摘要為鑒定最近在貴州省黔西南州興仁市烤煙育苗大棚里陸續(xù)發(fā)現(xiàn)為害煙苗的未知象甲，通過(guò)查詢文獻(xiàn)并測(cè)定該害蟲(chóng)的COⅠ基因片段序列進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，該未知象甲鑒定為蔬菜葉象甲Listroderes difficilis Germain，國(guó)內(nèi)首次報(bào)道為害煙草。描述了蔬菜葉象甲的形態(tài)特征、寄主植物與分布、習(xí)性與為害特點(diǎn)及防控措施等，對(duì)該蟲(chóng)害的識(shí)別與科學(xué)防控具有重要的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞蔬菜葉象甲;煙草;分子鑒定

中圖分類號(hào)：S 435.72文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023508First report on damage caused by Listroderes difficilis to seedlings

tobacco in ChinaLI Wenhong SUN Zhirong LI Jinmeng YANG XIN HE Yueping YANG Can MU Qing GAO Gui（1. Institute of Plant Protection， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyangn1MkXsjcXUzgiBCSjfOWsw==550006， China;

2. Qianxinan Tobacco Branch of Guizhou Tobacco Company， Xingyi562400， China; 3. College of Agriculture，

Yangtze University， Jingzhou434025， China; 4. College of Plant Science & Technology， Huazhong

Agricultural University， Wuhan430072， China）AbstractRecently， damage symptom was found on seedling tobacco leaves in the greenhouse in Xingren city of Qianxinan of Guizhou province. Our investigation indicated that the damage was caused by an unknown weevil pest， which has not been reported previously. The damaged symptom of tobacco leaves caused by this pest was described. Based on COⅠ fragment sequence， the pest was identified as Listroderes difficilis Germain. Morphology characteristics of L.difficilis， its host plants and distributions， biological characteristics and damage and the control measures were described， which will provide references for recognition and management of L.difficilis.

Key wordsListroderes difficilis;tobacco;molecular identification

烤煙是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植區(qū)域涉及我國(guó)17個(gè)主產(chǎn)煙葉省市區(qū)。2021年，全國(guó)烤煙種植面積88.6萬(wàn)hm2。貴州省是煙草種植面積全國(guó)第二大省份，種植烤煙10.67萬(wàn)hm2。煙草整個(gè)生育期，會(huì)受不同害蟲(chóng)的為害，嚴(yán)重影響著煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量，故害蟲(chóng)的調(diào)查與防治是煙草種植中重要的田間作業(yè)［14］。常見(jiàn)的為害煙草的害蟲(chóng)有斜紋夜蛾Spodoptera litura Fabricius、煙青蟲(chóng)Helicoverpa assulta Guenée、煙蚜Myzus persicae Sulzer、煙粉虱Bemisia tabaci （Gennadius）及象甲科Curculionidae害蟲(chóng)等［14］。已有的研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)為害煙草的象甲有7種，包括福泉灰象Sympiezomias sp.［56］、鞍象Neomylloeerus hedini Marshall［56］、棉尖象Phytoscaphus gossypii Chao［7］、大灰象甲Sympiezomias velatus Chevrolat［89］、綠鱗象甲Hypomeces squamosus Fabricius［89］、毛束象Desmidophorus hebes Fabricius［10］、呈貢灰象甲Sympiezomias chenggongensis Chao［11］。

2022年12月至2023年3月，在貴州省黔西南州進(jìn)行害蟲(chóng)調(diào)查時(shí)多次發(fā)現(xiàn)興仁市育苗大棚內(nèi)一未知象甲為害煙草。該未知象甲與上述報(bào)道的7種為害煙草的象甲均存在形態(tài)差異。為此，運(yùn)用分子生物學(xué)方法對(duì)該未知象甲進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其形態(tài)特征、寄主植物與分布、習(xí)性與為害特點(diǎn)及防控措施做了介紹，以期為煙草生產(chǎn)上對(duì)該害蟲(chóng)的防控提供參考。

1材料與方法

1.1樣品采集

2023年4月，采集貴州省黔西南州興仁市雨樟鎮(zhèn)冬瓜寨烤煙育苗大棚里（25°21′N，105°06′E）被象甲為害的煙草葉片及15頭象甲高齡幼蟲(chóng)樣品。將受害煙葉樣品放入自封袋，象甲樣品放入無(wú)菌試管中，帶回實(shí)驗(yàn)室。煙葉樣品于雙目體視顯微鏡（江南永新JSZ6）下進(jìn)行癥狀觀察，象甲樣品保存在-80℃冰箱以供形態(tài)學(xué)觀察和DNA提取。

