摘要：在百日草（Zinnia elegans）S5頭狀花序形態(tài)和子房細(xì)胞學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，通過(guò)不同配比農(nóng)桿菌重懸液、真空處理方法和頭狀花序發(fā)育時(shí)期對(duì)非組培的花序浸染法進(jìn)行百日草轉(zhuǎn)化技術(shù)適用性探索。結(jié)果表明，S5花序發(fā)育的外部形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)小花蕾7及以后發(fā)育時(shí)期的心皮處于開(kāi)放狀態(tài)。農(nóng)桿菌重懸液為1/2 MS + 0.03% Silwet L-77 + 10%蔗糖 + 0.01 mg/L 6-BA（OD600 nm=0.4）處理蕾3頭狀花序得到0.35%的轉(zhuǎn)化率。真空斷續(xù)處理有利于轉(zhuǎn)化率的提高，較好的處理組合是真空斷續(xù)2 min+30 s處理蕾5至蕾7頭狀花序，收獲其中的小花蕾7至蕾9的轉(zhuǎn)化率可達(dá)3.23%～5.00%。

關(guān)鍵詞：百日草（Zinnia elegans）； 花序浸染； 遺傳轉(zhuǎn)化； 真空處理； 花蕾時(shí)期

中圖分類號(hào)：S681.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）10-0081-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.10.014 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Based on the observation of the head inflorescence morphology and ovary cytology of Zinnia elegans S5， the applicability of the transformation technology of Zinnia elegans was explored by using different ratios of Agrobacterium suspension， vacuum treatment method and non-tissue culture inflorescence infection method during the development of the head inflorescence. The results showed that the external morphology and cyt_{0uHpllynNjZN10rC7cUg/w==}ological observation of S5 inflorescence development found that the carpels of small flower bud 7 and later development stages were in an open state. The bud 3 capitate inflorescence was treated with the Agrobacterium suspension of 1/2 MS + 0.03% Silwet L-77 + 10% sucrose + 0.01 mg/L 6-BA （OD600 nm=0.4）， the obtp9/Sg4UpYPDyoqbOmp2rsQ==aining 0.35% conversion rate. The vacuum intermittent treatment was beneficial to the improvement of the conversion rate. The better treatment combination was vacuum intermittent 2 min + 30 s treatment bud 5 to bud 7 capitulum. The conversion rate of small bud 7 to bud 9 could reach 3.23%～5.00%.

Key words： Zinnia elegans； inflorescence dipping； genetic transformation； vacuum treatment； bud period

轉(zhuǎn)基因方法組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化操作復(fù)雜、技術(shù)性高，而花序浸染法因避開(kāi)組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化階段，被廣泛應(yīng)用于擬南芥［1-3］、油菜［4］、白菜［5］等植物中。影響花序浸染轉(zhuǎn)化的主要因素有花蕾發(fā)育時(shí)期、重懸液配方及真空處理等。心皮開(kāi)放的蕾期是農(nóng)桿菌獲得轉(zhuǎn)化率較高的關(guān)鍵階段，擬南芥只有在浸染6～11 d后開(kāi)花的花蕾才產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植株［6］，番茄［7］和油菜［4］約 8 d后開(kāi)花的花蕾分別獲得0.10%和0.50%的轉(zhuǎn)化率。合適的重懸液也是有效提高花序浸染轉(zhuǎn)化率的重要因素，重懸液主要成分一般由表面活性劑、糖類、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素組成，擬南芥［3，8，9］、蘿卜［10］和油菜［11］使用表面活性劑0.05%的Silwet L-77的轉(zhuǎn)化率最佳，菊科的萬(wàn)壽菊使用0.02%的Silwet L-77的轉(zhuǎn)化率最高［12］。擬南芥［8］、甘藍(lán)型油菜［11］和芥菜［13］使用蔗糖濃度為5%，番茄［7］和萬(wàn)壽菊［12］使用蔗糖濃度為15%均獲得較高的轉(zhuǎn)化率。農(nóng)桿菌重懸液與組織細(xì)胞接觸是轉(zhuǎn)化的重要影響因素，真空處理可以使農(nóng)桿菌重懸液更容易滲透至組織內(nèi)部，目前此方法主要應(yīng)用在擬南芥［8］、白菜［14，15］、水稻［16］等植物。

