摘要抗凝血滅鼠劑在廣東已使用40多年，評(píng)估不同鼠類種群的抗藥性對(duì)于科學(xué)合理使用抗凝劑具有重要的指導(dǎo)意義。維生素K環(huán)氧化物還原酶亞基1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，Vkorc1）上的錯(cuò)義突變可以導(dǎo)致鼠類對(duì)抗凝劑的抗性。本研究首先根據(jù)鼠類的外部形態(tài)特征和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxydase subunitⅠ， COⅠ）基因?qū)V東省雷州市烏石鎮(zhèn)捕獲的91只鼠進(jìn)行物種鑒定，然后根據(jù)不同鼠類種群內(nèi)的Vkorc1錯(cuò)義突變頻率，評(píng)估當(dāng)?shù)胤N群對(duì)抗凝劑是否產(chǎn)生抗性。結(jié)果表明，COⅠ基因支持形態(tài)分類的結(jié)果，捕獲的鼠種包括黑緣齒鼠Rattus andamanensis、黃毛鼠R.losea、黃胸鼠R.tanezumi和褐家鼠R.norvegicus。Vkorc1多態(tài)性分析顯示，22只黑緣齒鼠中檢測(cè)到1種沉默突變Ala18Ala，52只黃胸鼠中檢測(cè)到2種沉默突變Ala18Ala和Ala41Ala，16只褐家鼠中檢測(cè)到2種沉默突變His68His和Ile82Ile。目前烏石鎮(zhèn)的鼠類種群沒有產(chǎn)生與抗性相關(guān)的Vkorc1錯(cuò)義突變，表明當(dāng)?shù)胤N群對(duì)抗凝血?jiǎng)┑目剐运捷^低，第一代抗凝劑仍可用于當(dāng)?shù)厥蠛Ψ乐巍?/p>

關(guān)鍵詞鼠屬;Vkorc1多態(tài)性;DNA條形碼;抗藥性

中圖分類號(hào)：Q 959; S 443文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023511Species identification and assessment of resistance levels of rodents

captured in Leizhou city， Guangdong provinceSUN Ting1，YAO Dandan2，QIAO Yanting1，YAN Haojie LI Tongtong XU Jianting

YING Yaqi WANG Dawei LIU Xiaohui SONG Ying（1. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing100193， China; 2. Plant

Protection Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou510640， China;

3. West Agricultural Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changji831100， China）AbstractAnticoagulant rodenticides have been widely used in Guangdong province for over 40 years. To ensure effective and scientific application of these anticoagulant rodenticides， it is crucial to assess the level of resistance in different rat populations. Missense mutations in the vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 （Vkorc1） gene can cause anticoagulant resistance in rats. In this study， we first identified the 91 rat samples captured in Wushi town， Leizhou city， Guangdong province based on their external morphological characteristics and mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ （COⅠ） gene， and then assessed the anticoagulant resistance levels based on the frequency of missense mutations in different rat populations. Results showed that the COⅠgene supported the results of morphological classification， and the captured rats comprised Rattus andamanensis， R.losea， R.tanezumi， and R.norvegicus. Analysis of Vkorc1 polymorphism revealed one silent mutation Ala18Ala in 22 individuals of R.andamanensis， two silent mutations Ala18Ala and Ala41Ala in 52 individuals of R.tanezumi， and two silent mutations His68His and Ile82Ile in 16 individuals of R.norvegicus. Currently， the rodent population in Wushi town has no Vkorc1 missense mutations associated with anticoagulant resistance， indicating a low level of anticoagulant resistance in local rat populations. This suggests that the first generation of anticoagulant rodenticides are still effective in managing the local rat populations.

Key wordsRattus;Vkorc1 polymorphism;DNA barcoding;resistance廣東地區(qū)由于氣候、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)等原因，鼠害長(zhǎng)年處于中等偏重、局部發(fā)生的趨勢(shì)，而且該地區(qū)還是黃胸鼠Rattus tanezumi鼠疫自然疫源地之一［12］。抗凝血滅鼠劑被廣泛用于廣東地區(qū)害鼠的防治，但是長(zhǎng)期使用鼠類會(huì)對(duì)抗凝劑產(chǎn)生抗藥性，進(jìn)而降低使用效率［36］。因此，及時(shí)監(jiān)測(cè)鼠類種群對(duì)抗凝劑的抗性水平對(duì)指導(dǎo)抗凝劑的科學(xué)使用具有重要的參考價(jià)值。

