摘要：探究CsLOX6基因和CsHPL2基因?qū)M南芥（Arabidopsis thaliana）生長以及對干旱和鹽脅迫抗性的影響，以野生型擬南芥（WT）、轉(zhuǎn)基因型擬南芥（OE-CsLOX6、OE-CsHPL2）、突變體型擬南芥（TB-Atlox5）為材料，通過表型觀察、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學分析等方法評估4種擬南芥的耐旱性、耐鹽性。結(jié)果表明，OE-CsLOX6的地上部鮮重和根長均顯著高于其他基因型植株，地下部鮮重明顯高于其他基因型植株；OE-CsHPL2的地上部鮮重、地下部鮮重和根長明顯低于其他基因型植株。OE-CsLOX6、OE-CsHPL2和WT的代謝物含量存在較大差異，OE-CsLOX6和WT有64個差異代謝物，其中有6個上調(diào)，58個下調(diào)；OE-CsHPL2和WT有63個差異代謝物，其中有9個上調(diào)，54個下調(diào)。過表達CsLOX6基因和CsHPL2基因可以提高擬南芥對鹽脅迫和干旱脅迫的抗性。在鹽脅迫和干旱脅迫下，OE-CsLOX6、OE-CsHPL2的丙二醛含量要顯著低于野生型植株，膜質(zhì)過氧化程度低，SOD、POD和CAT活性要明顯高于野生型，提高了植株的抗氧化能力，葉片長勢明顯優(yōu)于野生型植株。

關(guān)鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）；異源過表達；CsLOX6基因；CsHPL2基因；耐鹽性；耐旱性；脅迫

中圖分類號：S642.2 RF58snVPgIRUvMo8rYGR6Wb6UgLlQLpyvCKz6OzHkYY=文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）10-0165-11

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.10.030 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： To explore the effects of CsLOX6 gene and CsHPL2 gene on the growth of Arabidopsis thaliana and its resistance to drought and salt stress， wild-type Arabidopsis thaliana （WT）， transgenic Arabidopsis thaliana （OE-CsLOX6， OE-CsHPL2）， and mutant Arabidopsis thaliana （TB-Atlox5） were used as materials， and the drought and salt tolerance of the four Arabidopsis thaliana species were evaluated through phenotype observation， transcriptome， and metabolomics analysis. The results showed that the aboveground fresh weight and root length of OE-CsLOX6 were significantly higher than those of other genotypes， and the underground fresh weight was significantly higher than that of other genotypes；the aboveground fresh weight， underground fresh weight， and root length of OE-CsHPL2 plants were significantly lower than those of other genotypes. There were significant differences in the metabolite content between OE-CsLOX6， OE-CsHPL2， and WT. OE-CsLOX6 and WT had 64 differential metabolites， of which 6 were upregulated and 58 were downregulated；OE-CsHPL2 and WT had 63 differential metabolites， of which 9 were upregulated and 54 were downregulated. Overexpression of CsLOX6 gene and CsHPL2 gene could enhance the resistance of Arabidopsis thaliana to salt stress and drought stress. Under salt stress and drought stress， compared with wild-type plants， the malondialdehyde content of OE-CsLOX6 and OE-CsHPL2 was significantly lower， and the degree of membrane peroxidation was lower，the activities of SOD， POD， and CAT enzymes were significantly higher than those of the wild type， which improved the antioxidant capacity of the plants and resulted in significantly better leaf growth compared to the wild type plants.

Key words： Arabidopsis thaliana； heterologous overexpression； CsLOX6 gene； CsHPL2 gene； salt tolerance； drought tolerance； stress