1.2分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法提取象甲樣品DNA。使用COⅠ基因通用引物L(fēng)CO1490：5′-GGTCAACAAATCATA-AAGATATTGG-3′，HCO2198：5′-TAAACTTCA-GGGTGACCAAAAAATCA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增采用50 μL體系，包含Top Taq DNA polymerase（北京全式金生物公司）1 μL、正反向引物各1 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、DNA模板2 μL、10×Top Taq Buffer 5 μL、 ddH2O 36 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將凝膠中目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，送至昆泰銳（武漢）生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的序列在GenBank（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3象甲形態(tài)特征與生物學(xué)習(xí)性

在明確象甲種類后，通過(guò)顯微鏡觀察和文獻(xiàn)查閱，對(duì)該害蟲(chóng)的形態(tài)特征、寄主植物與分布、習(xí)性與為害特點(diǎn)及防控措施進(jìn)行描述。

2結(jié)果與分析

2.1象甲的為害習(xí)性及特征

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，象甲主要為害苗期煙草葉片（圖1），造成葉片缺刻。該害蟲(chóng)主要以幼蟲(chóng)取食為害煙葉，取食主要發(fā)生在夜晚。葉片受害初期，可見(jiàn)葉肉被取食痕跡。害蟲(chóng)喜取食幼嫩葉肉和幼嫩支脈，很少取食煙葉主脈;嚴(yán)重時(shí)底部葉片被取食僅剩主脈。同時(shí)，幼蟲(chóng)具有很強(qiáng)的假死性，受驚后會(huì)將軀體彎曲為“C”字形或直接從煙葉上掉落。

2.2分子生物學(xué)鑒定

鑒定結(jié)果表明，未知象甲COⅠ序列片段長(zhǎng)度為651 bp （圖2），與NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)其序列與GenBank中蔬菜葉象甲Listroderes difficilis （英文名vegetable leaf weevil）的COⅠ序列（MK890912.1）相似性高達(dá)99%，僅2個(gè)堿基不同（圖3）。因此，所鑒定的未知象甲種類為蔬菜葉象甲Listroderes difficilis。

2.3蔬菜葉象甲的形態(tài)特征與生物學(xué)習(xí)性

分類地位研究發(fā)現(xiàn)，蔬菜葉象甲隸屬于鞘翅目Coleoptera多食亞目Phytophaga象甲科Curculionidae［12］。Morrone在1993年認(rèn)為蔬菜葉象甲L.difficilis同物異名有：L.costirostris Schoenherr、L.vicinus Hustache、L.hupocrita Hustache、L.lugubris Germain、L.obliquus Klug、L.paranensis Hustache［13］。由于蔬菜葉象甲L.difficilis之前常與其他命名混淆，2002年Morrone進(jìn)行了修訂，確認(rèn)其物種名稱為L(zhǎng)istroderes difficilis Germain［1415］。

通過(guò)形態(tài)觀察和文獻(xiàn)查閱，蔬菜葉象甲成蟲(chóng)：體長(zhǎng)7.2～10.5 mm，體寬3.0～4.0 mm;體扁平，體背及頭部黑褐色，腹面棕色至暗棕色;剛羽化的個(gè)體色較淺，體背具灰白色、淡棕色、棕色、褐色或黑色的鱗片及柔毛組成的花紋，頭小，半球形;喙較短粗，復(fù)眼小，黑色，橢圓形，不突出。卵：呈橢圓球形，長(zhǎng)徑約0.9～1.0 mm，短徑約0.5～0.6 mm;外表光滑發(fā)亮，初產(chǎn)卵乳白色，后變?yōu)榈S白色到淡黃色、黃色最終為淡棕色。幼蟲(chóng)：共有4齡，體乳白色或淡黃白色，無(wú)足;頭顯露，頭殼略圓形;下口式，口器粗短，略呈圓錐形，口器上顎基部上方各有1個(gè)觸角，如乳頭狀;有2對(duì)圓形黑色（剛蛻皮時(shí)為淡褐色）的單眼;體呈紡錘形，常彎曲為“C”形，分節(jié)明顯。蛹：離蛹，長(zhǎng)約8.5～9.2 mm，初蛹乳白色，后變?yōu)樽厣敝梁稚?頭、胸部有稀疏的細(xì)刺毛，腹部1～8節(jié)背板后緣各有一列褐色端部為暗褐色細(xì)刺毛，末節(jié)背板兩側(cè)各有1枚暗褐色且較粗的長(zhǎng)刺毛［1617］。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蔬菜葉象甲屬多食性害蟲(chóng)，寄主植物包括十字花科、茄科、傘形科、菊科、莧科、石竹科、豆科、百合科（表1）［13，1819］。其最喜歡十字花科蔬菜，該害蟲(chóng)大發(fā)生時(shí)，蟲(chóng)口密度超過(guò)歷年為害嚴(yán)重的菜青蟲(chóng)Pieris rapae和小菜蛾P(guān)lutella xylostella，平均每株達(dá)3.78頭［1617］。

