摘要為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)丁香酚（C10H12O2）對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne incognita的毒殺效果，本研究采用水瓊脂平板熏蒸法、土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法分別測(cè)定了丁香酚對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)（J2）和卵的毒力，比較3種測(cè)定方法的測(cè)定效果。結(jié)果表明，水瓊脂平板熏蒸法、土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法測(cè)得的丁香酚對(duì)2齡幼蟲(chóng)的LC50分別為123.5、140.2 μL/L和309.7 μL/L;丁香酚濃度為50 μL/L時(shí)，水瓊脂平板熏蒸法測(cè)得的卵孵化抑制率高達(dá)97.10%，而土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法測(cè)得的卵孵化抑制率僅分別為32.79%、11.50%;同時(shí)，水瓊脂平板可作為線蟲(chóng)或卵的可視化載體，便于在體視顯微鏡下觀察拍照。綜上，水瓊脂平板熏蒸法具有藥效發(fā)揮更充分、可視化、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，該方法更適用于熏蒸類(lèi)化合物的殺線蟲(chóng)生物測(cè)定。

關(guān)鍵詞丁香酚;南方根結(jié)線蟲(chóng);生物測(cè)定方法

中圖分類(lèi)號(hào)：S 432.45文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023495Comparison of three bioassay methods of eugenol against Meloidogyne incognitaCHEN Zongxiong，YANG Ziwei，HUI Renjie，DING Xiaofan*（Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests，5ghyI6wWlbYbY2mZFNty1Q== Ministry of

Education， School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou571737， China）AbstractIn order to accurately evaluate the toxicity of eugenol （C10H12O2） on Meloidogyne incognita， the second-stage juveniles （J2） and eggs of M.incognita were treated with eugenol by water agar plate fumigation， soil fumigation， and immersion， respectively. The results showed that the LC50 value of eugenol by water agar plate fumigation was 123.5 μL/L， while those by soil fumigation and immersion were 140.2 μL/L and 309.7 μL/L， respectively. The inhibition rate of egg hatching by 50 μL/L eugenol with water agar plate fumigation was 97.10%， while those by soil fumigation and immersion method were only 32.79% and 11.50%， respectively. Meanwhile， the water agar plate could be used as a visual carrier of J2 or eggs under stereomicroscopy for easy observation. In summary， the water agar plate fumigation has the advantages of fully exerting virulence effect of eugenol， visualization， and simple operation. It is more suitable for the nematode bioassay of fumigation compounds.

Key wordseugenol;Meloidogyne incognita;bioassay method

植物寄生線蟲(chóng)是重要的病原線蟲(chóng)，嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，每年給世界農(nóng)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1］。尤其是根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne spp.，其為害可造成我國(guó)蔬菜每年約30%的減產(chǎn)、超過(guò)30億人民幣的損失［2］。目前， 對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的防治仍以化學(xué)防治為主，常用藥劑有噻唑膦、阿維菌素、克百威等，大量使用化學(xué)殺線蟲(chóng)劑不僅對(duì)環(huán)境造成極大的破壞，還極易對(duì)人及其他非靶標(biāo)生物造成危害，同時(shí)由于長(zhǎng)期不合理地使用農(nóng)藥已使線蟲(chóng)產(chǎn)生了抗藥性［35］。因此挖掘新的安全、高效、低毒且在自然環(huán)境中可降解、不易產(chǎn)生抗藥性的殺線劑是發(fā)展的方向。在創(chuàng)制新殺線蟲(chóng)劑的過(guò)程中，室內(nèi)生物活性測(cè)定是必不可少的環(huán)節(jié)。