百日草（Zinnia elegans）為菊科百日草屬一年生草本花卉，花色變化豐富且鮮明，在園林綠化中應(yīng)用廣泛。百日草育種主要通過(guò)常規(guī)選育和雜交育種，傳統(tǒng)育種周期長(zhǎng)，存在遠(yuǎn)緣雜交不親和的限制，目前百日草還未有轉(zhuǎn)化體系，花序浸染法作為一種非組培的轉(zhuǎn)化途徑，對(duì)縮短育種年限，打破生殖隔離，創(chuàng)造新品種具有重要意義。本試驗(yàn)以百日草S5為材料，探究不同蕾期時(shí)間、重懸液的配比、真空處理時(shí)間對(duì)花序浸染的影響，以期建立一種可行、簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)化方法，為進(jìn)一步獲得百日草新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2013年3月至2020年11月在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地與園藝植物國(guó)家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，百日草花序浸染轉(zhuǎn)化技術(shù)研究所用材料為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院百日草課題組經(jīng)過(guò)多年純化選育出的純合平瓣可育系S5。

1.2 方法

1.2.1 百日草花序發(fā)育時(shí)期形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)的觀察試驗(yàn) 選擇3株生長(zhǎng)健壯整齊的S5，每天上午10：00觀察和測(cè)量記錄第一個(gè)頭狀花序橫徑大小，至第一輪小花展開(kāi)。花3（開(kāi)花第3天）花序（頭狀花序開(kāi)花第3天稱為TH3）由外向內(nèi)剝?nèi)?～11輪小花（外圍第一輪小花稱為花3（H3），向內(nèi)第四輪小花稱為蕾1（L1），1～11輪小花依次稱為H3-H1、L1-L8）制作石蠟切片，觀察子房心皮開(kāi)合狀態(tài)。

1.2.2 不同配比濃度的農(nóng)桿菌重懸液對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響試驗(yàn) 選擇處于蕾3頭狀花序（距離開(kāi)花3 d的頭狀花序稱為TL3）為處理對(duì)象，采用試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，收集攜帶質(zhì)粒pBI121的不同OD600 nm的農(nóng)桿菌菌體，溶解于不同濃度Silwet L-77、蔗糖和OD600 nm配比的重懸液中，分別點(diǎn)滴在TL3頭狀花序上，每種重懸液處理花序各10個(gè)，點(diǎn)滴的菌液量以有菌液滴落為宜。遮陰24 h后套袋授粉。分批采收成熟的種子，播種T0代種子，提取單株DNA，以野生植株DNA為陰性對(duì)照，以NptⅡ載體農(nóng)桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，以引物NptⅡ-Pl（5′-GACAATCGGCTGCTCTGA-3′）、NptⅡ-P2（5′-AACTCCAGCATGAGATCC-3′）和引物GUS-P1（5′-CACACCGATACCATCAGCGATC-3′）、GUS-P2（5′-GTGTGGCTATGGTAGTCGCTAG-3′）分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)NptⅡ和GUS基因，并統(tǒng)計(jì)T1代的轉(zhuǎn)化率。

1.2.3 真空處理和花苞蕾期對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響試驗(yàn) 設(shè)置不同頭狀花序蕾期、真空處理方法以及小花蕾期的不同處理組合對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響（表2），每處理5個(gè)花苞，重復(fù)4次。具體的操作方法：選擇不同蕾期頭狀花序，直徑在8～12 mm，分別按設(shè)計(jì)進(jìn)行處理，使用1/2 MS+Silwet L-77（0.03%）+蔗糖（10%）+6-BA（0.01 mg/L）重懸OD600 nm=0.4的攜帶35S-DsRed2載體農(nóng)桿菌菌體，用注射器針頭插入子房所在位置深約1.5 cm，緩慢注入直至頭狀花序四周有重懸液滲出為止。將整株植物放入真空干燥箱，壓強(qiáng)為-25 kPa，分別真空處理1 min和2 min后，恢復(fù)常壓30 s，再抽真空處理30 s，記為處理真空斷續(xù)1 min+30 s和2 min+30 s。真空處理后只對(duì)設(shè)計(jì)蕾期L7、L9的小花授粉。待種子成熟按小花蕾期采收種子。播種T0代種子，待第3對(duì)真葉完全展開(kāi)時(shí)，在黑暗環(huán)境下進(jìn)行熒光檢測(cè)，以野生植株為對(duì)照，記錄有紅色熒光的百日草。使用引物DsRed2-F（5′-ACAGAA CTCGCCGTAAAGAC-3′）、DsRed2-R（5′-CCGTCC TCGAAGTTCATCAC-3′）對(duì)DsRed2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用同“1.2.2”的PCR檢驗(yàn)方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 百日草花序發(fā)育時(shí)期形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)的觀察結(jié)果分析