抗凝劑包括第一代（殺鼠靈、敵鼠鈉鹽、殺鼠醚等）和第二代（溴敵隆、溴鼠靈、氟鼠靈等）抗凝劑［7］?？鼓齽┡c維生素K環(huán)氧化物還原酶亞基1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，Vkorc1）編碼的酶結(jié)合，阻斷維生素K循環(huán)，導(dǎo)致氧化型維生素K無法還原形成還原型維生素K，進(jìn)而影響凝血因子的活化，導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物凝血功能障礙［8］。Vkorc1基因上的突變可以導(dǎo)致多種鼠類對(duì)抗凝劑的抗性［9］。目前發(fā)現(xiàn)的與抗性相關(guān)的突變主要是錯(cuò)義突變，即可以導(dǎo)致氨基酸變異的突變。以褐家鼠Rattus norvegicus為例，已發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變有18種（Ala21Thr、Ala26Thr、Ala26Pro、Arg33Pro、Arg35Pro、Tyr39Asn、Gly46Ser、Ser56Pro、Phe63Cys、Glu67Lys、Leu120Gln、Ile123Ser、Leu128Gln、Tyr139Cys/Ser/Phe、Ser149Ile和Glu155Lys），其中已驗(yàn)證與抗性相關(guān)的突變包括Arg33Pro、Arg35Pro、Leu120Gln、Leu128Gln、Tyr139Cys/Phe/Ser等，被廣泛用于篩選或監(jiān)測(cè)抗性褐家鼠［919］。因此，可以通過分析不同鼠種的Vkorc1抗性變異及其發(fā)生頻率來評(píng)估鼠類種群的抗性水平［9，17，2021］。經(jīng)典的生理抗性檢測(cè)方法，例如致死期食毒（lethal feeding period，LFP）法和血液凝集法要求對(duì)活鼠進(jìn)行抓捕和飼養(yǎng)，需要的人力和物力成本較高［22］?；诳顾幇谢騐korc1基因上的抗性變異及其頻率，來評(píng)估鼠類種群的抗性，不需要對(duì)活鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，更加經(jīng)濟(jì)和高效。

廣東省農(nóng)區(qū)常見的鼠種包括黑緣齒鼠Rattus andamanensis、黃毛鼠Rattus losea、黃胸鼠、褐家鼠、小家鼠Mus musculus和板齒鼠Bandicota bengalensis等［2324］。目前通過LFP法在廣東省的褐家鼠、黃胸鼠、黃毛鼠種群中都發(fā)現(xiàn)了對(duì)抗凝劑產(chǎn)生抗性的個(gè)體。例如，利用LFP法檢測(cè)2010年湛江市區(qū)的褐家鼠抗性發(fā)生率為21.6%［25］，分析湛江麻章區(qū)褐家鼠種群的Vkorc1變異，發(fā)現(xiàn)一個(gè)可能與抗性相關(guān)的突變Ala140Thr，突變頻率為0～4%［14］;利用LFP法在廣東省的遂溪縣、徐聞縣、安鋪鎮(zhèn)、雷州市黃胸鼠種群中檢測(cè)出抗性鼠的頻率為5%～10.6%［6，2629］，分析湛江的黃胸鼠種群的Vkorc1變異，發(fā)現(xiàn)了對(duì)抗凝劑具有較強(qiáng)抗性的Tyr139Cys突變［30］;在江門市新會(huì)區(qū)和佛山市高明區(qū)利用LFP法分析黃毛鼠的抗性率分別為36.7%和16.7%［31］，在江門市黃毛鼠種群的Vkorc1基因上檢測(cè)到了一個(gè)可能與抗性相關(guān)的Arg58Gly突變［32］。因此，通過分析廣東不同鼠類種群的Vkorc1是否攜帶抗性突變及突變頻率可以評(píng)估種群的抗性水平。

有研究對(duì)褐家鼠種群內(nèi)已發(fā)表的Vkorc1變異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)由于一些黑家鼠Rattus rattus或其他家鼠屬Rattus物種的樣品被誤判為褐家鼠，導(dǎo)致一些種間的Vkorc1變異被誤認(rèn)為是褐家鼠種群內(nèi)的變異［21］。因此，在分析Vkorc1基因多態(tài)性時(shí)，物種的準(zhǔn)確鑒定十分重要。廣東地區(qū)的常見鼠種，例如黑緣齒鼠、黃毛鼠、黃胸鼠和褐家鼠都屬于家鼠屬，形態(tài)相似性較大［33］，僅依據(jù)外表形態(tài)對(duì)這些鼠進(jìn)行物種鑒定時(shí)容易發(fā)生混淆。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunitⅠ，CO Ⅰ）基因是常用的DNA條形碼標(biāo)記，被廣泛用于各種鼠的物種鑒定［3435］。形態(tài)鑒別結(jié)合DNA條形碼技術(shù)可以更加精確地鑒定鼠種。

本研究對(duì)2022年在廣東省雷州市烏石鎮(zhèn)捕獲的91只鼠樣本，結(jié)合形態(tài)鑒別和DNA條形碼技術(shù)，明確了所捕獲鼠的鼠種組成。通過分析不同鼠種的Vkorc1基因多態(tài)性，評(píng)估其抗性水平，為當(dāng)?shù)睾κ蠓乐芜^程中抗凝劑的科學(xué)使用提供參考。

1材料與方法

1.1供試鼠

2022年3月7日至20日在廣東省雷州市烏石鎮(zhèn)農(nóng)村居住區(qū)（109°51′E，20°33′N）利用籠捕法捕鼠。每日傍晚沿民居外墻、道路兩側(cè)、垃圾暫存處等地放置鼠籠（長(zhǎng)27 cm×寬14 cm×高14 cm），以新鮮花生米和胡蘿卜做誘餌，次日傍晚收回。共捕獲了91只鼠，通過外部形態(tài)特征，如體色、體型、頭部及尾部等特征［3637］，對(duì)捕獲的鼠進(jìn)行物種鑒定。取1～2 cm左右的鼠尾保存于裝有75%乙醇的離心管中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。本試?yàn)涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案遵守中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)的相關(guān)要求。

