摘要為明確鏈霉菌YC117對(duì)煙草黑脛病的防控效果及活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA基因序列測(cè)定等方法對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，并測(cè)定了鏈霉菌YC117的抑菌譜、對(duì)煙草疫霉菌絲形態(tài)的影響、發(fā)酵液的穩(wěn)定性及盆栽防效。菌株YC117經(jīng)鑒定確定為婁徹氏鏈霉菌Streptomyces rochei，具有很好的廣譜抑菌活性，該菌株或其分泌物能夠破壞煙草疫霉菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使菌絲出現(xiàn)斷裂、干癟、堆積，分枝增多和大小不一，細(xì)胞壁受損等現(xiàn)象。YC117菌劑在稀釋100倍和200倍濃度下對(duì)煙草黑脛病的盆栽防效分別為61.54%和50.77%。發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對(duì)酸堿和熱處理表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，但是對(duì)紫外照射比較敏感，紫外光照射20 min后，抑制率下降至9.52%。鏈霉菌YC117為防控?zé)煵莺诿劜∩乐苿┑拈_(kāi)發(fā)提供了理論支持，具有較好的生防應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞婁徹氏鏈霉菌YC117;煙草黑脛病;鑒定;抑菌活性;穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào)：S 435.72文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023588Control efficacy of Streptomyces YC117 against tobacco black shank

disease and the stability of its active substancesYAO Jingwu ZHAO Yanan LI Yanyan WANG Hancheng YUAN Qinfeng YANG Dan

HUANG Daye CAO Chunxia（1. Hubei Biopesticide Engineering Research Center， National Biopesticide Engineering Research Center，

Wuhan430064， China; 2. Huazhong Agricultural University， Wuhan430070， China; 3. Hubei Academy of

Tobacco Science， Wuhan430030， China; 4. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang550081， China）AbstractTo clarify the efficacy of Streptomyces YC117 in controlling tobacco black shank disease and the stability of its active substances， the strain was identified based on morphological， physiological， and biochemical characteristics， and 16S rRNA gene sequencing. The antibacterial spectrum of Streptomyces YC117 was measured， its effect on mycelium morphology of Phytophthora nicotianae was observed， and the stability of its fermentation broth was explored. In addition， its effectiveness in preventing disease in potted plants was determined. The results showed that strain YC117 was identified as Streptomyces rochei. Streptomyces YC117 exhibited broad-spectrum antibacterial activity， disrupting the morphological structure of P.nicotianae hyphae by causing fragmentation， shrinkage， increased branching， and damage to the cell wall. The potted plant experiments demonstrated control effect of 61.54% and 50.77% against tobacco black shank disease at dilutions of 100 and 200 times， respectively. The antibacterial active substances produced by fermentation showed good stability under acid and basic conditions as well as heat treatment， but they exhibited sensitivity to UV irradiation. After 20 minutes of UV irradiation， the inhibition rate decreased to 9.52%. Streptomyces YC117 holds promise for the development of biocontrol agents against tobacco black shank disease， providing foundational support for biocontrol applications.

Key wordsStreptomyces rochei YC117;tobacco black shank disease;identification;antibacterial activity;stability由煙草疫霉Phytophthora nicotianae引起的煙草黑脛病是煙草上具有毀滅性的土傳真菌病害，該病害在煙草的整個(gè)生育期均可發(fā)生，其中以大田期發(fā)病為主，危害部位主要為煙草根莖部，其田間發(fā)病率在15%左右，嚴(yán)重時(shí)達(dá)75%，甚至絕收，我國(guó)每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1億元以上［14］?；瘜W(xué)農(nóng)藥防治具有高效、便捷、迅速的特點(diǎn)，是目前防治煙草黑脛病的主要手段，但是大量施用不僅會(huì)對(duì)人類(lèi)和環(huán)境造成危害，還會(huì)使煙草黑脛病菌抗性增加，防治效果降低［1］。胡燕等［5］測(cè)定了烯酰嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌繼代培養(yǎng)物的毒力，發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性隨培養(yǎng)代數(shù)增加而增加。彭麗娟等［6］發(fā)現(xiàn)，貴州省大部分地區(qū)的煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的敏感性降低，抗性增加，建議輪換或停止施用甲霜靈。