植物揮發(fā)性物質(zhì)（Volatiles compounds，VOCs）來自一系列營養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、脂肪酸、類胡蘿卜素等，由初生代謝物和次生代謝物產(chǎn)生，通常是低分子的親脂性化合物。氧脂素是脂肪酸氧化LOX-HPL途徑的氧合衍生物，在許多情況下參與植物防御反應(yīng)或作為基因表達的調(diào)節(jié)劑。有研究表明，青草味的C6醛類香氣和花香味的C9醛類香氣是構(gòu)成黃瓜果實香氣揮發(fā)物的主要成分［1］，約占總揮發(fā)性物質(zhì)的70%～95%。黃瓜中脂肪酸的氧化有兩條途徑，一條是生成茉莉酸的途徑［2］，另一條為體內(nèi)僅存的短鏈醛類物質(zhì)合成途徑：LOX-HPL途徑［3］，即體內(nèi)游離的α-亞麻酸和亞油酸在LOX酶的作用下加上分子氧轉(zhuǎn)變成13-或9-氫過氧化物亞麻酸（HPOT）和氫過氧化物亞油酸（HPOD），然后通過脂氫過氧化物裂解酶（HPL）、烯醛異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化成短鏈C6、C9醛類物質(zhì)，從而形成令人倍感清新的芳香氣味［4，5］，如圖1所示［6］。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）中存在6個AtLOX基因，南瓜中存在18個CmLOX基因，黃瓜中存在23個CsLOX基因［7］，表明在植物的生長發(fā)育過程中需要不同脂氧合酶基因的調(diào)控。利用擬南芥6個突變亞型的每種突變體系，發(fā)現(xiàn)LOX2參與植物揮發(fā)性物質(zhì)的合成，與受傷的組織相比，在完好的組織中LOX2的活性被抑制，受傷時被激活［8］。擬南芥中4種13-LOXs都有助于受損葉片中茉莉酸鹽的合成，其中LOX6對合成茉莉酸鹽的相對貢獻更高，合成的強度隨離葉尖創(chuàng)口距離增加而增加，LOX6產(chǎn)物可能發(fā)揮著信號作用［9，10］。超表達番茄LOX基因可以提高番茄植株的茉莉酸含量，并且提高植株對病原菌、昆蟲、高溫和機械損傷的抵抗能力［11］。沉默番茄果實和葉片的LOXC基因，綠葉揮發(fā)性物質(zhì)含量顯著降低［12］。將柿子的DkLOX3基因轉(zhuǎn)入番茄和擬南芥中，發(fā)現(xiàn)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的耐干旱和耐鹽能力有所增強［13］。

Matsui等［14］首先從辣椒中克隆得到HPL的cDNA全長序列后，人們相繼從擬南芥、黃瓜、甜瓜、紫花苜蓿和馬鈴薯等多種植物中獲得了HPL的cDNA，并且發(fā)現(xiàn)除黃瓜HPL基因和甜瓜HPL基因的編碼產(chǎn)物同時具有9-HPL、13-HPL 催化功能外，其他已經(jīng)克隆出HPL基因的編碼產(chǎn)物只具有13-HPL功能［15］。劉苗苗等［16］發(fā)現(xiàn)13-CsHPL基因在受到非生物脅迫，如干旱、NaCl、甲基紫精、H2O2、損傷與外源激素MeJA、SA和灰霉侵染處理后其表達水平均顯著升高。Halitschke等［17］發(fā)現(xiàn)HPL表達水平較低的轉(zhuǎn)基因煙草在受到草食動物攻擊后，相關(guān)防御基因的表達量降低。在缺少HPL基因的馬鈴薯植株中發(fā)現(xiàn)蚜蟲的繁殖能力增加了2倍，表明HPL衍生物對蚜蟲性能有負面影響［18］。

脂肪酸的氧化需要借助脂氧合酶（LOX）、脂氫過氧化物裂解酶（HPL）的活性，在遭受逆境時，植株體內(nèi)脂肪酸衍生物含量會在短時間內(nèi)迅速升高（如短鏈揮發(fā)物質(zhì)醛醇等是主要的衍生物），相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)也不斷發(fā)生來抵抗脅迫對自身的損害。外施LOX-HPL途徑產(chǎn)物后，植物抵御逆境的能力得到提升，研究人員猜測這些組分可能直接參與逆境反應(yīng)，也可能作為植株自身或相鄰植株間傳遞信息的信號分子發(fā)生作用。根據(jù)前期試驗結(jié)果在黃瓜的LOX-HPL氧化途徑上篩選出CsLOX6基因和CsHPL2基因。在擬南芥上分別異源過表達這2個基因，同時對轉(zhuǎn)基因植株和突變體植株進行表型觀察和抗脅迫研究，探究這2個基因在抗逆過程及信號傳導中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥材料為哥倫比亞Col-0（WT），轉(zhuǎn)基因型擬南芥材料為實驗室前期過表達所得的轉(zhuǎn)基因植株（OE-CsLOX6、OE-CsHPL2），突變體型擬南芥材料（TB-Atlox5）購于Arashare（Non-profit Arabidopsis Share Center），檢索網(wǎng)站為www. Ara share.cn。