1.2捕獲鼠種類的分子鑒定

1.2.1COⅠ和Vkorc1克隆

利用動(dòng)物組織基因組提取試劑盒（諾唯贊，中國(guó)），按照說明書從鼠尾組織中提取基因組DNA，DNA保存于TE緩沖液（pH 8.0）中，然后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增所有樣品的COⅠ和Vkorc1。COⅠ基因擴(kuò)增所用的引物為BatL5310： 5′-CCTACTCR-GCCATTTTACCTATG-3′， R6036R： 5′-ACTTC-TGGGTGTCCAAAGAATCA-3′［38］。PCR反應(yīng)體系為：1 μL DNA模板 （60～100 ng），正、反向引物（20 μmol/L）各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，54℃退火40 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。利用3對(duì)引物擴(kuò)增Vkorc1全長(zhǎng)，所用引物分別為VK1F： 5′-TGTCACGCCTAAGAATAACCA-3′， VK1R： 5′-CGA-GGGCTCAGCAAATAAG-3′; VK2F： 5′-AGGGC-AGTATAGCGAATAGA-3′， VK2R： 5′-GCCTCT-GGCTACCTAAACCT-3′; VK3F： 5′-CTGACAG-CATCCTCAACCAAT-3′和VK3R： 5′-GAGGCA-CATTTGGTCATTTT-3′［39］。PCR反應(yīng)體系為：1 μL DNA模板（120～200 ng），正、反向引物（20 μmol/L）各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用ABI3730 測(cè)序儀（賽默飛，加利福尼亞州，美國(guó)）進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2DNA條形碼分析

采用Lasergene 7.0軟件［40］檢查COⅠ序列峰圖質(zhì)量，對(duì)每個(gè)堿基逐一進(jìn)行人工校正。經(jīng)校對(duì)的COⅠ序列利用MEGA11軟件［41］中的Clustal W進(jìn)行序列比對(duì)，并計(jì)算不同鼠種種內(nèi)和種間P-distance遺傳距離。利用DnaSP 5.0軟件［42］分析COⅠ序列的單倍型（haplotype， Hap）的組成和頻率。將不同鼠種的COⅠ單倍型在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，同時(shí)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了23條鼠的COⅠ序列作為參考序列，包括黑緣齒鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠。利用MEGA 11軟件［41］中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法基于Kimura 2 parameter（K2P）堿基替代模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次自展（bootstrap）檢驗(yàn)。利用Network 10.0軟件中 Median-joining 模型［43］對(duì)單倍型數(shù)目≥3的鼠種構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

將不同的CO Ⅰ單倍型序列提交到ABGD（automatic barcode gap discovery， ABGD）網(wǎng)站（https：∥bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/）對(duì)樣本進(jìn)行物種鑒定。運(yùn)行參數(shù)種內(nèi)差異先驗(yàn)值P為0.001～0.1，最小相對(duì)gap寬度值為1.5，替換模型選擇Kimura（K80），轉(zhuǎn)換與顛換比率（ts/tv）為2.0。根據(jù)ABGD對(duì)單倍型的劃分結(jié)果，結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析綜合鑒定物種。

1.3捕獲鼠的Vkorc1多態(tài)性分析

采用Lasergene 7.0軟件［40］檢查Vkorc1序列峰圖質(zhì)量，對(duì)每個(gè)堿基逐一進(jìn)行人工校正。以褐家鼠Vkorc1基因?yàn)閰⒖夹蛄?，首先分析不同鼠種與褐家鼠種間Vkorc1編碼區(qū)（486 bp）的變異，然后分析褐家鼠、黑緣齒鼠和黃胸鼠的種內(nèi)Vkorc1變異，并與褐家鼠、黃胸鼠和黑家鼠中已發(fā)表的抗性相關(guān)DNA變異［919］進(jìn)行比較。褐家鼠中已驗(yàn)證與抗性相關(guān)的變異包括Arg33Pro、Arg35Pro、Leu120Gln、Leu128Gln、Tyr139Cys/Phe/Ser等［9，1819］，黃胸鼠中報(bào)道的Tyr139Cys［30］，黑家鼠中已驗(yàn)證與抗性相關(guān)的變異包括Tyr25Phe、Ala41Val、Ala41Thr，、Arg61Trp和 Leu76Pro［4445］。分析不同鼠種群中是否存在可以導(dǎo)致氨基酸變異的抗性相關(guān)變異，根據(jù)種群內(nèi)抗性相關(guān)變異的頻率評(píng)估種群的抗性水平。

2結(jié)果與分析

2.1捕獲鼠的種類

根據(jù)形態(tài)特征，捕獲的91只鼠共有4種，其中黃胸鼠為優(yōu)勢(shì)種，占57.1%，其次是黑緣齒鼠和褐家鼠，分別占24.2%和17.6%，黃毛鼠最少，占1.1%。