放線(xiàn)菌在土壤中分布廣泛且數(shù)量眾多，約占土壤微生物群落的10%～50%，可以產(chǎn)生許多具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，在生物防治植物病害方面具有重要地位［7］。目前，已有不少學(xué)者開(kāi)展了新型鏈霉菌及其抑菌活性產(chǎn)物的相關(guān)研究。Chen等［8］通過(guò)盆栽防效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鏈霉菌FT05W和ZEA17I對(duì)煙草黑脛病菌具有較好的抑制作用，抑制率分別為68.82% 和76.18%。張潛等［9］通過(guò)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌Sa-21菌株發(fā)酵液對(duì)苗期和成株期煙草黑脛病有較好的抑制效果，相對(duì)防效分別為96.41%和98.39%。鄒朔飛等［10］經(jīng)過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)和田間防效試驗(yàn)，篩選得到一株郝氏鏈霉菌Streptomyces halstedii MT35，其對(duì)煙草黑脛病菌有良好的抑菌效果，抑制率和防治效果分別為88.46%和75.3%。黃大躍［3］分離、篩選和鑒定到了一株鏈霉菌F-7，該菌株及其發(fā)酵液對(duì)煙草黑脛病菌菌絲的生長(zhǎng)均有較強(qiáng)的抑菌活性，抑制率分別為75%和81.41%。

在研發(fā)新型生物制劑時(shí)，除關(guān)注菌株的抑菌活性外，還需考慮其抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性、貯藏、生產(chǎn)等條件。但是目前對(duì)于鏈霉菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性報(bào)道相對(duì)較少，為進(jìn)一步擴(kuò)大鏈霉菌資源的開(kāi)發(fā)利用，本實(shí)驗(yàn)室前期從煙草植株根際分離出一株對(duì)煙草疫霉具有拮抗作用的鏈霉菌菌株YC117，本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA基因序列測(cè)定等方法對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，研究鏈霉菌YC117的抑菌譜、對(duì)煙草疫霉菌絲形態(tài)的影響、發(fā)酵代謝液的穩(wěn)定性和盆栽防效，以期為煙草黑脛病的防治提供參考，也為后期該菌株生物制劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

供試菌株：Streptomyces YC117，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心篩選獲得并保藏，CCTCC No： M20211692。

供試病原真菌：煙草黑脛病菌（煙草疫霉）Phytophthora nicotianae，煙草赤星病菌Alternaria alternata，水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani，草莓灰霉病菌Botrytis cinerea，辣椒疫病菌Phytophthora capsici，枸杞根腐病菌Fusarium solani，番茄棒孢葉斑病菌Corynespora cassiicola，茶輪斑病菌Pestalotiopsis theae，生菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum，煙草根腐病菌Fusarium oxysporum，煙草炭疽病菌Colletotrichum destructivum，棉花黃萎病菌Verticillium dahliae等12種病原真菌均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心提供。

1.1.2供試培養(yǎng)基

V8培養(yǎng)基：V8汁220 mL，碳酸鈣2 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL;種子培養(yǎng)基：甘露醇20 g，大豆蛋白胨10 g，碳酸鈣0.5 g，磷酸氫二鉀0.35 g，蒸餾水1 000 mL;發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，葡萄糖10 g，棉籽粉25 g，酵母粉3 g，碳酸鈣5 g，氯化鈉2 g，蒸餾水1 000 mL;其他培養(yǎng)基包括高氏1號(hào)固/液體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和ISP2培養(yǎng)基［10］。

1.1.3供試微生物菌劑及煙草品種

109 cfu/g枯草芽胞桿菌微囊粒劑由成都特普生物科技股份有限公司生產(chǎn)。供試煙草品種為‘云煙87’。

1.2菌株YC117的抑菌譜測(cè)定

參照單宇航［11］的平板對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)菌株YC117進(jìn)行抑菌譜測(cè)定。打取直徑4 mm的YC117菌餅置于PDA平板中心兩側(cè)，相距4 cm，于28℃培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)48 h后，在中心處接直徑4 mm病原菌菌餅，對(duì)照組為PDA平板中央僅接病原菌，每個(gè)處理重復(fù)3次，于25～28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～10 d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑制率。

抑制率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100%。

1.3鏈霉菌YC117的鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

用接種環(huán)刮取菌株YC117在ISP2平板上劃線(xiàn)，28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)特征，并參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》等對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特性測(cè)定［1213］。