1.2 方法

1.2.1 代謝組和轉(zhuǎn)錄組測定 代謝組和轉(zhuǎn)錄組材料為野生型哥倫比亞Col-0和過表達得到的轉(zhuǎn)基因植株，保證相同的生長條件，待植株長至4周大小時，取葉片送至歐易生物科技有限公司進行代謝組和轉(zhuǎn)錄組測定。

1.2.2 生根分析 種植4種基因型（野生型1種、轉(zhuǎn)基因型2種、突變體型1種）擬南芥，從中各選取長勢、大小一致的植株，從穴盤中將擬南芥的根部取出（為減少對根部傷害可攜帶較多營養(yǎng)土），置于去離子水中輕柔洗凈，重復多次，盡量避免對根部的損傷，洗凈后統(tǒng)一置于吸水紙上吸除多余水分，留待后續(xù)的干、鮮重稱量以及根長分析。

1.2.3 葉綠素含量的測定 取0.1 g擬南芥葉片，剪碎后放入50 mL離心管中，加入20 mL 95%的乙醇，避光放置40 h，充分提取葉綠素。用95%的乙醇調(diào)零，在波長655、649、470 nm下測定吸光度。

1.2.4 熒光實時定量PCR（qPCR）分析 用Trizol法提取總RNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈，作為qPCR的模板。qRT-PCR反應(yīng)體系如表1所示，每個cDNA樣品進行3次獨立重復試驗。體系配置好后加入96孔板中，采用iQ?5多重實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）進行目的基因的擴增，反應(yīng)程序：95 ℃預變性30 s，40個循環(huán)（95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s），71個循環(huán)（95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s）。以黃瓜的持家基因Actin作為內(nèi)標，目的基因相對表達量的計算參照2-ΔΔCT法。

1.2.5 干旱和鹽處理 采用生長箱培養(yǎng)擬南芥，待長到一定大小時定植到穴盤（規(guī)格為6 cm × 6 cm × 5.5 cm）。穴盤的每行種植不同的基因型（共4個），每個基因型取正常生長的擬南芥定植于穴盤中，每穴5株，保證相同的生長條件，待植株長至一定大小時，選取長勢一致的植株進行處理，每個處理20株，3次重復。

干旱處理：對18 d苗齡的擬南芥進行處理，連續(xù)10 d不澆水，對照正常澆水，拍照留存并測定丙二醛含量。

鹽處理：對8 d苗齡的擬南芥進行處理，每2 d澆1次400 mmol/L的NaCl，用水作為對照，持續(xù)18 d，拍照留存并測定丙二醛含量。

1.2.6 丙二醛含量的測定 丙二醛含量可反映植物脂類過氧化程度和遭受逆境傷害的程度，丙二醛含量的測定參照《植物生理學實驗指導》［19］。

1.2.7 抗氧化酶活性的測定 采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒測定SOD、POD、CAT活性，測定步驟參見說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 16.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析，采用Duncan氏新復極差法進行多重比較及差異顯著性分析，采用Graphpad Prism 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型擬南芥生理指標的比較

為了比較不同基因型擬南芥的生理指標，將轉(zhuǎn)基因型、野生型和突變體型擬南芥種子播種于培養(yǎng)基上，長至一定大小移栽入穴盤，每個穴盤為1個重復，植株間混合取樣，至少設(shè)置3個重復。由圖2可知，在擬南芥定植后的生長過程中OE-CsLOX6的長勢明顯優(yōu)于其他基因型植株，生長旺盛，其他基因型長勢無明顯差別。進一步測定擬南芥的生理指標（圖3、表2），OE-CsLOX6的地上部鮮重和根長均顯著高于其他基因型植株，地下部鮮重明顯高于其他基因型植株；TB-Atlox5的地上部鮮重和地下部鮮重均顯著高于WT，但根長顯著低于WT；OE-CsHPL2的地上部鮮重、地下部鮮重和根長明顯低于其他基因型植株。葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量在不同基因型植株間無顯著差異。