形態(tài)觀測(cè)表明，S5從現(xiàn)蕾到開(kāi)花約需16 d，該過(guò)程中頭狀花序直徑與距離開(kāi)花天數(shù)存在高度線性關(guān)系（R2為0.98），TL7至TL3頭狀花序花蕾直徑為8～12 mm。不同時(shí)期的花蕾呈現(xiàn)出相應(yīng)的形態(tài)特征，除花蕾逐漸變大外，總苞片邊緣顏色變深（圖1A、圖1B），TL7花蕾頂端微開(kāi)可觀察到內(nèi)部小花苞片顏色，即透色（圖1C），TL5總苞片半包裹最外輪小花（圖1D），而TL3總苞片就只包裹到基部（圖1E），TH1最外輪小花花瓣完全展開(kāi)，丫狀柱頭露出（圖1F）。可以根據(jù)花序的外部形態(tài)特征推測(cè)蕾期，用以選擇適宜的浸染花蕾時(shí)期。

TH3頭狀花序不同輪次的小花發(fā)育切片細(xì)胞學(xué)觀察表明，L6及之前時(shí)期的小花心皮處于閉合狀態(tài)（圖2A、圖2B），L7及以后時(shí)期的小花心皮處于開(kāi)放狀態(tài)（圖2C）。

2.2 不同配比濃度的農(nóng)桿菌重懸溶液對(duì)T1代轉(zhuǎn)化效率的影響

由表1可知，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株的有處理2和處理8，均為表面活性劑0.03% Silwet L-77的重懸液。較適宜的重懸液配比為組合2：1/2 MS + 0.03% Silwet L-77+10%蔗糖+0.01 mg/L 6-BA，OD600 nm=0.4。T1代的PCR分子檢測(cè)組合處理2和處理8分別獲得2株和1株轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率分別為0.35%和0.31%（圖3A、圖3B）。GUS組織染色檢測(cè)（圖3C、圖3D、圖3E）發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性株葉片的不同部位呈現(xiàn)藍(lán)色斑塊，說(shuō)明成功轉(zhuǎn)化GUS基因能在T1代植物體表達(dá)。

2.3 真空處理和花苞蕾期對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

由表2可以看出，不同處理組合種子發(fā)芽率為64.52%～81.82%，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株的有4個(gè)處理組合，共有6棵轉(zhuǎn)化植株，其中，轉(zhuǎn)化率較高的組合（5.00%）為真空處理2 min+30 s條件下的TL7頭狀花序的L7小花。經(jīng)過(guò)PCR鑒定出明亮條帶（圖4）；用手持熒光燈篩選轉(zhuǎn)化植株，植株呈現(xiàn)紅色熒光，說(shuō)明成功轉(zhuǎn)化的T1代植株紅色熒光基因能夠在植物體表達(dá)（圖5）。