根據(jù)DNA條形碼特征，91只捕獲鼠的COⅠ序列（633 bp）共包含20種不同的單倍型（Hap1～Hap20），這些單倍型包含117個(gè)變異位點(diǎn)（variable sites），其中有99個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimony informative sites）（圖1）。根據(jù)COⅠ單倍型鑒定為黑緣齒鼠（Hap1～Hap11，ABGD1）、黃毛鼠（Hap12，ABGD2）、黃胸鼠（Hap13～Hap18，ABGD4）和褐家鼠（Hap19， ABGD5;Hap20，ABGD6）（圖2）。

在黑緣齒鼠種群中，22個(gè)個(gè)體共包含11個(gè)不同的單倍型（圖3a），分別為Hap1（n=7），Hap2（n=2），Hap3（n=1），Hap4（n=2），Hap5（n=1），Hap6（n=1），Hap7（n=1），Hap8（n=1），Hap9（n=1），Hap10（n=4）和Hap11（n=1）。黑緣齒鼠的COⅠ單倍型Hap1～Hap11與黑家鼠海南亞種Rattus rattus hainanicus、黑家鼠滇西亞種Rattus rattus sladeni和黑緣齒鼠的相似性均大于98%。ABGD分析顯示Hap1～Hap11為同一聚類，但進(jìn)化樹分析顯示Hap1～Hap8與黑家鼠海南亞種聚在一起，Hap9～Hap11與黑家鼠滇西亞種聚在一起。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示Hap9～Hap11與Hap1～Hap8之間存在至少5個(gè)堿基的差異。

在黃胸鼠種群中，52個(gè)個(gè)體共包含6個(gè)COⅠ單倍型（圖3b），分別為Hap13（n=1），Hap14（n=1），Hap15（n=2），Hap16（n=2），Hap17（n=45），Hap18（n=1）。黃胸鼠單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖3b）顯示，Hap17為主單倍型，包括了黃胸鼠種群的絕大多數(shù)個(gè)體（86.5%）。在褐家鼠種群中，16個(gè)個(gè)體共包含2個(gè)單倍型Hap19（n=1）和 Hap20（n=15），2個(gè)單倍型間存在5個(gè)堿基差異。ABGD聚類結(jié)果將Hap19單獨(dú)列出為ABGD5。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示Hap19和Hap20與褐家鼠參考序列親緣關(guān)系較近（BP=100）。Hap19和Hap20都與NCBI庫(kù)中褐家鼠的參考序列最高相似性達(dá)到100%，因此Hap19和Hap20均屬于褐家鼠。

綜合形態(tài)鑒定和DNA條形碼分析，可以明確本次在廣東雷州共捕獲到4種鼠，其中黑緣齒鼠22只，黃毛鼠1只，黃胸鼠52只，褐家鼠16只。不同鼠種的種間遺傳距離均大于種內(nèi)遺傳距離，種間的遺傳距離范圍為6.86%～11.43%。黑緣齒鼠種內(nèi)不同單倍型的平均遺傳距離為1.09%，遺傳距離范圍為0.16%～2.39%，其中Hap9～Hap11與Hap6之間以及Hap10與Hap5之間的種間遺傳距離大于2%，其余單倍型間的遺傳距離均小于2%;黃胸鼠種內(nèi)平均遺傳距離為0.37%，遺傳距離范圍為0.16%～0.64%;褐家鼠種內(nèi)兩個(gè)單倍型間的遺傳距離為0.80%。

2.2Vkorc1基因在捕獲鼠的種間和種內(nèi)變異情況

褐家鼠、黑緣齒鼠、黃毛鼠和黃胸鼠的Vkorc1基因編碼區(qū)存在多個(gè)種間變異（表1）。以褐家鼠為參考，黑緣齒鼠與褐家鼠間存在3個(gè)沉默突變Arg12Arg、Ile107Ile、Thr137Thr和1個(gè)錯(cuò)義突變Ile90Leu;黃毛鼠與褐家鼠間存在5個(gè)沉默突變，分別為Arg12Arg、Ala41Ala、Arg98Arg、Ile107Ile和Thr137Thr;黃胸鼠與褐家鼠間存在3個(gè)沉默突變，分別為Arg12Arg、Ile107Ile和Thr137Thr和1個(gè)錯(cuò)義突變Ile90Leu。這些種間的Vkorc1變異可以為今后分析其中一個(gè)鼠種的種內(nèi)Vkorc1變異是否摻入了種間變異提供參考。

分析每個(gè)鼠種種群內(nèi)部的Vkorc1編碼區(qū)變異發(fā)現(xiàn)（表1），16只褐家鼠中，15只攜帶沉默突變His68His，頻率為93.8%，3只攜帶沉默突變Ile82Ile，頻率為9.4%;在22只黑緣齒鼠中，18只攜帶沉默突變Ala18Ala，頻率為59.1%;在52只黃胸鼠中，1只攜帶沉默突變Ala18Ala，頻率為1.0%，2只攜帶沉默突變Ala41Ala，頻率為1.9%。這些表明在褐家鼠、黑緣齒鼠和黃胸鼠的種內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)沉默突變，未發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致氨基酸突變的錯(cuò)義突變。