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1833.1-2009中推薦的殺線蟲(chóng)劑室內(nèi)生物測(cè)定方法為“浸蟲(chóng)法”，即將待測(cè)藥劑配制為不同濃度梯度溶液后與線蟲(chóng)懸液等體積混合均勻后測(cè)定藥劑活性，該方法也稱(chēng)“觸殺法”，對(duì)于不溶于水的揮發(fā)性藥劑的生物測(cè)定存在一定的局限性［6］。殺線劑的生物測(cè)定方法還有“土壤淋浴法”“葉面噴霧法”和“土壤熏蒸盆栽法”［78］，這3種方法均需要準(zhǔn)備活體盆栽植物，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，無(wú)法在24 h或48 h內(nèi)準(zhǔn)確獲知供試藥劑的急性毒力，因此較少被采納。目前不溶于水且具有揮發(fā)性的化合物的毒力多采用浸蟲(chóng)法測(cè)定，由于揮發(fā)性化合物與水不互溶，需要添加助劑將其配制成水劑，這樣水相中的親脂分子結(jié)合形成膠束，使得揮發(fā)性化合物不能很好地與生物體附著，無(wú)法充分發(fā)揮藥效;而若是利用熏蒸法，化合物在氣相狀態(tài)下則能自由附著在生物體上［910］。丁香酚（C₁₀H₁₂O₂）主要存在于丁香油、豆蔻油和樟腦油中，可從丁香、香樟等植物中提取，具有廣泛的生物活性［11］。Meyer等利用浸蟲(chóng)法測(cè)得丁香油對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的EC50為0.097% （V/V），5.0%丁香油揮發(fā)物使線蟲(chóng)卵孵化率降低30%，且孵化出的J2存活率為0［12］。本研究通過(guò)比較水瓊脂平板熏蒸法、土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法測(cè)定丁香酚抑殺根結(jié)線蟲(chóng)的效果，旨在篩選出適用于揮發(fā)性化合物的生物測(cè)定方法。

1材料與方法

1.1供試材料

供試線蟲(chóng)為南方根結(jié)線蟲(chóng) Meloidogyne incognita，采自海南省樂(lè)東縣尖峰嶺國(guó)家森林公園（18°23′N(xiāo)，108°46′E），由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院植物線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，并在番茄上于28℃溫室中通過(guò)單卵塊擴(kuò)繁;供試番茄為感病品種 ‘新中蔬’，青縣興運(yùn)種業(yè)有限公司生產(chǎn)。

供試藥劑：98.5%丁香酚原液，上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1丁香酚水瓊脂平板熏蒸處理

將塑料培養(yǎng)皿（d=6 cm）作為密閉的熏蒸容器，在皿蓋中央用雙面膠固定一片邊長(zhǎng)約1.5 cm的濾紙，皿中倒入1 mL 1.5%滅菌水瓊脂，待凝固成厚約2 mm的透明凝膠后，每皿分別加入200 μL根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)懸液（約100條幼蟲(chóng)）或單卵懸液（約100粒卵），用移液器將丁香酚原液加到培養(yǎng)皿皿蓋的濾紙片上，設(shè)置1.25、2.5、5、10、20 μL（相當(dāng)于各皿丁香酚濃度分別為50、100、200、400、800 μL/L） 5個(gè)處理，迅速將含藥皿蓋蓋住培養(yǎng)皿，并用封口膜密封（圖1a）;每處理設(shè)3次重復(fù)，以無(wú)菌水作為對(duì)照;于28℃培養(yǎng)箱孵育24 h（J2）或9 d（卵）后，于體視顯微鏡（徠卡S8APO）下鏡檢J2存活情況和卵的孵化情況。用細(xì)鋼針（或睫毛針）反復(fù)觸碰J2判斷其死活，若線蟲(chóng)緩慢扭動(dòng)即為存活，僵直不動(dòng)視為死亡。分別計(jì)算線蟲(chóng)死亡率、校正死亡率、卵孵化率以及孵化相對(duì)抑制率。

死亡率=線蟲(chóng)死亡數(shù)/線蟲(chóng)總數(shù)×100%;

校正死亡率=（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100%;

卵孵化率=幼蟲(chóng)數(shù)/供試卵數(shù)×100%;