1.3.216S rRNA基因序列分析

采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株YC117的DNA。以引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對(duì)菌株YC117的16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增［14］。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min;12℃保溫5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)后送湖北擎科生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI進(jìn)行同源序列比對(duì)，并利用MEGA 7.0軟件的neighbor-joining法構(gòu)建菌株YC117的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4鏈霉菌YC117對(duì)煙草疫霉菌絲形態(tài)的影響

1.4.1光學(xué)顯微鏡觀察

結(jié)合1.2平板對(duì)峙培養(yǎng)法，在接菌之前先鋪設(shè)滅菌的玻璃紙，再接鏈霉菌YC117和煙草疫霉菌餅，對(duì)照組為只接種煙草疫霉，密封后放于28℃培養(yǎng)箱對(duì)峙培養(yǎng)5 d，將對(duì)峙培養(yǎng)和對(duì)照組邊緣的煙草疫霉菌絲塊切下，置于光學(xué)顯微鏡下觀察煙草疫霉菌絲形態(tài)的變化并拍照。

1.4.2掃描電鏡觀察

參照胡春輝等［15］掃描電鏡生物樣本的制備方法，重復(fù)1.4.1的取樣操作，在掃描電鏡下觀察煙草疫霉菌絲形態(tài)并拍照。

1.5鏈霉菌YC117對(duì)煙草黑脛病的盆栽防效測(cè)定

1.5.1鏈霉菌YC117菌劑的制備

參考王靜等［16］制備發(fā)酵液的方法，刮取斜面上生長(zhǎng)良好的鏈霉菌YC117于ISP2培養(yǎng)基上均勻劃線(xiàn)后，于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。用直徑4 mm的打孔器打取1塊菌餅接種于種子培養(yǎng)基，每500 mL三角瓶?jī)?nèi)裝液量為200 mL，于28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，即得YC117種子液。以10%的接種量將鏈霉菌YC117種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每2.5 L三角瓶?jī)?nèi)裝液量為500 mL，于28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，即得YC117發(fā)酵液。將YC117發(fā)酵液與無(wú)菌的珍珠巖按4∶1拌均勻，待其風(fēng)干后使用粉碎機(jī)打碎成粉劑，稀釋計(jì)數(shù)得到菌濃度為1.29×108 cfu/g的YC117菌劑，備用。

1.5.2煙草疫霉菌懸液的制備

將斜面上活化好的煙草疫霉菌餅接于V8產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，密封后光照培養(yǎng)14 d，用無(wú)菌水處理后刮取V8培養(yǎng)基上的煙草疫霉菌絲，4℃下放置20 min，之后室溫放置20 min，使其釋放游動(dòng)孢子，經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾除雜后，稀釋即得1×106cfu/mL煙草疫霉菌懸液，備用。

1.5.3鏈霉菌YC117防控?zé)煵莺诿劜≡囼?yàn)

參照王萬(wàn)能等［17］培育煙苗的方法，于26～28℃溫室中光照培養(yǎng)，待‘云煙87’出苗后移栽。在煙苗長(zhǎng)至6～7片葉時(shí)挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗隨機(jī)分成4組，即CK：清水，T1：YC117菌劑與水的比例為1 g∶100 mL（稀釋100倍），T2：YC117菌劑與水的比例為1 g∶200 mL（稀釋200倍），T3：1億cfu/g枯草芽胞桿菌與水的比例為1 g∶300 mL（稀釋300倍），每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)12株煙苗。YC117菌劑、枯草芽胞桿菌和煙草疫霉接種方法均采用刺傷灌根接種。共施藥兩次，每次20 mL/缽，CK施等量清水;第2次施藥與第1次間隔3 d，在第2次施藥后3 d，接煙草疫霉菌懸液，5 mL/缽。于接種后15 d開(kāi)始調(diào)查并記錄煙苗發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

煙草黑脛病的分級(jí)參照中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)—煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法（GB/T 23222-2008）：0級(jí)，全株無(wú)病;1級(jí)，莖部病斑不超過(guò)莖圍的1/3或1/3以下葉片凋萎;3級(jí)，莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3至1/2或1/3至1/2葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑;5級(jí)，莖部病斑超過(guò)莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍或1/2至2/3葉片凋萎;7級(jí)，莖部病斑全部環(huán)繞莖圍或2/3以上葉片凋萎;9級(jí)，病株基本死亡［18］。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%;