3結(jié)論與討論

本研究對(duì)黑緣齒鼠的11個(gè)COⅠ單倍型（Hap1～Hap11）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，11個(gè)單倍型與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的黑家鼠海南亞種和黑家鼠滇西亞種以及黑緣齒鼠聚為一支（圖1）。Lu等通過分析不同鼠種的細(xì)胞色素b和COⅠ序列，認(rèn)為黑家鼠海南亞種和黑家鼠滇西亞種與黑緣齒鼠為同一物種［46］。通常認(rèn)為以COⅠ為遺傳標(biāo)記時(shí)，同一物種的種內(nèi)遺傳距離小于2%［47］。本研究發(fā)現(xiàn)黑緣齒鼠大部分COⅠ單倍型之間的遺傳距離小于2%，僅Hap6和Hap9～Hap11之間以及Hap5和Hap10之間的遺傳距離大于2zyStY3W9ZldZk/qx2uNULw==%，說明黑緣齒鼠種群內(nèi)部個(gè)別單倍型間出現(xiàn)了較大的遺傳分化。ABGD聚類分析顯示，褐家鼠的2個(gè)單倍型Hap19和Hap20分別位于不同的聚類單元，但系統(tǒng)進(jìn)化分析和BLAST分析支持Hap19和Hap20均為褐家鼠，并且遺傳距離分析顯示褐家鼠種內(nèi)遺傳距離小于2%，因此Hap19和Hap20均應(yīng)為褐家鼠。綜合形態(tài)鑒定和DNA條形碼鑒定，可以明確捕獲鼠包含4個(gè)鼠種，分別為黑緣齒鼠、黃毛鼠、黃胸鼠和褐家鼠，其中黃胸鼠為優(yōu)勢(shì)種群，占比57.1%，黑緣齒鼠和褐家鼠占比分別為24.2%和17.6%，黃毛鼠占比最少，為1.1%。廣東農(nóng)區(qū)分布有褐家鼠、黃胸鼠、黑緣齒鼠、黃毛鼠、板齒鼠、大足鼠Rattus nitidus和小家鼠［2324］，由于采集時(shí)間、采集地點(diǎn)及采集方法的差異，不同鼠類調(diào)查的結(jié)果會(huì)存在一定的差異。例如，2017年12月廣東省江門市農(nóng)田捕獲的鼠種主要是黃毛鼠（82.2%）和黃胸鼠（11.1%）［23］;2019年9月-2020年10月利用鼠類物聯(lián)網(wǎng)智能監(jiān)測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到的主要鼠種為黃毛鼠（50.4%）、板齒鼠（22.0%）、小家鼠（16.0%），而利用夾夜法捕獲的鼠種以黃毛鼠（71.7%）和小家鼠（16.9%）為主［24］。本研究在烏石鎮(zhèn)采用籠捕法捕獲的鼠種以黃胸鼠、黑緣齒鼠和褐家鼠為主，黃毛鼠比較少，可能是因?yàn)辄S毛鼠在農(nóng)田分布較多，而本次調(diào)查主要集中在農(nóng)村居民區(qū)。

通過分析和比較4個(gè)鼠種種間的Vkorc1變異共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)沉默突變和1個(gè)錯(cuò)義突變Ile90Leu（表1），這些突變可為鑒定不同鼠種種內(nèi)的Vkorc1基因變異提供重要參考。如果這些種間的Vkorc1變異出現(xiàn)在種群內(nèi)，則需要考慮是否可能存在物種鑒定錯(cuò)誤或者種間雜交的情況［21，48］。例如，曾經(jīng)在褐家鼠種群中報(bào)道的Vkorc1變異，包括Arg12Arg、Trp59Arg、Ile90Leu、Val112Leu、Ile141Val和Ala143Val等突變［9］，后來經(jīng)過系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)這些變異并非褐家鼠種群內(nèi)部的變異，而是由于一些黑家鼠被錯(cuò)誤的鑒定為褐家鼠，導(dǎo)致一些種間的突變被誤認(rèn)為是種內(nèi)的突變［21］;曾經(jīng)在西歐小家鼠Mus musculus domesticus種群內(nèi)報(bào)道的Vkorc1抗性變異Arg12Trp、Ala26Ser、Ala48Thr和Arg61Leu［9］，后來被鑒定是西歐小家鼠與阿爾及利亞鼠Mus spretus的種間變異，并且小家鼠可以通過與后者雜交獲得后者的Vkorc1基因而獲得抗性［48］。

黑緣齒鼠種群內(nèi)存在1個(gè)沉默突變Ala18Ala，黃胸鼠種群內(nèi)存在2個(gè)沉默突變Ala18Ala和Ala41Ala，褐家鼠種群內(nèi)存在2個(gè)沉默突變His68His和Ile82Ile。沉默突變不改變VKOR蛋白酶的編碼，對(duì)嚙齒動(dòng)物的抗藥性影響較小［14］。本研究在烏石鎮(zhèn)的黃胸鼠和褐家鼠的種群中，均沒有檢測(cè)到會(huì)導(dǎo)致氨基酸變異的錯(cuò)義突變，這說明雷州市烏石鎮(zhèn)的黑緣齒鼠、黃胸鼠和褐家鼠對(duì)抗凝劑的抗性水平較低，第一代抗凝劑仍適用當(dāng)?shù)胤N群的防治。