2.2 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的代謝組分析

2.2.1 轉(zhuǎn)基因植株代謝物變化 為了全面分析CsLOX6基因和CsHPL2基因?qū)M南芥葉片代謝水平的影響，選取WT、OE-CsLOX6、OE-CsHPL2，利用GC-MS對樣品進行代謝組分析。采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法篩選組間差異代謝產(chǎn)物，篩選標準為OPLS-DA模型第一主成分的VIP>1，P<0.05。OE-CsLOX6、OE-CsHPL2與WT的代謝物含量存在較大差異（圖4、表3、表4）。OE-CsLOX6和WT有64個差異代謝物，其中有6個上調(diào)，58個下調(diào)，6個上調(diào)的代謝物是辛酸、尿嘧啶、月桂酸、亞精胺、精胺、褐煤酸；58個下調(diào)的代謝物主要是氨基酸和碳水化合物，如L-丙氨酸、戊氨酸、甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸鹽、β-丙氨酸、高絲氨酸、甲硫氨酸、焦谷氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬酰胺、2，6-二氨基庚二酸、谷氨酰胺、糖二酸、葡糖酮、果糖、D-塔格糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、乙基葡萄糖苷、麥芽三糖、葡糖酸、己糖二酸、蔗果三糖等。OE-CsHPL2和WT有63種差異代謝物，其中有9個上調(diào)，54個下調(diào)，9個上調(diào)的代謝物是辛酸、月桂酸、褐煤酸、尿嘧啶、胸腺嘧啶、喃葡萄糖、亞精胺、甘露糖基甘油酸、三糖；54個下調(diào)的代謝物主要是氨基酸和碳水化合物，如L-丙氨酸、戊氨酸、甘氨酸、乙酰絲氨酸、天冬氨酸鹽、丙氨酸、高絲氨酸、焦谷氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬酰胺、谷氨酰胺/葡萄糖-6-磷酸、糖二酸、葡糖酮、乙酰氨基己糖、乳糖醛酸、果糖、D-塔格糖、葡糖酸、己糖二酸等。

圖5顯示差異代謝物在野生型和轉(zhuǎn)基因型植株中的大致變化。差異表達程度極顯著的代謝物數(shù)量較少，在有顯著差異的代謝物中，下調(diào)表達占大多數(shù)。為了更直觀地展示不同樣本之間的關(guān)系及代謝物在不同樣本之間的表達差異，對所有顯著差異的代謝物進行層次聚類（Hierarchical clustering），如圖6所示，在未受脅迫處理時，與野生型植株相比，OE-CsLOX6和OE-CsHPL2中多數(shù)代謝物含量有所降低。

2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株代謝通路變化 通過對差異代謝物進行通路富集分析，有助于理解在差異樣品中代謝途徑變化機制。利用差異代謝物的KEGG ID進行通路富集分析，獲得代謝通路富集結(jié)果。應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個背景相比在顯著性差異表達代謝物中顯著富集的pathway條目，其計算公式如下。

式中，P為該代謝通路的超幾何檢驗；i為求和指標；N為代謝物總數(shù)；n為N中差異表達代謝物的數(shù)量；M為某特定pathway的代謝物數(shù)量；m為注釋為某特定pathway的差異代謝物數(shù)量。以P≤0.05為闕值，滿足此條件的pathway為在差異代謝物中顯著富集的pathway。P越小，表示該代謝通路的差異性越顯著。

由圖7可知，CsLOX6基因過表達會使擬南芥體內(nèi)代謝物發(fā)生顯著變化，植株中ABC轉(zhuǎn)運蛋白、谷胱甘肽代謝、氨基酸生物合成、β-丙氨酸代謝、甘氨酸絲氨酸和蘇氨酸代謝、氨?；?tRNA生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等途徑發(fā)生變化。而CsHPL2基因過表達會引起擬南芥植株中嘧啶代謝、谷胱甘肽代謝、精氨酸生物合成、嘌呤代謝、β-丙氨酸代謝、賴氨酸生物合成、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸生物合成、甘氨酸絲氨酸和蘇氨酸代謝、賴氨酸降解等途徑發(fā)生變化。由此可見，過表達CsLOX6基因、CsHPL2基因的植株有相似的代謝通路，除影響一些轉(zhuǎn)運蛋白外，主要與谷胱甘肽代謝和氨基酸的合成代謝等有關(guān)。