孵化相對(duì)抑制率=（對(duì)照組孵化率-處理組孵化率）/對(duì)照組孵化率×100%。

1.2.2丁香酚土壤熏蒸處理

將過(guò)10目篩的土壤與育苗基質(zhì)（品氏托普?qǐng)@藝上海有限公司）按10∶1混合并滅菌后，于50℃烘箱中干燥24 h至恒重。將塑料培養(yǎng)皿（d=6 cm）作為密閉的土壤熏蒸容器，無(wú)菌土填滿培養(yǎng)皿，每皿分別加入2齡幼蟲(chóng)懸液（約500條幼蟲(chóng)）或單卵懸液（約500粒卵），使土壤含水量為15%～20%;將丁香酚直接滴加到土壤中，丁香酚濃度和密封方法同1.2.1，每處理設(shè)3次重復(fù)，以無(wú)菌水作為對(duì)照（圖1b）;于28℃培養(yǎng)箱中孵育24 h（J2）或9 d（卵）后取出，利用卡勃過(guò)篩分離法（Cobbs’s sieving）收集2齡幼蟲(chóng)及未孵化的卵［13］，鏡檢方法及統(tǒng)計(jì)方法同1.2.1。

1.2.3丁香酚浸蟲(chóng)處理

丁香酚原液用無(wú)水乙醇溶解，再用0.3%吐溫20的水溶液稀釋?zhuān)渲瞥上盗刑荻热芤?，濃度依次?00、200、400、800、1 600 μL/L（即最終測(cè)試濃度的2倍），依次吸取丁香酚溶液1 mL與等體積的2齡幼蟲(chóng)懸液（約100條幼蟲(chóng)）或單卵懸液（約100粒卵）于塑料培養(yǎng)皿（d=6 cm）內(nèi)混勻（圖1c）立即加蓋皿蓋并密封;同時(shí)設(shè)置不含丁香酚的溶劑對(duì)照［6，14］。每處理3次重復(fù)，并設(shè)滅菌水為空白對(duì)照。于28℃培養(yǎng)箱中孵育24 h（J2）或9 d（卵）后取出，開(kāi)蓋暴露3 min后鏡檢、統(tǒng)計(jì)方法同1.2.1。并以浸蟲(chóng)法的LC50為基準(zhǔn)，計(jì)算相對(duì)毒力倍數(shù)［15］。

1.3數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26軟件及Microsoft Excel 2021軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，求出毒力回歸方程、LC50、95%置信區(qū)間等，并利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析［16］。

2結(jié)果與分析

2.13種生測(cè)方法測(cè)得的丁香酚對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的致死作用水瓊脂平板熏蒸法、土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法測(cè)定結(jié)果顯示，不同濃度丁香酚處理對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)均有致死作用，致死率均隨著濃度的增加而升高（圖2）。水瓊脂平板熏蒸法測(cè)得的丁香酚致死效果最好，在200 μL/L和400 μL/L濃度下測(cè)得的2齡幼蟲(chóng)死亡率顯著高于其他方法，其中200 μL/L時(shí)的線蟲(chóng)死亡率高達(dá)80.43%，而采用土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法時(shí)死亡率僅分別為61.70%、11.43%，濃度升高至400 μL/L時(shí)土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法測(cè)得的線蟲(chóng)死亡率僅分別為73.90%、75.87%，顯著低于水瓊脂平板熏蒸法測(cè)得的致死率（94.84%）。

2.23種生測(cè)方法測(cè)得的丁香酚對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒力比較水瓊脂平板熏蒸法、土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法測(cè)得的丁香酚對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)毒力存在差異。其中水瓊脂平板熏蒸法測(cè)得的毒力最強(qiáng)，其LC50為123.5 μL/L；土壤熏蒸法次之，LC50為140.2 μL/L；浸蟲(chóng)法最差，LC50為309.7 μL/L。水瓊脂平板熏蒸法、土壤熏蒸法測(cè)得的毒力分別是浸蟲(chóng)法測(cè)得結(jié)果的2.51倍和2.21倍（表1）。

