預(yù)測(cè)和解釋小分子或中藥化合物與多種疾病的相互作用機(jī)制［21］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在闡明小分子和疾病之間的作用機(jī)制的應(yīng)用已得到充分證明［21-22］。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲取梔子苷和CRC 的作用靶點(diǎn)，利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)梔子苷發(fā)揮抗CRC 作用的分子機(jī)制與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。運(yùn)用DARTS 聯(lián)合質(zhì)譜確定梔子苷誘導(dǎo)CRC細(xì)胞衰老的胞內(nèi)靶點(diǎn)，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)梔子苷通過誘導(dǎo)CRC 細(xì)胞衰老發(fā)揮抗腫瘤作用，為梔子苷的深度開發(fā)及CRC 的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)提供依據(jù)。

細(xì)胞衰老是一種以不可逆的生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞功能改變?yōu)樘卣鞯募?xì)胞狀態(tài)，其基本特征包括細(xì)胞周期抑制蛋白p16 和p53 的上調(diào)，SA-β-gal 活性升高，以及核纖層蛋白Lamin B1 的下調(diào) 等。細(xì)胞衰老被認(rèn)為是一種有效的腫瘤抑制機(jī)制，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老可以作為癌癥治療的一種新型極具前景的策略。在化療藥物濃度明顯低于臨床劑量的情況下可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老，從而為降低化療毒副作用提供了希望［23］。驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入衰老表型可以使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物重新敏感［24］。此外，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)，再采用選擇性殺傷衰老腫瘤細(xì)胞的藥物，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)治療［25］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷可以有效誘導(dǎo)CRC 細(xì)胞衰老。在后續(xù)研究中，我們將篩選高效化合物進(jìn)行選擇性清除梔子苷誘導(dǎo)的衰老CRC 細(xì)胞，從而開發(fā)基于梔子苷的CRC 精準(zhǔn)治療策略。

作為免疫親和蛋白FKBP（FK506 結(jié)合蛋白）家族重要成員，F(xiàn)KBP1A 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［15-16 ， 18-19］。研究表明，F(xiàn)KBP1A 可通過與溶質(zhì)載體家族3 成員2（SLC3A2）蛋白發(fā)生相互作用從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥，靶向干預(yù)FK?BP1A 與SLC3A2 之間的相互作用可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［19］。FKBP1A 蛋白作為免疫抑制藥物的受體，調(diào)控著免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而驅(qū)動(dòng)腫瘤惡性進(jìn)展［26］。FKBP1A 的高表達(dá)與肝癌組織的造血免疫細(xì)胞（包括B 細(xì)胞、CD8+ T 細(xì)胞、CD4+ T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）的浸潤(rùn)呈現(xiàn)正相關(guān)，被認(rèn)為是肝癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的潛在預(yù)后靶點(diǎn)［27］。敲低FKBP1A 的表達(dá)可通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬并抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)［28］。此外，F(xiàn)K?BP1A 在細(xì)胞衰老過程中扮演著重要角色［15-16］。DARTS 實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了，梔子苷在CRC 細(xì)胞中的潛在作用靶點(diǎn)為FKBP1A。分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)一步表明，梔子苷可能通過與FKBP1A 的PRO-16、ARG-18、GLU-60 位點(diǎn)結(jié)合從而發(fā)揮誘導(dǎo)CRC 細(xì)胞衰老的作用?？紤]到腫瘤細(xì)胞衰老在腫瘤治療中的重要作用，在今后工作中我們將深入探究梔子苷靶向FKBP1A 誘導(dǎo)CRC細(xì)胞衰老的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究闡明了梔子苷抗CRC 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，揭示了梔子苷通過靶向結(jié)合FKBP1A 從而誘導(dǎo)CRC 細(xì)胞衰老的潛在可能，但梔子苷調(diào)控FKBP1A 誘導(dǎo)CRC 細(xì)胞衰老的具體機(jī)制還有待深入研究。本研究的開展為梔子苷用于CRC 治療的研究提供了依據(jù)和參考。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（82270217）