2.3 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)錄組分析

2.3.1 不同基因型植株差異基因表達分析 為了深入分析轉(zhuǎn)基因型和野生型擬南芥在轉(zhuǎn)錄水平的差異，通過轉(zhuǎn)錄組比較野生型和轉(zhuǎn)基因型植株葉片中的轉(zhuǎn)錄變化，利用DESeq軟件，以Fold Change ≥ 2和P≤0.05為篩選標準，在野生型和轉(zhuǎn)基因型植株中篩選差異基因。結(jié)果（表5、圖8）表明，在OE-CsLOX6和WT中共發(fā)現(xiàn)280個差異基因，其中顯著上調(diào)的差異基因有112個，顯著下調(diào)的差異基因有168個。112個顯著上調(diào)的差異基因中，有22個與植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)，其中乙烯相關(guān)11個、生長素相關(guān)3個、脫落酸相關(guān)4個、茉莉酸相關(guān)4個，根據(jù)激素數(shù)量，受影響最顯著的是乙烯，其次是脫落酸、茉莉酸、生長素；有7個基因與脂類代謝途徑相關(guān)；14個基因與細胞壁生長相關(guān)；12個基因與非生物脅迫（干旱、鹽）相關(guān)。

在OE-CsHPL2和WT中共發(fā)現(xiàn)616個差異基因，其中顯著上調(diào)的差異基因有259個，顯著下調(diào)的差異基因有357個。OE-CsLOX6和WT組、OE-CsHPL2和WT組之間的共有及特有的差異基因如圖8所示，2組共有的差異基因有170個。259個顯著上調(diào)的差異基因中，有45個與植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)，其中乙烯相關(guān)16個，生長素相關(guān)8個，脫落酸相關(guān)12個，茉莉酸相關(guān)9個，根據(jù)激素數(shù)量，受影響最顯著的是乙烯，其次是脫落酸、茉莉酸、生長素；有7個基因與脂類代謝途徑相關(guān)；30個基因與細胞壁生長相關(guān)；16個基因與非生物脅迫（干旱、鹽）相關(guān)。

2.3.2 不同基因型植株差異基因GO富集分析 為了進一步了解差異基因的功能，對得到的差異基因進行GO富集分析，對功能進行描述。在OE-CsLOX6和WT中發(fā)現(xiàn)280個差異基因，其功能主要與乙烯信號通路、茉莉酸響應(yīng)、機械損傷、花粉發(fā)育、滲透響應(yīng)、脂質(zhì)分解、Karrikins信號通路、脫落酸信號通路、氨基酸代謝、細胞壁等有關(guān)（圖9a）。在OE-CsHPL2和WT中有616個差異基因，其功能主要與機械損傷、茉莉酸響應(yīng)、乙烯信號通路、Karrikins信號通路、脅迫應(yīng)激反應(yīng)（溫度、滲透、鹽脅迫）、脫落酸信號通路、氧化還原酶、細胞壁等有關(guān)（圖9b）。

2.3.3 不同基因型對生長發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)相關(guān)基因的響應(yīng) LOX和HPL都是脂類氧化途徑的關(guān)鍵酶，在芳香物質(zhì)的合成消耗中扮演重要角色，乙烯、生長素在植株生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。由表6可知，2組的差異基因與脂肪酸代謝、激素代謝（激素合成、運輸及信號轉(zhuǎn)導）、環(huán)境適應(yīng)有關(guān)，其中激素主要為乙烯，環(huán)境適應(yīng)主要為鹽和干旱?；蜻^表達會影響轉(zhuǎn)基因型植株體內(nèi)脂肪酸和激素的代謝過程，在正常生長時，有些與環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的基因就已經(jīng)發(fā)生顯著變化，這些基因可能在脅迫過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.4 干旱和鹽脅迫對過表達擬南芥的影響

為了驗證不同基因型擬南芥對非生物脅迫的抵抗能力，本研究進行了干旱和鹽脅迫處理，驗證過表達CsLOX6和CsHPL2是否能促進擬南芥對干旱和鹽脅迫的抗性，如圖10所示。