2.33種生測(cè)方法測(cè)得的丁香酚對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化的抑制作用水瓊脂平板熏蒸法、土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法測(cè)定結(jié)果顯示，丁香酚對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化的抑制均隨丁香酚濃度的增加而增強(qiáng)（圖3）。50 μL/L丁香酚處理后9 d，水瓊脂平板熏蒸法的卵孵化抑制率高達(dá)97.10%，而土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法的卵孵化抑制率僅分別為32.79%、11.50%。丁香酚各個(gè)處理濃度下，3種生測(cè)方法對(duì)卵孵化的抑制效果均表現(xiàn)為水瓊脂平板熏蒸法大于土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法，且采用水瓊脂平板熏蒸法時(shí)卵孵化抑制率均顯著高于土壤熏蒸法和浸蟲(chóng)法。

3結(jié)論與討論

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1833.1-2009，殺線蟲(chóng)劑室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)采用“浸蟲(chóng)法”，建議水溶性藥劑直接用水溶解、稀釋?zhuān)渌巹┻x用合適的有機(jī)溶劑（如丙酮、氯仿、乙醇等）溶解，再用含有適量表面活性劑如 0.1%吐溫80（或 0.1% Triton-X100）的水溶液稀釋?zhuān)?］。例如噻唑膦、阿維菌素等藥劑，它們主要通過(guò)與線蟲(chóng)直接接觸發(fā)揮殺蟲(chóng)效果，在測(cè)定此類(lèi)藥劑時(shí)以浸蟲(chóng)法較為適宜［1718］。而對(duì)于具有揮發(fā)性熏蒸作用的藥劑，浸蟲(chóng)法存在一定局限性。

土壤淋浴法、葉面噴霧試驗(yàn)法以及土壤熏蒸盆栽法均需要栽種供試植物，且需要經(jīng)半月至2月不等的時(shí)間后通過(guò)拔苗檢查統(tǒng)計(jì)病苗率［7］，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，無(wú)法滿足藥劑急性毒力的測(cè)定需求。本研究中采用的土壤熏蒸法無(wú)需栽種供試植物，容器中的土壤模擬植物線蟲(chóng)自然生境，可供熏蒸類(lèi)藥劑的揮發(fā)擴(kuò)散，且可在處理后24 h完成急性毒力測(cè)定，但試驗(yàn)結(jié)束后需要利用卡勃過(guò)篩分離法回收線蟲(chóng)，較水瓊脂平板熏蒸法工序繁瑣，且線蟲(chóng)回收率低、不穩(wěn)定，對(duì)試驗(yàn)準(zhǔn)確性存在一定的干擾。

當(dāng)前揮發(fā)性精油等化合物室內(nèi)生測(cè)多采用浸蟲(chóng)法［9，1920］，由于精油的非水溶性， 供試藥劑溶液配制需添加助劑，因而需設(shè)置助劑對(duì)照組， 使生物測(cè)定試驗(yàn)變得較繁瑣。同時(shí)，丁香酚溶于水后對(duì)線蟲(chóng)活性下降，推測(cè)是因?yàn)槎∠惴釉谒腥芙舛冗m中、揮發(fā)性低［21］。因?yàn)楹辛u基的化合物可能在一定程度上被溶解，從而更多地留在水相中，導(dǎo)致活性降低［22］。

殺線劑的生測(cè)方法多種多樣，任何一種方法都難以滿足試驗(yàn)者的所有需求，如只測(cè)定化合物對(duì)線蟲(chóng)的觸殺作用，則其熏蒸作用難以反映;若以土壤淋浴法進(jìn)行活體測(cè)定，則不能反映葉面噴霧法藥劑對(duì)線蟲(chóng)的活性。因此在生測(cè)方法的選擇上應(yīng)根據(jù)化合物的類(lèi)型和已知同類(lèi)殺線劑的作用機(jī)理來(lái)進(jìn)行［17］。

本研究利用水瓊脂平板熏蒸法測(cè)定具揮發(fā)性熏蒸作用的藥劑，將供試藥劑和線蟲(chóng)置于密閉的容器內(nèi)，讓藥劑產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體與線蟲(chóng)蟲(chóng)體直接接觸，供試藥劑無(wú)需添加有機(jī)溶劑和表面活性劑，可準(zhǔn)確反映所測(cè)藥劑的熏蒸毒力，且透明瓊脂載體可直接于體視顯微鏡下觀察判定線蟲(chóng)存活狀態(tài)，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯：田喆）