3 討論

3.1 心皮開(kāi)放是浸染的關(guān)鍵時(shí)期

本研究中百日草S5細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，處于L6及以前時(shí)期的小花心皮處于開(kāi)放狀態(tài)，處于L7及以后時(shí)期的小花心皮處于開(kāi)放狀態(tài)。同時(shí)農(nóng)桿菌侵染TL5至TL7頭狀花序的L7、L9的小花也獲得了較高的轉(zhuǎn)化率。據(jù)報(bào)道，心皮開(kāi)放的時(shí)期隨物種不同而不同，白菜［17］為蕾15及以后時(shí)期、擬南芥［6］為蕾6至蕾11、番茄［7］和油菜［4］為蕾8及以后時(shí)期的小花。百日草是頭狀花序，從外輪到內(nèi)輪小花數(shù)量減少，TL5至TL7的L7及以后時(shí)期小花位于頭狀花序的外輪，占整個(gè)頭狀花序數(shù)量比例高，且種子飽滿。

3.2 重懸液配方會(huì)影響轉(zhuǎn)化率

百日草花序浸染法較適宜的重懸液配方為1/2 MS + Silwet L-77（0.03%）+蔗糖（10%）+ 6-BA（0.01 mg/L）、OD600 nm=0.4，轉(zhuǎn)化率為0.35%。在Silwet L-77濃度的選擇上，不同物種的耐受性不同，擬南芥［8］適宜的濃度較高，為0.05%，獲得0.6%的轉(zhuǎn)化率；菊科萬(wàn)壽菊適宜的濃度較低，為0.02%［12］。農(nóng)桿菌需要糖類物質(zhì)提供養(yǎng)分和滲透壓［8，13］，本研究蔗糖濃度為10%和15%可獲得轉(zhuǎn)化植株，與番茄［7］所需10%和萬(wàn)壽菊［12］所需15%蔗糖濃度相一致。

3.3 真空處理影響轉(zhuǎn)化率

本研究發(fā)現(xiàn)，TL3花序浸染法不適合真空處理，而TL5至TL7適合真空處理轉(zhuǎn)化，且真空斷續(xù)2 min+30 s的轉(zhuǎn)化率高于真空斷續(xù)1 min+30 s，較好的處理組合是真空斷續(xù)2 min+30 s處理TL5至TL7頭狀花序的L7至L9小花，轉(zhuǎn)化率達(dá)3.23%～5.00%，最高轉(zhuǎn)化率的組合為真空處理2 min+30 s條件下的TL7頭狀花序的L7小花。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是TL3頭狀花序時(shí)期小花之間空隙較大，與重懸液可以充分接觸，真空處理反而會(huì)對(duì)小花產(chǎn)生傷害，而TL5至TL7頭狀花序的小花通過(guò)真空處理可促進(jìn)帶農(nóng)桿菌的重懸液更容易滲透至組織內(nèi)部［1，2，18］，提高轉(zhuǎn)化效率。小白菜真空處理25 min，轉(zhuǎn)化率達(dá)0.1～0.3%［5，14］，秈稻真空斷續(xù)處理15 min+3 min，轉(zhuǎn)化率達(dá)3.5～6.5%［16］，菜薹花序浸染也使用真空斷續(xù)處理5 min+5 min，轉(zhuǎn)化率達(dá)0.1%［19］，大白菜真空斷續(xù)處理1 min+30 s，轉(zhuǎn)化率達(dá)2.11%［20］。也有真空滲透轉(zhuǎn)化使番茄幼苗生長(zhǎng)全部死亡的報(bào)道［7］。

4 小結(jié)

百日草花序浸染法是一種成功高效獲得轉(zhuǎn)化植株的方法，本研究結(jié)果表明，重懸液、心皮開(kāi)放時(shí)期、頭狀花序蕾期、真空處理影響花序浸染轉(zhuǎn)化率，其中1/2 MS + 0.03% Silwet L-77 + 10%蔗糖 + 0.01 mg/L 6-BA、OD600 nm=0.4是適宜的農(nóng)桿菌重懸液配方，L7及以后時(shí)期的小花心皮處于開(kāi)放狀態(tài)，是農(nóng)桿菌侵染的關(guān)鍵時(shí)期，TL3花序浸染法不適合真空處理，而TL5至TL7適合真空處理轉(zhuǎn)化，較好的處理組合是真空斷續(xù)2 min+30 s處理TL5至TL7頭狀花序的小花，L7至L9的轉(zhuǎn)化率可達(dá)3.23%～5.00%，其中真空處理2 min+30 s條件下的TL7頭狀花序的L7小花轉(zhuǎn)化率為5.00%。

參考文獻(xiàn)：

［1］ BECHTOLD N，ELLIS J，PELLETIER G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants［J］.C R Acad Sci Paris，1993，316（10）：1194-1199.