廣東雷州地區(qū)的鼠類抗性問題一直受到廣泛的關(guān)注。雷州市奮勇華僑農(nóng)場(chǎng)捕獲的黃胸鼠抗性率為10.6%，褐家鼠未發(fā)現(xiàn)抗性鼠［29］;雷州半島家棲鼠抗藥性監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)黃胸鼠的抗性率為7.9%，褐家鼠未發(fā)現(xiàn)抗性鼠［3］;雷州市郊黃胸鼠對(duì)殺鼠靈的抗性率為11.1%［49］;檢測(cè)廣東遂溪的黑家鼠海南亞種對(duì)殺鼠靈毒餌的抗性，未發(fā)現(xiàn)抗性個(gè)體［50］。本研究發(fā)現(xiàn)廣東雷州的黃胸鼠、褐家鼠以及黑緣齒鼠的種群抗性水平均較低，與歷史的生理抗性檢測(cè)結(jié)果基本一致。一方面，雖然發(fā)現(xiàn)雷州地區(qū)的黃胸鼠種群中有抗性鼠，但一直表現(xiàn)為中低水平的抗性，沒有形成明顯的抗性種群（抗性率>15%），其原因可能是當(dāng)?shù)乜鼓齽┑倪x擇壓力有限。另一方面，Vkorc1抗性突變可以導(dǎo)致鼠類的抗藥性，但小部分的抗性鼠不一定攜帶Vkorc1變異［51］。在敏感的褐家鼠種群中持續(xù)使用殺鼠靈3～5代后，Vkorc1基因沒有發(fā)現(xiàn)任何變異，但5.7%～7.1%的褐家鼠可以通過LFP法檢測(cè)表現(xiàn)為抗性鼠［52］，因此LFP抗性檢測(cè)法與基于Vkorc1突變的抗性檢測(cè)法檢測(cè)出的抗性鼠頻率可能存在小幅的差異。此外，鼠類抗藥性種群的發(fā)生通常被認(rèn)為是點(diǎn)狀發(fā)生，而不是平均分布在整個(gè)區(qū)域［5354］。因此有可能雷州其他地區(qū)的鼠類出現(xiàn)了一定程度的抗性，但烏石鎮(zhèn)的黃胸鼠仍對(duì)抗凝劑比較敏感。

廣東省雷州市烏石鎮(zhèn)農(nóng)村居民區(qū)的優(yōu)勢(shì)鼠種是黃胸鼠，黑緣齒鼠和褐家鼠次之。這些鼠種對(duì)抗凝劑的抗藥性水平較低，第一代抗凝劑例如殺鼠靈和敵鼠鈉鹽仍然可以有效地防治這些鼠類種群。

參考文獻(xiàn)

［1］高志祥， 林偉松， 馮志勇， 等. 廣東省作物種植區(qū)害鼠群落結(jié)構(gòu)調(diào)查研究［J］. 中國(guó)植保導(dǎo)刊， 2011， 31（6）： 3537.

［2］苑勇業(yè)， 孫文. 我國(guó)黃胸鼠疫疫源地特征與檢驗(yàn)檢疫對(duì)策［J］. 口岸衛(wèi)生控制， 2000（1）： 3637.

［3］易建榮， 林立豐， 梁練， 等. 雷州半島兩種家棲鼠對(duì)第一代抗凝血滅鼠劑抗藥性研究［J］. 中華衛(wèi)生殺蟲藥械， 2005， 11（2）： 98100.

［4］劉陽， 張韶華， 梁焯南， 等. 廣東省深圳市2017年褐家鼠對(duì)抗凝血?dú)⑹髣┛顾幮匝芯浚跩］. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2018， 29（6）： 617620.

［5］易建榮， 林立豐， 段金花， 等. 廣東省家棲鼠對(duì)第一代抗凝血滅鼠劑抗藥性研究［J］. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2006， 17（6）： 440443.

［6］朱智峰， 洪平， 麥穎宏， 等. 廣東遂溪縣黃胸鼠和褐家鼠對(duì)殺鼠靈的抗藥性研究［J］. 地方病通報(bào)， 2005， 20（1）： 4345.

［7］MCGEE C F， MCGILLOWAY D A， BUCKLE A P. Anticoagulant rodenticides and resistance development in rodent pest species—A comprehensive review ［J/OL］. Journal of Stored Products Research， 2020， 88： 101688. DOI： 10.1016/j.jspr.2020.101688.

［8］STAFFORD D W. The vitamin K cycle ［J］. Journal of Thrombosis and Haemostasis， 2005， 3（8）： 18731878.

［9］ROST S， PELZ H J， MENZEL S， et al. Novel mutations in the VKORC1 gene of wild rats and mice — a response to 50 years of selection pressure by warfarin？［J/OL］. BMC Genetics， 2009， 10： 4. DOI： 10.1186/1471-2156-10-4.