病情指數(shù)=∑（病級(jí)值×該級(jí)病株數(shù)）/（病級(jí)最高值×調(diào)查總株數(shù)）×100;

防效=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100%。

1.6鏈霉菌YC117發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定1.6.1鏈霉菌YC117無(wú)菌發(fā)酵液的制備

將鏈霉菌YC117在高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基上活化，放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，用直徑4 mm的打孔器打取1塊菌餅于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，為鏈霉菌YC117種子液。將鏈霉菌YC117的種子液以6%的接種量接于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，得到鏈霉菌YC117的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。將YC117的基礎(chǔ)培養(yǎng)液在11 000 r/min下離心10 min，取其上清液，過(guò)直徑0.22 μm的微孔濾膜，即為鏈霉菌YC117的無(wú)菌發(fā)酵液，備用。

1.6.2鏈霉菌YC117發(fā)酵液的穩(wěn)定性測(cè)定

1.6.2.1酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用1.0 mol/L的HCl溶液和1.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)鏈霉菌YC117發(fā)酵液的pH值，分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，將不同pH的發(fā)酵液于室溫下靜置30 min后，再將pH調(diào)至7.0，離心后用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾制備不同pH下處理的無(wú)菌發(fā)酵液，采用生長(zhǎng)速率法檢測(cè)其抑菌活性。

1.6.2.2熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將鏈霉菌YC117無(wú)菌發(fā)酵液置于裝液量10 mL/15 mL的離心管中，再分別置于40、50、60、70、80、90、100℃的水浴鍋中，水浴處理時(shí)間為30 min，取出后于室溫下冷卻，以未經(jīng)熱處理的無(wú)菌發(fā)酵液為對(duì)照，檢測(cè)其抑菌活性。

1.6.2.3紫外照射穩(wěn)定性試驗(yàn)

取10 mL鏈霉菌YC117無(wú)菌發(fā)酵液于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，開(kāi)蓋后置于磁力攪拌器上，將其放置在距離紫外燈管（UV-C， 45W）垂直25 cm處，照射時(shí)間分別為0、1、2、3、4、5、10、15 min和20 min，其中以照射時(shí)間0 min為對(duì)照，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 26和Excel 2016統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1鏈霉菌YC117的抑菌譜

菌株YC117對(duì)除煙草根腐病菌外的11種供試病原菌均具有一定的抑菌活性（表1）。其中，對(duì)煙草黑脛病菌（圖1i）、辣椒疫病菌（圖1f）、生菜菌核病菌（圖1b）的生長(zhǎng)抑制作用非常明顯，抑制率分別高達(dá)92.94%、90.20%和85.49%。對(duì)茶輪斑病菌、煙草炭疽病菌、草莓灰霉病菌、煙草赤星病菌的抑制率也均在60%以上。表明菌株YC117的抑菌譜比較廣。

2.2鏈霉菌YC117的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性

菌株YC117形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2，YC117在ISP2培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后菌落形狀呈無(wú)規(guī)則圓形，中央有灰白色褶皺狀凸起，邊緣有白色放射狀菌絲，基內(nèi)菌絲黃色，可溶性色素黃色;在100倍和1 000倍顯微鏡下觀察到孢子絲直或柔曲，孢子橢圓形。

如表2所示，菌株YC117能夠利用D-果糖、D-山梨醇、D-半乳糖、D-麥芽糖、蔗糖等多種碳源，但是不能利用D-乳糖;可以較好地利用D-天冬氨酸、D-絲氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-谷氨酸，但對(duì)L-焦谷氨酸的反應(yīng)結(jié)果為陰性;菌株YC117有耐鹽性，在NaCl含量為8%的培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)。參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《放線(xiàn)菌的分類(lèi)和鑒定》，綜合分析菌株YC117的形態(tài)特征及生理生化特性，初步確定該菌株屬于鏈霉菌屬Streptomyces。

2.2.2鏈霉菌YC117的分子生物學(xué)鑒定

將菌株YC117 16S rRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與已有序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，通過(guò)MEGA 7.0軟件以neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3），發(fā)現(xiàn)該菌株與Streptomyces rochei 173342共聚一支，相似性達(dá)100%。綜上，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特性和分子鑒定結(jié)果，將菌株YC1171鑒定為婁徹氏鏈霉菌Streptomyces rochei。