擬南芥幼苗生長的影響

2.4.1 過表達CsLOX6和CsHPL2對擬南芥細胞膜損傷的影響 植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度?？赏ㄟ^MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。由圖11、圖12可知，在正常生長條件下，不同基因型植株的丙二醛含量表現(xiàn)出明顯差異，TB-Atlox5的丙二醛含量最高，WT次之，OE-CsLOX6和OE-CsHPL2的含量較低。在鹽脅迫下，擬南芥生長受到嚴重的抑制，TB-Atlox5的丙二醛含量明顯高于其他基因型植株，受到的膜損傷最大，WT次之，OE-CsLOX6和OE-CsHPL2受到的膜損傷較小。在干旱脅迫下，WT的葉片受損嚴重，葉片卷曲且長勢較弱，OE-CsLOX6的長勢要優(yōu)于其他基因型植株。

2.4.2 過表達CsLOX6和CsHPL2對擬南芥抗氧化酶活性的影響 SOD、POD、CAT在清除活性氧、緩解逆境脅迫方面發(fā)揮重要作用。不同基因型擬南芥抗氧化酶活性測定結(jié)果（圖13）顯示，在正常條件下，不同基因型擬南芥的SOD活性和POD活性均差異不顯著，OE-CsLOX6、OE-CsHPL2的CAT活性差異不顯著，但均顯著高于野生型和突變體型。鹽脅迫下，所有株系的抗氧化酶活性與對照相比均明顯上升，OE-CsLOX6上升最明顯；OE-CsHPL2的SOD活性和CAT活性均顯著高于WT，OE-CsHPL2的POD活性與WT無顯著差異；TB-Atlox5的SOD活性和CAT活性顯著高于WT，TB-Atlox5的POD活性顯著低于WT。干旱脅迫下，OE-CsLOX6、OE-CsHPL2和TB-Atlox5的酶活性均顯著高于WT；OE-CsLOX6的酶活性最高，OE-CsLOX6的SOD活性和POD活性顯著高于TB-Atlox5；OE-CsHPL2與TB-Atlox5的酶活性無顯著差異。

3 討論

對過表達轉(zhuǎn)基因型植株、突變體型植株和野生型植株進行代謝組和轉(zhuǎn)錄組測序，通過比較分析，過表達CsLOX6基因、CsHPL2基因的植株有相似的代謝通路，與植物信號轉(zhuǎn)導、脂肪酸合成和轉(zhuǎn)運、氨基酸代謝、抵御逆境有著密切關(guān)系。有機酸和氨基酸的積累對植物有重要影響，可以提高植物對干旱脅迫的耐受性［20］。氨基酸通過一些代謝途徑比如脫氨基、脫羧基可以轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛲任镔|(zhì)，如丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、絲氨酸是丙酮酸的中間產(chǎn)物，組氨酸、精氨酸、脯氨酸等是α-酮戊二酸的中間產(chǎn)物，苯丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸是延胡索酸的中間產(chǎn)物。氨基酸是三羧酸循環(huán)中多種物質(zhì)的前體，轉(zhuǎn)基因型擬南芥與野生型相比，多數(shù)代謝物含量有所降低。β氧化是脂肪酸在一系列酶的作用下，生成含有兩個碳原子的乙酰輔酶A，是脂肪酸分解的主要方式，在此過程中游離出的乙酰CoA會經(jīng)三羧酸循環(huán)而氧化［21］。Karrikins與植物激素獨腳金內(nèi)酯在結(jié)構(gòu)、信號傳導通路等方面具有非常高的相似性，除促進種子萌發(fā)外，還具有調(diào)控植物光形態(tài)建成、葉片發(fā)生過程等生物學功能［22］。很多基因響應(yīng)了Karrikins信號通路，可能與轉(zhuǎn)基因植株長勢旺盛有關(guān)。過表達脂氧合酶基因和脂氫過氧化物酶基因與體內(nèi)各代謝途徑的關(guān)系還有待于進一步驗證。