［10］BERMEJO-NOGALES A， RODRIGUEZ M J A， COLL J， et al. VKORC1 single nucleotide polymorphisms in rodents in Spain ［J/OL］. Chemosphere， 2022， 308（Pt1）： 136021. DOI： 10.1016/j.chemosphere.2022.136021.

［11］DAZ J C， KOHN M H A. Vkorc1-based SNP survey of anticoagulant rodenticide resistance in the house mouse， Norway rat and roof rat in the USA ［J］. Pest Management Science， 2021， 77（1）： 234242.

［12］ANGELA I， PAOLO C， VIVIANA G， et al. VKORC1 mutation in European populations of Rattus norvegicus with first data for Italy and the report of a new amino acid substitution ［J］. Hystrix， 2018， 29（1）： 9599.

［13］GRANDEMANGE A， LASSEUR R， LONGIN-SAUVAGEON C， et al. Distribution of VKORC1 single nucleotide polymorphism in wild Rattus norvegicus in France ［J］. Pest Management Science， 2010， 66（3）： 270276.

［14］MA Xiaohui， WANG Dawei， LI Ning， et al. Low warfarin resistance frequency in Norway rats in two cities in China after 30 years of usage of anticoagulant rodenticides ［J］. Pest Management Science， 2018， 74（11）： 25552560.

［15］MEERBURG B G， VAN GENT-PELZER M P， SCHOELITSZ B， et al. Distribution of anticoagulant rodenticide resistance in Rattus norvegicus in the Netherlands according to Vkorc1 mutations ［J］. Pest Management Science， 2014， 70（11）： 17611766.

［16］MOONEY J， LYNCH M R， PRESCOTT C V， et al. VKORC1 sequence variants associated with resistance to anticoagulant rodenticides in Irish populations of Rattus norvegicus and Mus musculus domesticus ［J/OL］. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 4535. DOI： 10.1038/s41598-018-22815-7.

［17］PELZ H J， ROST S， HUNERBERG M， et al. The genetic basis of resistance to anticoagulants in rodents ［J］. Genetics， 2005， 170（4）： 18391847.

［18］TANAKA K D， KAWAI Y K， IKENAKA Y， et al. A novel mutation in VKORC1 and its effect on enzymatic activity in Japanese warfarin-resistant rats ［J］. Journal of Veterinary Medical Science， 2013， 75（2）： 135139.

［19］PELZ H J， PRESCOTT C V. Resistance to anticoagulant rodenticides ［M］∥BUCKLE A P， SMITH R H. Rodent pests and their control. 2nd ed. Wallingford： CABI International， 2015： 187208.

［20］BUCKLE A. Anticoagulant resistance in the United Kingdom and a new guideline for the management of resistant infestations of Norway rats （Rattus norvegicus Berk.） ［J］. Pest Management Science， 2013， 69（3）： 334341.

［21］DAZ J C， SONG Ying， MOORE A， et al. Analysis of vkorc1 polymorphisms in Norway rats using the roof rat as outgroup ［J/OL］. BMC Genetics， 2010， 11： 43. DOI： 10.1186/1471-2156-11-43.

［22］BUCKLE A P. Damage assessment and damage surveys ［M］∥BUCKLE A P， SMITH R H. Rodent pests and their control， 2nd ed. Wallingford： CABI Internationev8sXsnbT8Rz/XP/9EyG2Z5den9KPvCFgBxLxb6SrUY=al， 2015： 209230.

［23］姚丹丹， 姜洪雪， 隋晶晶， 等. 廣東省江門市捕獲鼠類的DNA條形碼分析［J］. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2020， 31（3）： 305309.

［24］姚丹丹， 黃立勝， 姜洪雪， 等. 廣東省農(nóng)區(qū)鼠類物聯(lián)網(wǎng)智能監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用研究［J］. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2022， 33（2）： 273276.

［25］高志祥， 邱俊榮， 林偉松， 等. 湛江市褐家鼠對(duì)殺鼠靈的抗藥性調(diào)查［J］. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2011， 22（6）： 535537.

［26］胡杰， 戴廣祥， 梁練， 等. 廣東徐聞縣黃胸鼠和褐家鼠對(duì)殺鼠靈的抗藥性觀察［J］. 地方病通報(bào)， 2004， 19（3）： 3234.

［27］李玉蓮， 梁練， 張世炎， 等. 廣東省安鋪黃胸鼠和褐家鼠對(duì)殺鼠靈的抗藥性監(jiān)測(cè)［J］. 中國(guó)地方病防治雜志， 2005， 20（3）： 144145.

［28］梁練， 張世炎， 胡杰， 等. 湛江市區(qū)黃胸鼠和褐家鼠對(duì)抗凝血滅鼠劑的抗藥性調(diào)查［J］. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2005， 16（1）： 2123.

［29］張世炎， 胡杰， 梁練， 等. 湛江地區(qū)黃胸鼠和褐家鼠對(duì)抗凝血?jiǎng)┑目顾幮裕跩］. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2002， 13（1）： 6668.

［30］HUANG Baohuan， FENG Zhiyong， YUE Lingfen， et al. Warfarin resistance test and polymorphism screening in the VKORC1 gene in Rattus flavipectus ［J］. Journal of Pest Science， 2011， 84（1）： 8792.