2.3鏈霉菌YC117對(duì)煙草疫霉菌絲形態(tài)的影響

通過(guò)光學(xué)顯微鏡可以觀察到對(duì)照組的煙草疫霉菌絲細(xì)長(zhǎng)、大小均勻、表面光滑、分枝正常;而與菌株YC117對(duì)峙培養(yǎng)后，處理組煙草疫霉菌絲膨大增多，菌絲畸形嚴(yán)重、分枝增多而短?。▓D4）。

經(jīng)掃描電鏡觀察，正常生長(zhǎng)的煙草疫霉菌絲形態(tài)飽滿(mǎn)、圓潤(rùn)，粗細(xì)均勻，分枝正常（圖5a），而平板對(duì)峙培養(yǎng)中受抑制菌落邊緣的菌絲形態(tài)與對(duì)照相比發(fā)生很大的變化，菌絲皺縮干癟、堆積、粗細(xì)不均，部分菌絲對(duì)折生長(zhǎng)（圖5b），細(xì)胞壁受損明顯，菌絲分枝增多（圖5c），表明YC117菌株或其分泌物能夠破壞煙草疫霉菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。

2.4鏈霉菌YC117對(duì)煙草黑脛病的盆栽防效

菌株YC117對(duì)煙草黑脛病的盆栽防控效果如表3所示，與CK相比，菌株YC117菌劑稀釋100倍、200倍處理和枯草芽胞桿菌稀釋300倍處理均能有效地防治煙草黑脛病，其防治效果分別為61.54%、50.77%和76.92%，煙草病情指數(shù)分別降低了61.5%、50.8%和76.9%，發(fā)病率也分別降低了44.44、41.67百分點(diǎn)和55.55百分點(diǎn)（表3）。說(shuō)明，菌株YC117對(duì)煙草黑脛病具有良好的防治效果。

2.5鏈霉菌YC117的抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性

2.5.1酸堿穩(wěn)定性

將經(jīng)過(guò)不wwWS1ikGLgwFjll9rZwgMg==同pH處理得到的鏈霉菌YC117無(wú)菌發(fā)酵液與煙草疫霉做對(duì)峙試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。菌株YC117發(fā)酵液在pH 8時(shí)抑菌活性最大，抑制率為60%，說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)在弱堿性條件下穩(wěn)定性比較好;當(dāng)pH為 4和10時(shí)，抑制率分別為54.32%和51.60%;當(dāng)發(fā)酵液處于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，即pH 2和12時(shí)，抑制率分別為49.63%和47.16%，說(shuō)明在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境中，菌株YC117發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)仍具有較高的抑菌活性，這可能是因?yàn)槠浒l(fā)酵液中存在或者產(chǎn)生了一些酸堿緩沖物質(zhì)，使抑菌活性物質(zhì)對(duì)酸堿變化影響具有很好的穩(wěn)定性。

2.5.2熱穩(wěn)定性

由圖7可知，菌株YC117發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的抑菌活性隨著溫度上升而逐漸降低。當(dāng)處理溫度為40℃時(shí)，抑菌活性表現(xiàn)最好，對(duì)煙草疫霉的抑制率為61.90%;當(dāng)處理溫度低于60℃時(shí)，其抑菌活性與對(duì)照相當(dāng);當(dāng)溫度處于100℃時(shí)，菌株YC117發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)仍具有較高的抑菌活性，抑制率為52.41%。說(shuō)明菌株YC117產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.5.3紫外光照射穩(wěn)定性

由圖8可見(jiàn)，與未經(jīng)紫外光照射組的菌株YC117發(fā)酵液相比，經(jīng)紫外光照射后的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉的抑制作用明顯降低。當(dāng)紫外光照射1 min，抑制率降至35.59%;照射5 min，抑制率降至25.31%;照射20 min，抑制率下降至9.52%。說(shuō)明該抑菌活性物質(zhì)對(duì)紫外光照射比較敏感，穩(wěn)定性不高。

以上結(jié)果表明，鏈霉菌YC117發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)對(duì)強(qiáng)酸（pH=2）和強(qiáng)堿（pH=12）的耐受性、穩(wěn)定性都很高，弱堿（pH=8）條件下抑菌活性最高，但對(duì)60℃以上高溫比較敏感，紫外光照射1 min后抑菌活性開(kāi)始明顯降低，照射20 min后抑菌活性幾乎喪失。