［2］ BECHTOLD N，PELLETIER G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration［J］.Methods in molecular biology，1998，82：259-266.

［3］ CLOUGH S J，BENT A F. Floral dip： A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana［J］.The plant journal，1998，16（6）：735-743.

［4］ HU D，BENT A F，HOU X L，et al. Agrobacterium-mediated vacuum infiltration and floral dip transformation of rapid-cycling Brassica rapa［J］.BMC plant biology，2019，19（1）：246.

［5］ XU H J，WANG X F，ZHAO H，et al. An intensive understanding of vacuum infiltration transformation of pakchoi （Brassica rapa ssp. chinensis）［J］.Plant cell reports，2008，27（8）：1369-1376.

［6］ DESFEUX C，CLOUGH S J，BENT A F. Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method［J］.Plant physiology （Rockville），2000，123（3）：895-904.

［7］ SHARADA M S，KUMARI A，PANDEY A K，et al. Generation of genetically stable transformants by Agrobacterium using tomato floral buds［J］.Plant cell，tissue and organ culture （PCTOC），2017，129（2）：299-312.

［8］ TAGUE B W. Germ-line transformation of Arabidopsis lasiocarpa［J］.Transgenic research，2001，10（3）：259-267.

［9］ MARTINEZ-TRUJILLO M，LIMONES-BRIONES V，CABRERA-PONCE J L，et al. Improving transformation efficiency of Arabidopsis thaliana by modifying the floral dip method［J］.Plant molecular biology reporter，2004，22（1）：63-70.

［10］ CURTIS I S，NAM H G. Transgenic radish （Raphanus sativus L. longipinnatus Bailey）by floral-dip method-plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency［J］.Transgenic research，2001，10（4）：363-371.

［11］ VERMA S S，CHINNUSAMY V，BANSA K C. A simplified floral dip method for transformation of Brassica napus and B.carinata［J］.Journal of plant biochemistry and biotechnology，2008，17：197-200.

［12］ CHENG X，HUANG C L，ZHANG X H，et al. Establishment of transgenic marigold using the floral dip method［J］.Acta physiologiae plantarum，2019，41：147.

［13］ 代法國(guó)，胡宗利，陳國(guó)平，等.一種獲得轉(zhuǎn)基因芥菜的簡(jiǎn)便方法［J］.生命科學(xué)研究，2011，15（1）：19-23.

［14］ QING C M，F(xiàn)AN L，LEI Y，et al. Transformation of pakchoi （Brassica rapa L. ssp.chinensis） by Agrobacterium infiltration［J］.Mol Breed，2000，6（1）：67-72.

［15］ 徐恒戩.利用真空滲入法獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲白菜及其轉(zhuǎn)化機(jī)理的研究［D］.山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［16］ LIN J，ZHOU B，YANG Y，et al. Piercing and vacuum infiltration of the mature embryo： NnJRr8zVXG5Bd/wmyJ1HSg==A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of indica rice［J］.Plant cell reports，2009， 28（7）：1065-1074.

［17］ 韓 笑.白菜浸花法轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究［D］.山東濟(jì)寧：曲阜師范大學(xué)，2012.

［18］ 付紹紅.floral-dip法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜有關(guān)影響因素研究［D］.成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［19］ 宗 梅，韓 碩，郭 寧，等.利用真空滲透和CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得非轉(zhuǎn)基因菜薹突變體［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2022，38（10）：159-163.

［20］ 張廣輝，鞏振輝，薛萬(wàn)新，等.大白菜和油菜真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化法初報(bào)［J］.西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998（4）：6-9.

收稿日期：2023-07-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（3197180437）

作者簡(jiǎn)介：潘雨荷（1999-），女，河南南陽(yáng)人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種，（電話）18613773226（電子信箱）3207938742@qq.com；通信作者，葉要妹，教授，博士，主要從事園林植物栽培與育種研究，（電子信箱）yymld@mail.hzau.edu.cn。