［31］馮志勇， 姚丹丹， 黃立勝， 等. 黃毛鼠對(duì)第一代抗凝血滅鼠劑的抗藥性監(jiān)測(cè)［J］. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2007， 34（4）： 420424.

［32］WANG Jianshe， FENG Zhiyong， YAO Dandan， et al. Warfarin resistance in Rattus losea in Guangdong province， China ［J］. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2008， 91（2）： 9095.

［33］魏輔文， 楊奇森， 吳毅， 等. 中國(guó)獸類名錄［J］. 2021版. 獸類學(xué)報(bào)， 2021， 41（5）： 487501.

［34］李爭(zhēng)光， 叢林， 王大偉， 等. 黑龍江地區(qū)農(nóng)田害鼠發(fā)生特點(diǎn)及DNA條形碼鑒定技術(shù)的應(yīng)用［J］. 植物保護(hù)， 2018， 44（6）： 145151.

［35］郭麗民， 席進(jìn)孝， 師占文， 等. DNA條形碼對(duì)平川區(qū)阿拉善黃鼠疫源地鼠種鑒定的效果評(píng)價(jià)［J］. 疾病預(yù)防控制通報(bào)， 2019， 34（6）： 13.

［36］韓崇選， 李金鋼， 楊學(xué)軍， 等. 中國(guó)農(nóng)林嚙齒動(dòng)物與科學(xué)管理［M］. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社， 2005：312325.

［37］WILSON D E， MITTERMEIER R A， LACHER T E. Handbook of the mammals of the world Vol. 7： RodentsⅡ ［M］. Barcelona： Lynx Edicions， 2017.

［38］KRESS W J， ERICKSON D L. DNA barcodes： methods and protocols ［J］. Methods in Molecular Biology， 2012， 858： 38.

［39］CHEN Yan， WANG Dawei， LI Ning， et al. Accelerated evolution of Vkorc1 in desert rodent species reveals genetic preadaptation to anticoagulant rodenticides ［J］. Pest Management Science， 2022， 78（6）： 27042713.

［40］BURLAND T G. DNASTAR’s Lasergene sequence analysis software ［J］. Methods in Molecular Biology， 2000， 132： 7191.

［41］TAMURA K， STECHER G， KUMAR S. MEGA11： Molecular evolutionary genetics analysis ［J］. Molecular Biology and Evolution， 2021， 38（7）： 30223027.

［42］LIBRADO P， ROZAS J. DnaSP v5： a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data ［J］. Bioinformatics， 2009， 25（11）： 14511452.

［43］BANDELT H J， FORSTER P， RHL A. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies ［J］. Molecular Biology and Evolution， 1999， 16（1）： 3748.

［44］GOULOIS J， CHAPUZET A， LAMBERT V， et al. Evidence of a target resistance to antivitamin K rodenticides in the roof rat Rattus rattus： identification and characterisation of a novel Y25F mutation in the Vkorc1 gene ［J］. Pest Management Science， 2016， 72（3）： 544550.

［45］ISHIZUKA M， OKAJIMA F， TANIKAWA T， et al. Elevated warfarin metabolism in warfarin-resistant roof rats （Rattus rattus） in Tokyo ［J］. Drug Metabolism Disposition， 2007， 35（1）： 6266.

［46］LU Liang， CHESTERS D， ZHANG Wen， et al. Small mammal investigation in spotted fever focus with DNA-barcoding and taxonomic implications on rodents species from Hainan of China ［J/OL］. Public Library of Science， 2012， 7（8）： e43479. DOI： 10.1371/journal.pone.0043479.

［47］HEBERT P D， PENTON E H， BURNS J M， et al. Ten species in one： DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（41）： 1481214817.

［48］SONG Ying， ENDEPOLS S， KLEMANN N， et al. Adaptive introgression of anticoagulant rodent poison resistance by hybridization between old world mice ［J］. Current Biology， 2011， 21（15）： 12961301.

［49］高志祥， 邱俊榮， 馮志勇， 等. 雷州市黃胸鼠對(duì)殺鼠靈的抗藥性調(diào)查［J］. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志， 2011， 22（1）： 3537.

［50］董天義. 抗凝血滅鼠劑應(yīng)用研究［M］. 北京： 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社， 2001：3546.

［51］HEIBERG A C. Anticoagulant resistance： a relevant issue in sewer rat （Rattus norvegicus） control？［J］. Pest Management Science， 2009， 65（4）： 444449.

［52］MA Xiaohui， CHEN Yan， YING Yaqi， et al. Sublethal dose of warfarin induction promotes the accumulation of warfarin resistance in susceptible Norway rats ［J］. Journal of Pest Science， 2021， 94（3）： 805815.

［53］LODAL J. Distribution and levels of anticoagulant rodenticide ［C］∥Advances in Vertebrate Pest ManagementⅡ， Furth： Filander Verlag， 2001：139148.

［54］PELZ H J. Extensive distribution and high frequency of resistance to anticoagulant rodenticide in rat populations from northwestern Germany ［C］∥Advances in Vertebrate Pest ManagementⅡ， Furth： Filander Verlag， 2001：161170.

（責(zé)任編輯：楊明麗）