3結(jié)論與討論

在植物病害生物防治中，鏈霉菌屬是一類(lèi)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)價(jià)值的微生物，是生物制劑研發(fā)的重要來(lái)源［14］。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA基因序列測(cè)定等方法鑒定菌株YC117為婁徹氏鏈霉菌Streptomyces rochei，該菌株具有廣譜抑菌活性，對(duì)11種供試病原真菌有較強(qiáng)的抑菌效果，其中對(duì)煙草黑脛病菌的拮抗效果最好，抑制率達(dá)92.94%。在盆栽防效試驗(yàn)中，鏈霉菌YC117菌劑稀釋100倍處理后對(duì)煙草黑脛病有較好的防治效果，防治效果達(dá)61.54%，表明該菌株具有良好的應(yīng)用潛力和使用價(jià)值。通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)法觀察發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌YC117能夠破壞煙草疫霉菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使菌絲出現(xiàn)斷裂、干癟、堆積，分枝增多和粗細(xì)不均，細(xì)胞膜受損等現(xiàn)象，這與張潛等［9］的研究結(jié)果一致，可能是鏈霉菌YC117分泌的某些溶解病原細(xì)胞壁的酶的作用結(jié)果，通過(guò)破壞煙草疫霉菌絲的生理結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)煙草疫霉菌絲的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用;黃寧珍等［19］的研究還發(fā)現(xiàn)，抗病活性物質(zhì)可能主要為蛋白質(zhì)類(lèi)化合物， 除此外還有一些非蛋白因子能抑制煙草疫霉菌絲生長(zhǎng);覃可等［20］也發(fā)現(xiàn)鏈霉菌FT05W能產(chǎn)生多種有益次生代謝產(chǎn)物和酶，對(duì)煙草黑脛病有良好的拮抗作用，對(duì)于生物防治煙草黑脛病提供一定的科學(xué)依據(jù)。

生防制劑的研發(fā)不僅要考慮抑菌效果，還要考慮抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性、生產(chǎn)的安全性、儲(chǔ)運(yùn)的便捷性、適用的廣泛性等問(wèn)題［21］。在自然條件下使用時(shí)，拮抗微生物產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)常受到溫度、光照、土壤pH等條件的影響。目前，對(duì)于鏈霉菌代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究報(bào)道相對(duì)較少。呂昂等［22］測(cè)定了鏈霉菌3-10發(fā)酵液的提取物對(duì)80℃以上的高溫、堿性（pH8～13）環(huán)境和紫外線(xiàn)照射比較敏感，紫外線(xiàn)照射20 min對(duì)病菌抑制率下降至9.7%。賴(lài)寶春等［23］報(bào)道了小串鏈霉菌Streptomyces catenulae XG40發(fā)酵液的抑菌物質(zhì)比較耐酸堿和紫外線(xiàn)照射，但高溫對(duì)其抑菌活性影響較大。范萬(wàn)澤等［24］報(bào)道了婁徹氏鏈霉菌ZZ-9發(fā)酵液代謝產(chǎn)物耐高溫（100℃）， 對(duì)強(qiáng)酸（pH 2）和強(qiáng)堿（pH 12）處理、長(zhǎng)時(shí)間（16 h）可見(jiàn)光及紫外線(xiàn)照射均有較好的穩(wěn)定性。張雨陽(yáng)等［25］報(bào)道了鏈霉菌15-6發(fā)酵液抑菌物質(zhì)在溫度和紫外線(xiàn)照射處理?xiàng)l件下有較好的穩(wěn)定性，但是對(duì)酸性（pH 1～6）或堿性（pH 8～13）條件很敏感。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果不盡相同，鏈霉菌YC117發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對(duì)酸堿有較好的穩(wěn)定性，在40℃、pH 8處理30 min時(shí)，抑菌活性最高，當(dāng)溫度低于60℃時(shí)對(duì)抑菌活性有促進(jìn)作用，但是對(duì)60℃以上高溫和紫外照射比較敏感，紫外光照射20 min后，抑制率下降至9.52%。

本研究為煙草黑脛病及其他植物病害的防治提供了一定的科學(xué)依據(jù)，也為后期鏈霉菌YC117的田間應(yīng)用及菌劑研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。此外，本研究中鏈霉菌YC117對(duì)各供試病原真菌的測(cè)試、防效試驗(yàn)及穩(wěn)定性試驗(yàn)均為室內(nèi)測(cè)定，在大田環(huán)境中的抑菌效果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）