轉(zhuǎn)基因植株在耐鹽和耐旱方面表現(xiàn)出較好的耐受力，OE-CsLOX6的表現(xiàn)更好，而TB-Atlox5和WT表現(xiàn)較差。過表達13-脂氧合酶基因TomloxD的番茄植株中脂氧合酶活性和內(nèi)源激素茉莉酸含量增加，提高了對病原菌和高溫的耐受性［23］。陳璐等［24］對野生型、 AtLOX1的突變體型擬南芥施用0.3 mol/L的甘露醇模擬干旱，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能顯著提高擬南芥AtLOX1基因的表達并促進種子的萌發(fā)。在擬南芥中過表達辣椒CaLOX1去探究CaLOX1在滲透、干旱和高鹽度條件下的功能，干旱和高鹽度處理辣椒葉片后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強的耐受性，H2O2積累更少，ABA相關(guān)標記基因表達水平升高，同時，種子萌發(fā)和幼苗的發(fā)育對逆境的耐受性也更強，表明CaLOX1通過調(diào)控脂質(zhì)氧化活性、過氧化氫含量、脫落酸含量等代謝途徑來緩解脅迫對植株的傷害［25］，轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量低，受到的脅迫損傷小，體內(nèi)酶促清除系統(tǒng)被激活，表明過表達CsLOX6基因和CsHPL2基因能在一定程度上降低膜損傷，提高植株在逆境脅迫下的耐受力，而TB-Atlox5在干旱脅迫下表現(xiàn)出比野生型植株更強的耐受性，與OE-CsHPL2的表現(xiàn)相似，由于擬南芥含有多個脂氧合酶基因，因此推測Atlox5缺失后引起其他同源基因表達量的變化，發(fā)揮了Atlox5原有的功能。目前對于脂氧合酶基因的研究大多側(cè)重在產(chǎn)生茉莉酸的LOX-AOS通路上，而脂氫過氧化物裂解酶基因的研究集中在增加植物的揮發(fā)性氣體方面，如花卉類［26］、生菜［27］、瓜類［16］等對氣味、品質(zhì)要求較高的植物。

在擬南芥定植后的生長過程中OE-CsLOX6的長勢明顯優(yōu)于其他基因型植株，生長旺盛，其他基因型長勢無明顯差別。進一步測定擬南芥的生理指標，OE-CsLOX6的地上部鮮重和根長均顯著高于其他基因型植株，地下部鮮重明顯高于其他基因型植株；TB-Atlox5的地上部鮮重和地下部鮮重均顯著高于WT，但根長顯著低于WT；OE-CsHPL2的地上部鮮重、地下部鮮重和根長明顯低于其他基因型植株。葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量在不同基因型植株間無顯著差異。

4 小結(jié)

在擬南芥中異源過表達CsLOX6基因和CsHPL2基因?qū)χ仓晟L以及對干旱和鹽脅迫抗性具有明顯影響。OE-CsLOX6的地上部鮮重和根長均顯著高于其他基因型植株，地下部鮮重明顯高于其他基因型植株；OE-CsHPL2的地上部鮮重、地下部鮮重和根長明顯低于其他基因型植株。OE-CsLOX6、OE-CsHPL2與WT的代謝物含量存在較大差異，OE-CsLOX6和WT有64個差異代謝物，其中有6個上調(diào)，58個下調(diào)；OE-CsHPL2和WT有63個差異代謝物，其中有9個上調(diào)，54個下調(diào)。過表達CsLOX6基因和CsHPL2基因可以提高擬南芥對鹽脅迫和干旱脅迫的抗性。在鹽脅迫和干旱脅迫下，OE-CsLOX6、OE-CsHPL2的丙二醛含量要顯著低于野生型植株，膜質(zhì)過氧化程度低，SOD、POD和CAT活性要明顯高于野生型，提高了植株的抗氧化能力，葉片長勢明顯優(yōu)于野生型植株。

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收稿日期：2023-11-05

基金項目：國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-23-B07）；國家自然科學基金項目（31672203）；國家重點研發(fā)計劃支持項目（2023YFD2300703）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團隊項目（BAIC-2024）

作者簡介：王 聰（1995-），女，河北石家莊人，碩士，主要從事蔬菜栽培與生理研究，（電話）18803219590（電子信箱）wangcong333333@163.com；通信作者，蔣衛(wèi)杰（1965-），男，北京人，研究員，主要從事蔬菜栽培生理和無土栽培研究，（電子信箱）jiangweijie@caas.cn。