在地理分布上，蔬菜葉象甲于1905年首次在維多利亞被發(fā)現(xiàn)，其起源于南美洲，后經(jīng)人和車輛的運(yùn)輸意外擴(kuò)散到其他國(guó)家［2022］（表2）。在我國(guó)（除臺(tái)灣外），1992年2月在貴州省貴陽(yáng)花溪地區(qū)白菜、青菜、蘿卜、油菜等十字花科作物上首次發(fā)現(xiàn)蔬菜葉象甲幼蟲(chóng)為害［1617］。

蔬菜葉象甲在貴陽(yáng)地區(qū)1年發(fā)生1代，以成蟲(chóng)滯育越夏，屬于長(zhǎng)日照滯育型害蟲(chóng)，成蟲(chóng)發(fā)生期一般為3月中旬到5月上旬，成蟲(chóng)羽化后即會(huì)大量取食，5月下旬則進(jìn)入越夏狀態(tài)，之后持續(xù)到12月依舊有活躍的成蟲(chóng)出現(xiàn);成蟲(chóng)產(chǎn)卵期較長(zhǎng)，可從9月一直延續(xù)到次年2月;幼蟲(chóng)發(fā)生期在10月上旬至次年5月上旬，為害期有2個(gè)階段，分別是11月-12月及次年2月-3月;蛹最早出現(xiàn)在1月上旬，3月下旬至4月上旬為化蛹盛期［15］。低齡幼蟲(chóng)一般3～5頭聚集在心葉處為害，具有集中取食和背光的習(xí)性，老熟幼蟲(chóng)則喜食嫩葉柄;幼蟲(chóng)在煙草上選好為害和棲息位置后很少活動(dòng)。初孵幼蟲(chóng)取食致煙葉呈透明的斑狀，到2齡及以后取食煙葉呈孔洞或缺刻，對(duì)葉片、葉柄、心葉、花蕾，老、嫩葉片均可取食［16］。

2.4防治方法

田間防控過(guò)程中可根據(jù)蔬菜葉象甲發(fā)生為害時(shí)期和程度，綜合農(nóng)業(yè)措施、生物源農(nóng)藥或高效低風(fēng)險(xiǎn)化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行綜合防控；例如采用良種壯苗，加強(qiáng)田間管理，通過(guò)精耕細(xì)作機(jī)械殺傷蔬菜葉象甲，破壞其生存環(huán)境，影響其個(gè)體發(fā)育，推遲出土?xí)r間，降低蟲(chóng)口密度［23］。針對(duì)蔬菜葉象甲幼蟲(chóng)的防控，可采用蘇云金芽胞桿菌進(jìn)行葉面噴霧處理。若害蟲(chóng)發(fā)生為害嚴(yán)重，可交替和輪換使用高效氯氟氰菊酯和溴氰蟲(chóng)酰胺等化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治［22］。

3結(jié)論與討論

本文簡(jiǎn)要描述了一種象甲對(duì)煙苗的為害特征，并基于害蟲(chóng)的COⅠ基因片段序列分析，鑒定其為蔬菜葉象甲。這是該害蟲(chóng)在我國(guó)取食為害煙草的首次報(bào)道。盡管蔬菜葉象甲目前并非煙草的主要害蟲(chóng)，國(guó)內(nèi)僅有該害蟲(chóng)為害十字花科作物的報(bào)道，為寡食性害蟲(chóng)［1618］。但是，國(guó)外已發(fā)現(xiàn)蔬菜葉象甲還可為害傘形科芹菜、胡蘿卜以及十字花科的獨(dú)行菜Lepidium apetalum和茄科的煙草［2324］。此次發(fā)現(xiàn)蔬菜葉象甲幼蟲(chóng)近兩年取食育苗棚中的煙苗，且呈頻發(fā)趨勢(shì)，需要引起煙葉生產(chǎn)者的重視。由于蔬菜葉象甲蟲(chóng)源不明，建議加強(qiáng)對(duì)煙草煙苗基質(zhì)、育苗棚的檢測(cè)和管理，持續(xù)關(guān)注該蟲(chóng)在煙苗、田間煙株及其他寄主植物上的發(fā)生與為害規(guī)律，特別是其最喜食的寄主如十字花科作物。本文描述了蔬菜葉象甲的形態(tài)特征、寄主植物與分布，簡(jiǎn)要介紹了其習(xí)性與為害特點(diǎn)及防控措施等，以期對(duì)蔬菜葉象甲的識(shí)別與防控提供一定的參考。然而，由于采集蟲(chóng)體樣品后，未在實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，也未及時(shí)到田間采集其他不同階段及不同蟲(chóng)態(tài)如卵、蛹、成蟲(chóng)等進(jìn)行細(xì)致觀察，在煙草上的發(fā)生規(guī)律不夠詳盡，這些均有待進(jìn)一步的研究和完善。

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（責(zé)任編輯：田喆）